Atualmente, um dos grandes problemas relacionados à leishmaniose é a falta de um diagnóstico específico capaz de indentificar e diferenciar espécies de Leishmania com rapidez e precisão. O desenvolvimento de métodos moleculares como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), possibilita que o diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC) possa se tornar mais preciso e, eventualmente, de fácil execução, uma vez que limitações importantes relacionadas à sensibilidade e especificidade desta técnica ainda são descritas, principalmente quando se utiliza amostras clínicas. Com o intuito de melhor avaliar a eficiência da PCR para o diagnóstico da LVC, foram selecionadas diferentes amostras clínicas (baço, aspirado de linfonodo, pele sem lesão, pele com lesão e amostras de sangue) de 26 cães com sorologia positiva para leishmaniose submetidos à eutanásia pelo Serviço de Vigilância Epidemiológica do município de Embu das Artes - SP. Realizamos uma análise comparativa entre a PCR-RFLP kDNA-HaeIII e PCR-RFLP hsp70-BsaJI/EcoRII com dois métodos diagnósticos tradicionais (parasitológico direto, e cultura in vitro). Amostras clínicas de 28 cães com sorologia negativa para LVC da mesma região foram utilizadas como controle negativo das reações. Notamos que a PCR aprensentou maior sensibilidade em todas as amostras clínicas testadas quando comparadas aos métodos tradicionais. Os resultados apontam que a PCR-RFLP kDNA-HaeIII é a mais eficiente para o diagnóstico da LVC, com um índice de 96,15% de positividade nas amostras de pele com lesão. Quanto à discriminação da espécie de Leishmania envolvida na infecção, nossos resultados de PCR-RFLP kDNA-HaeIII indicam Leishmania chagasi-infantum como o agente etiológico envolvido na infecção e transmissão canina na cidade de Embu das Artes. Por outro lado, a análise da PCR em Tempo Real (qPCR), mostrou que algumas amostras de sangue não apresentavam o padrão associado à Leishmania chagasi-infantum, podendo indicar uma co-infecção com outras parasitoses caninas. Nosso grupo também acompanhou 184 crianças de 4 a 10 anos de idade (população de risco) residentes da mesma região de transmissão autóctone da doença canina, como também foi realizado um levantamento das espécies de flebotomíneos da região (pela SUCEN). Até o momento, não foi encontrado nenhum caso da doença humana, nem a principal espécie transmissora do parasito (Lutzomiya longipalpis). Acreditamos que esses resultados possam contribuir significativamente para aprimorar o diagnóstico e a identificação das espécies Leishmania na LVC. / Currently, one of the major problems related to leishmaniasis is the lack of a specific diagnosis capable of identifying and differentiating Leishmania species quickly and accurately. The development of molecular methods such as Polymerase Chain Reaction ( PCR ) allows the diagnosis of Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) to become more accurate and eventually, easy to perform, since that important limitations in terms of sensitivity and specificity of this technique are being described especially when using clinical samples. In order to better evaluate the efficiency of PCR for the diagnosis of CVL, we selected different clinical samples (spleen, lymph node aspirate, skin with and without lesions and blood samples) from 26 dogs with positive serology for leishmaniasis submitted to euthanasia by the Agency of Epidemiological Surveillance of Embu das Artes - SP. Therefore, we performed a comparative analysis between the kDNAPCR-RFLP HaeIII and hsp70PCR-RFLP BsaJI/EcoRII with two traditional diagnostic methods (direct parasitological test, and in vitro culture). Additionally, clinical samples from 28 dogs with negative serology for CVL in the same region were used as negative reactions control. We noted that the PCR showed greater sensitivity in all clinical samples tested when compared with traditional methods. The results indicate that the kDNAPCR-RFLP HaeIII is the most efficient test for the diagnosis of CVL, with a positivity index of 96.15 % in skin lesions samples. Related to the discrimination of the Leishmania species involved in the infection, our results of kDNAPCR-RFLP HaeIII indicate Leishmania infantum chagasi as the agent involved in canine infection in Embu das Artes city. Moreover, the analysis of real-time PCR (qPCR) showed that some blood samples has not showed the same pattern associated with Leishmania infantum chagasi suggesting a possible co-infection with other canine parasite. Our group also followed 184 children between 4 to 10 years old (risk population) living in the same region of autochthonous transmission of canine disease, as well a survey was conducted on the sandfly species in the region (by SUCEN). So far, we found no human infection, nor the main species involved in the transmission of the parasite (Lutzomyia longipalpis). We believe that these results can significantly contribute to the improvement of the diagnosis and identification of Leishmania species involved in the CVL worldwide.

O diagnóstico etiológico da hanseníase, causada pelo bacilo Mycobacterium leprae, pode ser difícil na forma paucibacilar (PB), na qual os exames têm baixa sensibilidade na detecção do bacilo. A reação em cadeia da polimerase (PCR) tem se mostrado sensível para o diagnóstico da hanseníase. Amostras de linfa são rapidamente obtidas em campo e pouco invasivas. O objetivo principal deste trabalho foi comparar os resultados da PCR com 4 pares de primers (Ag85B, MntH, Pra-36kDa e RLEP), descritos na literatura para o diagnóstico da hanseníase, utilizando-se DNA extraído de amostras de linfa de orelhas, cotovelos e joelhos, coletadas em papel filtro. Além da comparação dos resultados da PCR com os 4 pares de primers, também foram comparados à baciloscopia de linfa no grupo MB e ao ELISA anti-PGL-1 nos grupos PB e MB, utilizando-se o teste de qui-quadrado de McNemar para amostras pareadas. Trinta e nove pacientes com hanseníase [12 (30,76%) na forma PB e 27 (69,23%), multibacilar (MB)], virgens de tratamento, atendidos consecutivamente no período de 2006 a 2010, foram incluídos. A detecção de bacilos à baciloscopia e na biópsia de pele foi confirmada em 55,55% e em 100% dos pacientes MB, respectivamente; e 67,56% dos pacientes (33,33% dos PB e 84% dos MB) apresentaram títulos de anti-PGL1 acima do cut-off no ELISA. A PCR foi positiva em 70,37% das 27 amostras de pacientes MB, considerando-se o resultado