Leung Kam Tong. / Thesis submitted in: September 2006. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2007. / Includes bibliographical references (leaves 79-95). / Abstracts in English and Chinese. / Abstract --- p.i / Abstract (Chinese) --- p.iii / Acknowledgements --- p.v / Table of contents --- p.vi / List of figures --- p.ix / List of abbreviations --- p.xii / Chapter Chapter 1 --- General Introduction --- p.1 / Chapter 1.1 --- Acute lymphoblastic leukemia --- p.1 / Chapter 1.2 --- T-cell acute lymphoblastic leukemia --- p.2 / Chapter 1.2.1 --- Chemotherapy --- p.2 / Chapter 1.2.1.1 --- Induction therapy --- p.2 / Chapter 1.2.1.2 --- Intensification therapy --- p.3 / Chapter 1.2.1.3 --- Maintenance therapy --- p.3 / Chapter 1.2.2 --- Chemoresistance in T-ALL --- p.3 / Chapter 1.3 --- Apoptosis and chemoresistance --- p.5 / Chapter 1.3.1 --- "Initiation, execution and regulation of apoptosis" --- p.5 / Chapter 1.3.1.1 --- Initiation of apoptosis --- p.5 / Chapter 1.3.1.2 --- Execution of apoptosis --- p.7 / Chapter 1.3.1.3 --- Regulation of apoptosis --- p.7 / Chapter 1.3.2 --- Mechanisms of resistance to apoptosis --- p.9 / Chapter 1.3.2.1 --- Overexpression of pro-survival proteins --- p.9 / Chapter 1.3.2.2 --- Downregulation and mutation of pro-apoptotic proteins --- p.11 / Chapter 1.3.2.3 --- Other mechanisms --- p.13 / Chapter 1.4 --- Bcl-2 interating mediator of cell death --- p.14 / Chapter 1.4.1 --- Role of Bim in apoptosis --- p.16 / Chapter 1.4.2 --- Regulation of Bim --- p.17 / Chapter 1.4.2.1 --- Transcriptional regulation of Bim --- p.18 / Chapter 1.4.2.2 --- Post-transcriptional regulation of Bim --- p.18 / Chapter 1.5 --- c-Jun N-terminal kinase --- p.20 / Chapter 1.5.1 --- Pro-apoptotic role of JNK --- p.21 / Chapter 1.5.2 --- Anti-apoptotic role of JNK --- p.21 / Chapter 1.6 --- Hypotheses --- p.22 / Chapter Chapter 2 --- Materials and Methods --- p.23 / Chapter 2.1 --- Cell culture --- p.23 / Chapter 2.2 --- Induction of quantification of apoptosis --- p.24 / Chapter 2.3 --- Determination of caspase activities --- p.24 / Chapter 2.4 --- Western blotting --- p.25 / Chapter 2.4.1 --- Protein extraction and determination of protein concentration --- p.25 / Chapter 2.4.2 --- SDS-PAGE and immunodetection --- p.26 / Chapter 2.5 --- Cell-free apoptosis reactions --- p.27 / Chapter 2.6 --- Analysis of mitochondrial membrane potential --- p.27 / Chapter 2.7 --- Transient transfection of Sup-Tl cells --- p.28 / Chapter 2.8 --- Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) --- p.28 / Chapter 2.8.1 --- RNA isolation --- p.28 / Chapter 2.8.2 --- Synthesis of first-strand cDNA --- p.29 / Chapter 2.8.3 --- Polymerase chain reaction --- p.29 / Chapter 2.9 --- Alkaline phosphatase digestion of Bim --- p.30 / Chapter Chapter 3 --- Results --- p.31 / Chapter 3.1 --- The T-ALL cell line Sup-Tl is resistant to etoposide-induced apoptosis --- p.31 / Chapter 3.2 --- Sup-Tl cells are resistant to etoposide-induced caspase activation --- p.40 / Chapter 3.3 --- Sup-Tl cells are insusceptible to