conjunto dos 4 primers (7,69% com Ag85B; 11,11% com MntH; 12,5% com Pra-36kDa; e 66,66% com RLEP). Uma amostra se mostrou positiva com os primers Ag85B, MntH e Pra-36kDa e negativa com RLEP. Não houve amplificação no grupo PB, portanto, os resultados do ELISA anti-PGL-1, embora não confirmatórios da etiologia, foram superiores para o diagnóstico da hanseníase PB. No grupo MB, os resultados da PCR com RLEP foram superiores àqueles com MntH, Ag85B e Pra- 36kDa (P<0,001); comparando-se MntH com Ag85B e Pra-36kDa (P=0,317; P=1,0, respectivamente), e Ag85B com Pra-36kDa (P=0,564), os resultados foramsemelhantes. A frequência de positividade da baciloscopia foi maior que a da PCR com MntH (P=0,001), Ag85B (P<0,001) e Pra-36kDa (P=0,004); semelhante ao RLEP (P=0,083); e menor, quando comparada ao resultado combinado dos 4 primers (P=0,046). Ainda no grupo MB, a frequência de positividade anti-PGL-1 foi superior à da PCR com MntH, Ag85B e Pra-36kDa (P<0,001) e à baciloscopia (P=0,011); porém, foi semelhante à PCR com RLEP (P=0,059) ou com os 4 primers combinados (P=0,102). A maior frequência de positividade da PCR com primers RLEP é explicada pela presença de múltiplas cópias RLEP no genoma do bacilo, aumentando a chance do anelamento e amplificação. Existe complementariedade entre os resultados com diferente primers, podendo uma mesma amostra apresentar diferentes resultados a depender da escolha destes. A frequência da positividade da PCR com par de primers RLEP, em amostras de linfa coletadas em papel filtro, mostrou-se semelhante à da baciloscopia e do ELISA anti-PGL-1 nos pacientes MB. Assim, encoraja-se seu emprego em trabalhos de campo devido à facilidade da coleta e possibilidade de remessa dos papéis filtro para centros de referência. / Leprosy\'s etiologic diagnosis may be difficult in paucibacillary (PB) patients, in which laboratory tests have low sensitivity for the detection of the causative agent, Mycobaterium leprae. Polymerase chain reaction (PCR) has shown good sensitivity in leprosy diagnosis. Lymph samples are readily acquired in the field and minimally invasive. The main objective of this paper is to compare the results of PCR with four sets of primers previously described in the literature (Ag85B, MntH, Pra-36kDa and RLEP), using DNA extracted from lymph samples from ear lobes, elbows and knees, stored in filter paper. We also aim to compare the PCR results to lymph bacilloscopy in the multibacillary (MB) group and to anti-PGL-1 serology in PB and MB group, using McNemar\'s chi-square test for paired samples. 39 treatment-naïve leprosy patients [12 (30.76%) PB and 27 (69.23%) MB] seen in the outpatient clinic of a referral center were included. Bacilli were detected in 55.55% of bacilloscopy samples and 100% of biopsies from MB patients; 67.56% of all patients (33.33% of PB and 84% of MB) had anti-PGL1 titers above the method\'s cut-off. PCR was positive in 70.37% of the 27 MB patients, taking in consideration the 4 primers combined (7,69% with Ag85B; 11,11% with MntH; 12,5% with Pra-36kDa; e 66,66% with RLEP). One sample was positive for primers Ag85B, MntH e Pra-36kDa and negative for RLEP. There was no DNA amplification in the PB group, in which antiPGL-1 ELISA, although not confirmatory of the disease, was superior in the diagnosis. In the MB group, PCR with RLEP primer was superior to Ag85B, MntH and Pra-36kDa (P<0,001); between MntH and Ag85B (P=0,317); MntH and Pra- 36kDa (P=1,0); and Ag85B and Pra-36kDa (P=0,564), results were similar. Bacilloscopy\'s frequency of positivity was greater than PCR with Ag85B (P<0,001), MntH (P=0,001) and Pra-36kDa (P=0,004); similar to RLEP (P=0,083); and inferior to the results of the four primers combined (P=0,046). Still in the MB group, anti-PGL-1 serology was superior to PCR with Ag85B, MntH and Pra-36kDa (P<0,001) and to bacilloscopy (P=0,011); its results were similar to PCR with RLEP (P=0,059) or with the four primers combined (P=0,102). RLEP\'s greater positivity is probably due to thepresence of multiple copies of the target DNA in the bacillus\' genome, enhancing the chances of primer annealing. The primers showed complementarity; therefore one sample may display different outcomes depending on primer choice. The frequency of positivity of PCR with RLEP primers, in lymph samples stored in filter paper, was similar to bacilloscopy and serology amongst MB patients. Hence, we encourage its use in fieldwork as a practical and easy method for acquiring samples that can be shipped for further processing in referral centers.

Vias redox são importantes reguladores da homeostase e sinalização celular, mas o entendimento dos mecanismos desses processos é incompleto. Tiol-proteínas como a dissulfeto isomerase proteica (PDI) podem ser moduladores dessas vias. A PDI(PDIA1) é o protótipo da família das PDIs, cuja função canônica é o enovelamento redox de proteínas no retículo endoplasmático. Além disso, PDI exerce regulação de NADPH oxidases, as principais fontes de oxidantes celulares, e é necessária para ativação de RhoGTPases, organização do citoesqueleto e migração de células vasculares. No estudo de mecanismos pelos quais a PDI regula RhoGTPases, mostramos, em redes computacionais e em experimentos de co-imunoprecitação, associação entre PDIA1 e o regulador de RhoGTPases RhoGDIalfa. Além disso, identificamos forte proximidade entre os genes codificando estas proteínas. Neste estudo, caracterizamos o perfil e implicações desta sintenia gênica.A análise bioinformática pelos programs Ensembl, NCBI e UCSC evidencia um padrão de sintenia entre diferentes isoformas destas duas famílias: PDIA1 (P4HB), PDIA2 (PDIP) e PDIA8 (Erp27) são vizinhos, respectivamente, a RhoGDIbeta, RhoGDIy e RHOGDIalfa, com correspondentes regiões intergênicas de 7.1, 2.9 e 0.14 kb em distintos cromossomos em H. sapiens. O padrão dessa sintenia foi fortemente conservado emC. elegans, alguns peixes e uniformemente em anfíbios, répteis, aves e mamíferos. Leveduras expressam no mesmo cromossomo , porém em locais distantes (i.emacrossintenia) ortólogos da PDIA1 e RhoGDI?, mas não expressam outras PDIs e RhoGDIssintênicasnos eucariotos complexos. No entanto, sintenia entre PDI e RhoGDI foi também observada na planta A. thaliana, sem evidência de um ancestral comum. Os pares sintênicos associam-se a blocos vizinhos conservados, porém diversos para cada par, enquanto cada bloco contem um gene codificando um distinto regulador da PP1 (fosfatase proteica-1). Análise filogenética mostrou topologia semelhante entre as duas famílias.Análise dos dados do estudo ENCODE e predição pelo Softberry identificou sítios de ligação a fatores de transcrição comuns entre os distintos pares, cuja ontologia indicou principalmente desenvolvimento, processos metabólicos e resposta imune. O estudo de possíveis implicações funcionais dessa sintenia mostrou que manipulações da expressão proteica de PDIA1 não promovem mudança consistente na expressão proteica de RhoGDIalfa, tanto in vitro (silenciamento da PDI por siRNA e superexpressão por vetor lentiviral induzível) como in vivo (camundongo transgênico com superexpressão constitutiva da PDIA1). No entanto, as mudanças da expressãogênica de ambos os genes na camada íntima de artérias carótidas de camundongo durante remodelamento induzido por fluxo foram fortemente correlacionadas. Experimentos de coimunoprecipitação e co-localização à microscopia confocal sugeriram interação física entre PDIA1 e RhoGDIAalfa. Deste modo, estes dados mostram um intrigante padrão de conservação evolutiva da proximidade gênica entre PDIs e RhoGDIs, não usual em eucariotos. Genes sintênicos frequentemente codificam proteínas que tendem a interagir física e/ou funcionalmente. Com efeito, nosso dados sugerem co-regulação e interação física entre PDIA1 e RhoGDIAalfa, corroborando a convergência entre essas proteínas como possível mecanismo envolvido na regulação redox do citoesqueleto pela PDIA1 / Redox pathways are important regulators of homeostasis and cell signaling, but the understanding of the mechanisms of these processes is incomplete. Thiol proteins such as protein disulfide isomerase (PDI) can be modulators of these pathways. PDI (PDIA1) is the prototype of the family of PDIs whose canonical function is a redox protein folding in the endoplasmic reticulum. In addition, PDI exerts regulatory NADPH oxidase, the main sources of cellular oxidant, and is required for activation RhoGTPases, cytoskeletal organization and migration of vascular cells. In the study of mechanisms by which regulates PDI RhoGTPases, we showed in computer networks and co-imunoprecitation experiments association between PDIA1 and the regulator of RhoGTPases, RhoGDI?. In addition, we identified strong proximity of the genes encoding these proteins. In this study, we characterize the profile and implications of this synteny. .A bioinformatic analysis by programs Ensembl, NCBI and UCSC shows a pattern of synteny between different isoforms of these two families: PDIA1 (P4HB), PDIA2 (PDIP) and PDIA8 (Erp27) are neighbors , respectively RhoGDIalfa, and RhoGDIy RHOGDIbeta with corresponding intergenic regions 7.1, 2.9 and 0:14 kb in different chromosomes of H. sapiens. The pattern of this synteny was strongly maintained in C. elegans, some fish and evenly amphibians, reptiles, birds and mammals. Yeasts express on the same chromosome, but in distant places (i.e macrosintenia) orthologs of PDIA1 and RhoGDI?, but do not express other syntenics PDIs and RhoGDIs in complex eukaryotes. However, synteny between PDI and RhoGDI was also observed in the plant A. thaliana, no evidence of a common ancestor. The syntenic pairs are associated with the stored neighboring blocks, but different for each pair, while each block contains a gene encoding a regulator of distinct PP1 (protein phosphatase-1). Phylogenetic analysis showed similar topology between the two famílias. The identified binding sites common transcription factors between different pairs, which mainly indicated ontology development, metabolic and immune response. The study of possible functional implications of synteny showed that manipulations of PDIA1 protein expression do not promote consistent change in protein expression RhoGDI, both in vitro (silencing of PDI by siRNA and overexpression of inducible lentiviral vector) and in vivo (transgenic mice overexpressing constitutive of PDIA1). The study of possible functional implications of synteny showed that manipulations of PDIA1 protein expression do not promote consistent change in protein expression RhoGDIalfa, both in vitro (silencing of PDI by siRNA and overexpression of inducible lentiviral vector) and in vivo (transgenic mice overexpressing constitutive of PDIA1). However, changes of gene expression of both genes in the intima of mouse carotid arteries during remodeling induced by flow were strongly correlated. Immunoprecipitation experiments and co-location to confocal microscopy suggested physical interaction between PDIA1 and RhoGDIAalfa. Thus, these data show an intriguing pattern of evolutionary conservation of gene proximity between POIs and RhoGDIs not common in eukaryotes. sintênicos genes often encode proteins that tend to interact physically and / or functionally. Indeed, our data suggest co-regulation and physical interaction between PDIA1 and RhoGDIAalfa, supporting the convergence of these proteins as a possible mechanism involved in redox regulation of cytoskeleton by PDIA1

Estudos relacionados à malária autóctone em regiões de baixa transmissão no Brasil ganham cada vez mais relevância científica e epidemiológica, pois revelam a manutenção desse cenário em regiões de Mata Atlântica remanescente. No sudeste do Estado de São Paulo, a ocorrência de surtos no município de Juquitiba tem sido foco de pesquisas sobre a prevalência de Plasmodium na população, com registros de casos assintomáticos. Relatos de ocorrência da doença ou da presença de anticorpos antiplasmodiais em gestantes nessa região não haviam sido descritos anteriormente. Embora infecções por P. falciparum em gestantes tenham sido amplamente abordadas na literatura, a interação entre P. vivax e P. malariae com esta coorte imunodeprimida foi pouco explorada até o momento. Nesse estudo nós monitoramos trimestralmente a circulação de Plasmodium em gestantes atendidas em cinco Unidades de Saúde de Juquitiba. Para isso foi empregado o diagnóstico por gota espessa e metodologias moleculares sensíveis para detecção do parasito, além de ensaios imunológicos para avaliação de parâmetros imunes humorais. Desse modo, foram detectadas infecções por P. vivax e P. malariae em gestantes, incluindo casos assintomáticos. A alta prevalência de anticorpos IgG nesta população mostrou importante exposição das gestantes ao Plasmodium. Em regiões com perfil semelhante ao apresentado neste estudo, o diagnóstico de malária poderia ser indicado no seguimento pré-natal / Studies related to autochthonous malaria in low transmission areas in Brazil have acquired scientific and epidemiological relevance, since they suggest continued transmission in remaining Atlantic Forest regions. In the Southeast of São Paulo State, outbreaks in the municipality of Juquitiba has been focus of studies on the prevalence of Plasmodium in the population, with reports of asymptomatic cases. Data on the occurrence of the disease or presence of antiplasmodial antibodies in pregnant women in this region were not described previously. Although P. falciparum infections in pregnant women have been widely addressed in the literature, the interaction of P. vivax and P. malariae with this immunocompromised cohort were poorly explored to date. In this study, we monitored quarterly the circulation of Plasmodium in pregnant women in five health facilities in Juquitiba. For this purpose, we performed diagnosis by thick blood film and sensitive molecular protocols for parasite DNA detection, as well immunological assays in order to evaluate humoral immune parameters. Through these tools, it was possible to detect infections due to P. vivax and P. malariae in pregnant women, including asymptomatic cases. The high prevalence of IgG antibodies showed a significant exposure of this population to Plasmodium. In regions with a similar profile presented in this study, the diagnosis of malaria might be indicated in prenatal care

Atualmente, um dos grandes problemas relacionados à leishmaniose é a falta de um diagnóstico específico capaz de indentificar e diferenciar espécies de Leishmania com rapidez e precisão. O desenvolvimento de métodos moleculares como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), possibilita que o diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC) possa se tornar mais preciso e, eventualmente, de fácil execução, uma vez que limitações importantes relacionadas à sensibilidade e especificidade desta técnica ainda são descritas, principalmente quando se utiliza amostras clínicas. Com o intuito de melhor avaliar a eficiência da PCR para o diagnóstico da LVC, foram selecionadas diferentes amostras clínicas (baço, aspirado de linfonodo, pele sem lesão, pele com lesão e amostras de sangue) de 26 cães com sorologia positiva para leishmaniose submetidos à eutanásia pelo Serviço de Vigilância Epidemiológica do município de Embu das Artes - SP. Realizamos uma análise comparativa entre a PCR-RFLP kDNA-HaeIII e PCR-RFLP hsp70-BsaJI/EcoRII com dois métodos diagnósticos tradicionais (parasitológico direto, e cultura in vitro). Amostras clínicas de 28 cães com sorologia negativa para LVC da mesma região foram utilizadas como controle negativo das reações. Notamos que a PCR aprensentou maior sensibilidade em todas as amostras clínicas testadas quando comparadas aos métodos tradicionais. Os resultados apontam que a PCR-RFLP kDNA-HaeIII é a mais eficiente para o diagnóstico da LVC, com um índice de 96,15% de positividade nas amostras de pele com lesão. Quanto à discriminação da espécie de Leishmania envolvida na infecção, nossos resultados de PCR-RFLP kDNA-HaeIII indicam Leishmania chagasi-infantum como o agente etiológico envolvido na infecção e transmissão canina na cidade de Embu das Artes. Por outro lado, a análise da PCR em Tempo Real (qPCR), mostrou que algumas amostras de sangue não apresentavam o padrão associado à Leishmania chagasi-infantum, podendo indicar uma co-infecção com outras parasitoses caninas. Nosso grupo também acompanhou 184 crianças de 4 a 10 anos de idade (população de risco) residentes da mesma região de transmissão autóctone da doença canina, como também foi realizado um levantamento das espécies de flebotomíneos da região (pela SUCEN). Até o momento, não foi encontrado nenhum caso da doença humana, nem a principal espécie transmissora do parasito (Lutzomiya longipalpis). Acreditamos que esses resultados possam contribuir significativamente para aprimorar o diagnóstico e a identificação das espécies Leishmania na LVC. / Currently, one of the major problems related to leishmaniasis is the lack of a specific diagnosis capable of identifying and differentiating Leishmania species quickly and accurately. The development of molecular methods such as Polymerase Chain Reaction ( PCR ) allows the diagnosis of Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) to become more accurate and eventually, easy to perform, since that important limitations in terms of sensitivity and specificity of this technique are being described especially when using clinical samples. In order to better evaluate the efficiency of PCR for the diagnosis of CVL, we selected different clinical samples (spleen, lymph node aspirate, skin with and without lesions and blood samples) from 26 dogs with positive serology for leishmaniasis submitted to euthanasia by the Agency of Epidemiological Surveillance of Embu das Artes - SP. Therefore, we performed a comparative analysis between the kDNAPCR-RFLP HaeIII and hsp70PCR-RFLP BsaJI/EcoRII with two traditional diagnostic methods (direct parasitological test, and in vitro culture). Additionally, clinical samples from 28 dogs with negative serology for CVL in the same region were used as negative reactions control. We noted that the PCR showed greater sensitivity in all clinical samples tested when compared with traditional methods. The results indicate that the kDNAPCR-RFLP HaeIII is the most efficient test for the diagnosis of CVL, with a positivity index of 96.15 % in skin lesions samples. Related to the discrimination of the Leishmania species involved in the infection, our results of kDNAPCR-RFLP HaeIII indicate Leishmania infantum chagasi as the agent involved in canine infection in Embu das Artes city. Moreover, the analysis of real-time PCR (qPCR) showed that some blood samples has not showed the same pattern associated with Leishmania infantum chagasi suggesting a possible co-infection with other canine parasite. Our group also followed 184 children between 4 to 10 years old (risk population) living in the same region of autochthonous transmission of canine disease, as well a survey was conducted on the sandfly species in the region (by SUCEN). So far, we found no human infection, nor the main species involved in the transmission of the parasite (Lutzomyia longipalpis). We believe that these results can significantly contribute to the improvement of the diagnosis and identification of Leishmania species involved in the CVL worldwide.

O diagnóstico etiológico da hanseníase, causada pelo bacilo Mycobacterium leprae, pode ser difícil na forma paucibacilar (PB), na qual os exames têm baixa sensibilidade na detecção do bacilo. A reação em cadeia da polimerase (PCR) tem se mostrado sensível para o diagnóstico da hanseníase. Amostras de linfa são rapidamente obtidas em campo e pouco invasivas. O objetivo principal deste trabalho foi comparar os resultados da PCR com 4 pares de primers (Ag85B, MntH, Pra-36kDa e RLEP), descritos na literatura para o diagnóstico da hanseníase, utilizando-se DNA extraído de amostras de linfa de orelhas, cotovelos e joelhos, coletadas em papel filtro. Além da comparação dos resultados da PCR com os 4 pares de primers, também foram comparados à baciloscopia de linfa no grupo MB e ao ELISA anti-PGL-1 nos grupos PB e MB, utilizando-se o teste de qui-quadrado de McNemar para amostras pareadas. Trinta e nove pacientes com hanseníase [12 (30,76%) na forma PB e 27 (69,23%), multibacilar (MB)], virgens de tratamento, atendidos consecutivamente no período de 2006 a 2010, foram incluídos. A detecção de bacilos à baciloscopia e na biópsia de pele foi confirmada em 55,55% e em 100% dos pacientes MB, respectivamente; e 67,56% dos pacientes (33,33% dos PB e 84% dos MB) apresentaram títulos de anti-PGL1 acima do cut-off no ELISA. A PCR foi positiva em 70,37% das 27 amostras de pacientes MB, considerando-se o resultado conjunto dos 4 primers (7,69% com Ag85B; 11,11% com MntH; 12,5% com Pra-36kDa; e 66,66% com RLEP). Uma amostra se mostrou positiva com os primers Ag85B, MntH e Pra-36kDa e negativa com RLEP. Não houve amplificação no grupo PB, portanto, os resultados do ELISA anti-PGL-1, embora não confirmatórios da etiologia, foram superiores para o diagnóstico da hanseníase PB. No grupo MB, os resultados da PCR com RLEP foram superiores àqueles com MntH, Ag85B e Pra- 36kDa (P<0,001); comparando-se MntH com Ag85B e Pra-36kDa (P=0,317; P=1,0, respectivamente), e Ag85B com Pra-36kDa (P=0,564), os resultados foramsemelhantes. A frequência de positividade da baciloscopia foi maior que a da PCR com MntH (P=0,001), Ag85B (P<0,001) e Pra-36kDa (P=0,004); semelhante ao RLEP (P=0,083); e menor, quando comparada ao resultado combinado dos 4 primers (P=0,046). Ainda no grupo MB, a frequência de positividade anti-PGL-1 foi superior à da PCR com MntH, Ag85B e Pra-36kDa (P<0,001) e à baciloscopia (P=0,011); porém, foi semelhante à PCR com RLEP (P=0,059) ou com os 4 primers combinados (P=0,102). A maior frequência de positividade da PCR com primers RLEP é explicada pela presença de múltiplas cópias RLEP no genoma do bacilo, aumentando a chance do anelamento e amplificação. Existe complementariedade entre os resultados com diferente primers, podendo uma mesma amostra apresentar diferentes resultados a depender da escolha destes. A frequência da positividade da PCR com par de primers RLEP, em amostras de linfa coletadas em papel filtro, mostrou-se semelhante à da baciloscopia e do ELISA anti-PGL-1 nos pacientes MB. Assim, encoraja-se seu emprego em trabalhos de campo devido à facilidade da coleta e possibilidade de remessa dos papéis filtro para centros de referência. / Leprosy\'s etiologic diagnosis may be difficult in paucibacillary (PB) patients, in which laboratory tests have low sensitivity for the detection of the causative agent, Mycobaterium leprae. Polymerase chain reaction (PCR) has shown good sensitivity in leprosy diagnosis. Lymph samples are readily acquired in the field and minimally invasive. The main objective of this paper is to compare the results of PCR with four sets of primers previously described in the literature (Ag85B, MntH, Pra-36kDa and RLEP), using DNA extracted from lymph samples from ear lobes, elbows and knees, stored in filter paper. We also aim to compare the PCR results to lymph bacilloscopy in the multibacillary (MB) group and to anti-PGL-1 serology in PB and MB group, using McNemar\'s chi-square test for paired samples. 39 treatment-naïve leprosy patients [12 (30.76%) PB and 27 (69.23%) MB] seen in the outpatient clinic of a referral center were included. Bacilli were detected in 55.55% of bacilloscopy samples and 100% of biopsies from MB patients; 67.56% of all patients (33.33% of PB and 84% of MB) had anti-PGL1 titers above the method\'s cut-off. PCR was positive in 70.37% of the 27 MB patients, taking in consideration the 4 primers combined (7,69% with Ag85B; 11,11% with MntH; 12,5% with Pra-36kDa; e 66,66% with RLEP). One sample was positive for primers Ag85B, MntH e Pra-36kDa and negative for RLEP. There was no DNA amplification in the PB group, in which antiPGL-1 ELISA, although not confirmatory of the disease, was superior in the diagnosis. In the MB group, PCR with RLEP primer was superior to Ag85B, MntH and Pra-36kDa (P<0,001); between MntH and Ag85B (P=0,317); MntH and Pra- 36kDa (P=1,0); and Ag85B and Pra-36kDa (P=0,564), results were similar. Bacilloscopy\'s frequency of positivity was greater than PCR with Ag85B (P<0,001), MntH (P=0,001) and Pra-36kDa (P=0,004); similar to RLEP (P=0,083); and inferior to the results of the four primers combined (P=0,046). Still in the MB group, anti-PGL-1 serology was superior to PCR with Ag85B, MntH and Pra-36kDa (P<0,001) and to bacilloscopy (P=0,011); its results were similar to PCR with RLEP (P=0,059) or with the four primers combined (P=0,102). RLEP\'s greater positivity is probably due to thepresence of multiple copies of the target DNA in the bacillus\' genome, enhancing the chances of primer annealing. The primers showed complementarity; therefore one sample may display different outcomes depending on primer choice. The frequency of positivity of PCR with RLEP primers, in lymph samples stored in filter paper, was similar to bacilloscopy and serology amongst MB patients. Hence, we encourage its use in fieldwork as a practical and easy method for acquiring samples that can be shipped for further processing in referral centers.

Orientadores: Sandra Cecília Botelho Costa, Eros Antonio de Almeida / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T09:16:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Batista_AngelicaMartins_D.pdf: 10617483 bytes, checksum: 6e76f5ea9c45674436a2aa740178f813 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Atualmente, o diagnóstico laboratorial da doença de Chagas crônica baseia-se em métodos sorológicos convencionais. Entretanto, resultados falso-negativos e falso-positivos podem ocorrer. A hemocultura também pode ser utilizada como método diagnóstico, mas sua sensibilidade é limitada na fase crônica. Métodos diagnósticos baseados em princípios de biologia molecular vêm sendo estudados e a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) tem sido a técnica mais utilizada ultimamente. Este estudo teve como objetivo principal avaliar o desempenho da PCR qualitativa e quantitativa no diagnóstico da doença de Chagas em pacientes portadores de megaesôfago. Foram estudadas amostras de DNA de sangue de 26 pacientes com sorologia não reagente ou inconclusiva e de 33 pacientes soropositivos para doença de Chagas. O alvo genético mais adequado para PCR qualitativa, que apresentou maior positividade, foi o Sat-DNA de T. cruzi. Quando comparada com os resultados de PCR quantitativa, houve concordância de 72,72% em ambos os grupos. Além disso, observou-se que todos os pacientes com hemocultura positiva apresentaram PCR qualitativa positiva. A metodologia quantitativa, embora considerada altamente sensível, não detectou DNA de T. cruzi em uma amostra de paciente com hemocultura positiva. Nossos resultados indicam um possível subdiagnóstico da doença de Chagas em pacientes com megaesôfago devido aos exames sorológicos negativos ou inconclusivos. A PCR qualitativa mostra-se uma ferramenta útil para esclarecimento da etiologia do megaesôfago e, por apresentar positividade semelhante à qPCR, não se justifica o uso de metodologia quantitativa para fins exclusivamente diagnósticos / Abstract: Current laboratory diagnosis of chronic Chagas disease relies on conventional serological tests but false-positive and false-negative results may occur. Hemoculture can also be used as a diagnostic method but its sensitivity in chronic phase is limited due to the low/intermittent parasitemia. Molecular diagnosis methods have been studied and the main technique that has been extensively tested is the Polymerase Chain Reaction (PCR). This study aimed to evaluate the qualitative and quantitative PCR performance for diagnostic purposes in patients with megaesophagus. We studied DNA blood samples from 26 patients with negative or inconclusive conventional serology for Chagas disease and from 33 patients with positive serology. The most suitable target for qualitative PCR presenting high positivity was the Sat-DNA of T. cruzi. When compared to the quantitative results, the concordance between the two molecular methods in both groups was 72.72%. In addition, we observed that all patients with positive results of hemoculture had positive qualitative PCR. The qPCR methodology although highly sensitive could not detect minimal amounts of T. cruzi DNA in one patient with positive hemoculture. Our results indicate a possible misdiagnosis of patients with megaesophagus given by the negative or inconclusive serology for Chagas disease. Due to its good performance, the qualitative PCR is a useful tool to determine the megaesophagus etiology / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Clínica Médica

Vias redox são importantes reguladores da homeostase e sinalização celular, mas o entendimento dos mecanismos desses processos é incompleto. Tiol-proteínas como a dissulfeto isomerase proteica (PDI) podem ser moduladores dessas vias. A PDI(PDIA1) é o protótipo da família das PDIs, cuja função canônica é o enovelamento redox de proteínas no retículo endoplasmático. Além disso, PDI exerce regulação de NADPH oxidases, as principais fontes de oxidantes celulares, e é necessária para ativação de RhoGTPases, organização do citoesqueleto e migração de células vasculares. No estudo de mecanismos pelos quais a PDI regula RhoGTPases, mostramos, em redes computacionais e em experimentos de co-imunoprecitação, associação entre PDIA1 e o regulador de RhoGTPases RhoGDIalfa. Além disso, identificamos forte proximidade entre os genes codificando estas proteínas. Neste estudo, caracterizamos o perfil e implicações desta sintenia gênica.A análise bioinformática pelos programs Ensembl, NCBI e UCSC evidencia um padrão de sintenia entre diferentes isoformas destas duas famílias: PDIA1 (P4HB), PDIA2 (PDIP) e PDIA8 (Erp27) são vizinhos, respectivamente, a RhoGDIbeta, RhoGDIy e RHOGDIalfa, com correspondentes regiões intergênicas de 7.1, 2.9 e 0.14 kb em distintos cromossomos em H. sapiens. O padrão dessa sintenia foi fortemente conservado emC. elegans, alguns peixes e uniformemente em anfíbios, répteis, aves e mamíferos. Leveduras expressam no mesmo cromossomo , porém em locais distantes (i.emacrossintenia) ortólogos da PDIA1 e RhoGDI?, mas não expressam outras PDIs e RhoGDIssintênicasnos eucariotos complexos. No entanto, sintenia entre PDI e RhoGDI foi também observada na planta A. thaliana, sem evidência de um ancestral comum. Os pares sintênicos associam-se a blocos vizinhos conservados, porém diversos para cada par, enquanto cada bloco contem um gene codificando um distinto regulador da PP1 (fosfatase proteica-1). Análise filogenética mostrou topologia semelhante entre as duas famílias.Análise dos dados do estudo ENCODE e predição pelo Softberry identificou sítios de ligação a fatores de transcrição comuns entre os distintos pares, cuja ontologia indicou principalmente desenvolvimento, processos metabólicos e resposta imune. O estudo de possíveis implicações funcionais dessa sintenia mostrou que manipulações da expressão proteica de PDIA1 não promovem mudança consistente na expressão proteica de RhoGDIalfa, tanto in vitro (silenciamento da PDI por siRNA e superexpressão por vetor lentiviral induzível) como in vivo (camundongo transgênico com superexpressão constitutiva da PDIA1). No entanto, as mudanças da expressãogênica de ambos os genes na camada íntima de artérias carótidas de camundongo durante remodelamento induzido por fluxo foram fortemente correlacionadas. Experimentos de coimunoprecipitação e co-localização à microscopia confocal sugeriram interação física entre PDIA1 e RhoGDIAalfa. Deste modo, estes dados mostram um intrigante padrão de conservação evolutiva da proximidade gênica entre PDIs e RhoGDIs, não usual em eucariotos. Genes sintênicos frequentemente codificam proteínas que tendem a interagir física e/ou funcionalmente. Com efeito, nosso dados sugerem co-regulação e interação física entre PDIA1 e RhoGDIAalfa, corroborando a convergência entre essas proteínas como possível mecanismo envolvido na regulação redox do citoesqueleto pela PDIA1 / Redox pathways are important regulators of homeostasis and cell signaling, but the understanding of the mechanisms of these processes is incomplete. Thiol proteins such as protein disulfide isomerase (PDI) can be modulators of these pathways. PDI (PDIA1) is the prototype of the family of PDIs whose canonical function is a redox protein folding in the endoplasmic reticulum. In addition, PDI exerts regulatory NADPH oxidase, the main sources of cellular oxidant, and is required for activation RhoGTPases, cytoskeletal organization and migration of vascular cells. In the study of mechanisms by which regulates PDI RhoGTPases, we showed in computer networks and co-imunoprecitation experiments association between PDIA1 and the regulator of RhoGTPases, RhoGDI?. In addition, we identified strong proximity of the genes encoding these proteins. In this study, we characterize the profile and implications of this synteny. .A bioinformatic analysis by programs Ensembl, NCBI and UCSC shows a pattern of synteny between different isoforms of these two families: PDIA1 (P4HB), PDIA2 (PDIP) and PDIA8 (Erp27) are neighbors , respectively RhoGDIalfa, and RhoGDIy RHOGDIbeta with corresponding intergenic regions 7.1, 2.9 and 0:14 kb in different chromosomes of H. sapiens. The pattern of this synteny was strongly maintained in C. elegans, some fish and evenly amphibians, reptiles, birds and mammals. Yeasts express on the same chromosome, but in distant places (i.e macrosintenia) orthologs of PDIA1 and RhoGDI?, but do not express other syntenics PDIs and RhoGDIs in complex eukaryotes. However, synteny between PDI and RhoGDI was also observed in the plant A. thaliana, no evidence of a common ancestor. The syntenic pairs are associated with the stored neighboring blocks, but different for each pair, while each block contains a gene encoding a regulator of distinct PP1 (protein phosphatase-1). Phylogenetic analysis showed similar topology between the two famílias. The identified binding sites common transcription factors between different pairs, which mainly indicated ontology development, metabolic and immune response. The study of possible functional implications of synteny showed that manipulations of PDIA1 protein expression do not promote consistent change in protein expression RhoGDI, both in vitro (silencing of PDI by siRNA and overexpression of inducible lentiviral vector) and in vivo (transgenic mice overexpressing constitutive of PDIA1). The study of possible functional implications of synteny showed that manipulations of PDIA1 protein expression do not promote consistent change in protein expression RhoGDIalfa, both in vitro (silencing of PDI by siRNA and overexpression of inducible lentiviral vector) and in vivo (transgenic mice overexpressing constitutive of PDIA1). However, changes of gene expression of both genes in the intima of mouse carotid arteries during remodeling induced by flow were strongly correlated. Immunoprecipitation experiments and co-location to confocal microscopy suggested physical interaction between PDIA1 and RhoGDIAalfa. Thus, these data show an intriguing pattern of evolutionary conservation of gene proximity between POIs and RhoGDIs not common in eukaryotes. sintênicos genes often encode proteins that tend to interact physically and / or functionally. Indeed, our data suggest co-regulation and physical interaction between PDIA1 and RhoGDIAalfa, supporting the convergence of these proteins as a possible mechanism involved in redox regulation of cytoskeleton by PDIA1

Introdução: A cardiomiopatia hipertrófica (CH) é uma doença cardíaca estrutural primária, caracterizada por hipertrofia do ventrículo esquerdo, sem dilatação, geralmente assimétrica e predominantemente septal. Na população geral a prevalência estimada da CH é de 0,2% (1:500), correspondendo a 0,5% de todas as cardiopatias. Atualmente estão descritas mais de 1400 mutações associadas à CH em 20 genes relacionados com os miofilamentos do sarcômero, o disco-Z e o transporte de cálcio, sendo que os três mais associados são os genes MYH7, MYBPC3 e TNNT2, responsáveis por 50% do casos com diagnóstico molecular positivo no Brasil. Dessa forma, o advento de novas tecnologias de sequenciamento de DNA de alta performance promete revolucionar o diagnóstico molecular, tornando mais rápida e barata a identificação de alterações genéticas, impactando positivamente na custo-efetividade do manejo diagnóstico e terapêutico de pacientes e famílias com o diagnóstico de CH. Materiais e Métodos: Noventa e uma amostras de uma casuística de pacientes não relacionados, portadores de CH com diagnóstico molecular prévio para os 3 genes mais associados (19 positivas e 72 negativas) foram utilizadas juntamente com uma amostra referência do HapMap (NA12878) na validação de um pipeline proposto para a identificação de alterações genéticas em um painel com 74 genes associados à cardiomiopatias hereditárias, utilizando a plataforma Ion Torrent PGM. A etapa de chamada de variantes foi testada em dois limiares diferentes de cobertura de sequenciamento (30x e 10x) e três limiares de frequência de alelo variante (35%, 25% e 20%). A amostra NA12878 foi utilizada na aferição de valores de reprodutibilidade intra e inter-ensaio. As amostras da casuística de CH com diagnóstico molecular prévio negativo foram utilizadas na análise de ganho diagnóstico. Eram consideradas alterações potencialmente patogênicas aquelas que apresentassem associação prévia com CH ou classificação deletéria em dois de três algoritmos de predição de impacto funcional (PROVEAN, SIFT, PolyPhen2) e MAF<0,01, se disponível. Resultados: A plataforma de sequenciamento utilizada apresentou desempenho aceitável, gerando em média 165,9 ±13,1 Mb, com um valor médio de 146,9 ± 11,54 Mb acima de PhredQ>=20, por amostra. O valor médio de cobertura de sequenciamento por amostra foi de 250 ± 23,94x, com 95,2% das regiões alvo cobertas pelo menos 10x. A sensibilidade máxima observada para SNVs foi de 96,7% enquanto que para InDels foi 28,5%. Os valores de reprodutibilidade inter e intra-ensaio de 89,5% e 87,3%, respectivamente. Das 72 amostras negativas, 35 puderam ser reclassificadas como positivas, sendo que os dois genes com mais ocorrências de alterações genéticas foram FLNC e TRIM63, ambos já relacionados com CH. Vinte e duas amostras foram reclassificadas como inconclusivas e 15 permaneceram negativas. O ganho diagnóstico foi de 21,5%. Conclusões: A plataforma Ion Torrent PGM apresenta potencial no sequenciamento de genes relacionados à cardiomiopatias hereditárias e o pipeline validado mostrou valores analíticos praticáveis em uma rotina diagnóstica. A utilização do painel genético ampliado se mostrou viável na detecção de alterações genéticas, propiciando uma boa margem de ganho diagnóstico em comparação com o sequenciamento apenas dos três genes mais associados à CH / Introduction: Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is a primary cardiac disease, mainly characterized by unexplained left ventricle hypertrophy, in the absence of dilatation, usually asymmetric and predominantly septal. The estimated prevalence is 1:500 individuals in the general population, corresponding for 0.5% of all cardiac diseases. Up to now, more than 1400 mutations are associated with HCM in 20 genes related with sarcomeric myofibrils, Z-disc and calcium homeostasis, wherein the 3 most associated genes are MYH7, MYBPC3 and TNNT2, accounting for 50% of cases with positive molecular diagnostics in Brazil. Thus, the advent of new high throughput DNA sequencing technologies promise to revolutionize the use of molecular diagnostics, turning the identification of genetic mutations in a fast and cheap practice, increasing the cost-effectiveness of diagnostic and treatment of patients and families with HCM. Materials and Methods: Ninety one samples from an HCM casuistic of unrelated individuals with previous molecular diagnostics for the three most HCM-associated genes (19 positives and 72 negatives) were processed along with a reference HapMap sample (NA12878) in the validation process of a pipeline proposed for the detection of genetic alterations in a genetic panel composed of 74 genes associated with inherited cardiomyopathies, using Ion Torrent PGM platform. The variant call step was tested for two cutoffs of sequencing coverage (30x and 10x) and three cutoffs of variant allele frequency (35%, 25% and 20%). The sample NA12878 was used in the assessment of intra and inter-assay reproducibility. Negative samples from the HCM casuistic were used in the assessment of diagnostic yield. Variants were considered potentially pathogenic if previously described as associated with HCM or if presenting a deleterious score in at least two of three impact prediction algorithms tested (PROVEAN, SIFT and PolyPhen-2) and MAF < 0.01, if available. Results: The chosen next-generation sequencing platform presented an acceptable performance, with a mean throughput of 165,9 ±13,1 Mb, with a mean value of 146,9 ± 11,54 Mb above PhredQ >= 20. Mean sequencing coverage was 250 ± 23,94x, wherein 95.2% of target bases were covered at least 10x. Maximum achieved sensitivity for SNVs was 96.7% while for InDels was 28.5%. Both values of inter and intra-assay reproducibility were 89.5% and 87.3%, respectively. Of all 72 negative samples, 35 were reclassified as positive with the two most frequently mutated genes being FLNC and TRIM63, both already associated with HCM. Twenty two samples were reclassified as inconclusive and 15 remained negatives. Diagnostic yield was 21.5%. Conclusions: Ion Torrent PGM platform presented a feasible potential for the sequencing of inherited cardiomyopathies-associated genes and the designed pipeline presented reliable analytical values for diagnostic use. The expanded panel proved to be a good strategy for the detection of genetic alteration providing a good value of diagnostic yield in comparison with the sequencing of the three most HCM-associated genes alone

INTRODUÇÃO: Os desequilíbrios genômicos constituem causa frequente de abortamento, anomalias congênitas (AC) e atraso de desenvolvimento neuropsicomotor (ADNPM). O aprimoramento de novas técnicas de diagnóstico citogenômico, como por exemplo, a MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) e a triagem ampla do DNA utilizando arrays, mostraram que a alteração no número normal de cópias genômicas (CNVs) influencia na patogenicidade dos fenótipos em diversas síndromes. OBJETIVOS: Com isso, os objetivos do presente estudo foram identificar CNVs em pacientes com MC e ADNPM utilizando a técnica de MLPA e, a partir dos resultados alterados, aplicar da técnica de array para a identificação de possíveis rearranjos complexos, além de associar as alterações moleculares encontradas com o fenótipo dos pacientes. MÉTODOS: Participaram do estudo 416 pacientes com MC e ADNPM. As amostras de DNA foram analisadas utilizando a técnica de MLPA com kits comerciais para as principais síndromes de microdeleções (P064) e regiões subteloméricas (P036 e P070). Dois kits de MLPA específicos para as regiões 7q11.23 (P029) e 22q11.2 (P250) também foram utilizados para complementar a identificação de CNVs atípicas. Entre os casos que apresentavam alterações pela técnica de MLPA, 15 pacientes foram submetidos à técnica de array, utilizando três diferentes plataformas: Agilent SurePrint G3 Genoma Humano microarray 180 K, HumanCytoSNP-12 BeadChip, CytoScan(TM) HD array 6.0 Affymetrix®. RESULTADOS: A análise molecular pela técnica de MLPA possibilitou a detecção de microdeleções e/ou microduplicações em 97 pacientes sendo que: em 46 pacientes foi possível encontrar alterações utilizando apenas o kit P064 (microdeleções), em 34 pacientes utilizando apenas os kits P036 e P070 (regiões subteloméricas) e em quatro pacientes só foi possível identificar a alteração utilizando outro kit de MLPA (P250), específico para alterações genômicas em 22q11.2. Rearranjos complexos, envolvendo mais de três cromossomos, foram observados em 10 pacientes. DISCUSSÃO: A MLPA permitiu detectar CNVs em 97/416 pacientes (23,3%), sendo uma técnica ideal para ser aplicada em pacientes com sinais fenotípicos inespecíficos. Algumas alterações genômicas encontradas estão relacionadas também com alterações específicas, como a presença de malformação cardíaca ou convulsões. E em outros casos a alta variabilidade fenotípica pode ser associada a um conjunto de CNVs consideradas patogênicas. Além disso, a inclusão de outra técnica de triagem, com maior cobertura do genoma permitiu detectar rearranjos complexos antes não observados mesmo em síndromes bem descritas como as síndromes de midrodeleções 7q11.23 e 22q11.2. CONCLUSÃO: A MLPA com kits combinados, por possuir maior abrangência de regiões detectadas e menor custo, é uma ferramenta valiosa para ser utilizada como um teste de triagem diagnóstica / INTRODUCTION: Genomic imbalances are the most common cause of miscarriage, congenital anomalies (CA) and mental retardation (MR). With the improvement of new cytogenomics diagnostic techniques, such as the MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) and the array techniques, it have been shown that changes in the normal gene copy number influence the pathogenic variability of phenotypes in different syndromes. AIMS: The aims of the present study were to identify CNVs in patients with CM and RM using the MLPA technique and, from the abnormalities results, to apply the array methodology for the identification of complex rearrangements. Furthermore, the study aimed to associate the alterations found by molecular techniques with the phenotype of patients. METHODS: 416 patients with CM and RM participated in the study. The samples were analysed by MLPA technique with commercial kits for the main microdeletion syndromes (P064) and subtelomeric regions (P036 and P070). Two more MLPA kits for specific regions 7q11.23 (P029) and 22q11.2 (P250) were used to confirm the altered results and to complement some results with the identification of atypical abnormalities. From the patients who presented abnormalities by MLPA technique, 15 underwent by microarray-based comparative genomic hybridization (CGH-array) technique, using three different platform: Agilent SurePrint G3 Human Genome microarray 180 kb, HumanCytoSNP -12 BeadChip, CytoScan(TM) HD ® and Affymetrix 6.0. RESULTS: The molecular analysis by MLPA technique allowed the detection of microdeletions and/or microduplications in 97 patients. In 46 patients it was possible to find genomic alteration using only MLPA kit P064 and in 34 patients using only the subtelomeric kits P036 and P070. For four patients it was only possible to identify the genomic abnormalities using another specific MLPA kit (P250), involving the 22q11.2 region. Complex rearrangements involving more than three chromosomes were detected in 10 patients. DISCUSSION: The MLPA technique was capable of detecting CNVs in 97/416 (23,3%) of patients, being an ideal technique to be applied in patients with non-specific signs phenotypic. Some genomic alterations found are, also related to specific changes, such as the presence of cardiac malformation or convulsions. In other cases, the high phenotypic variability may be associated to certain group of pathogenic CNVs. Moreover, the inclusion of additional screening method, with greater coverage, allowed the detection of complex rearrangements not seen before even in syndromes as well described microdeletions syndromes on 7q11.23 and 22q11.2 regions. CONCLUSION: The MLPA technique can be a valuable tool used as a molecular screening test, because it has greater coverage and lower cost of detected regions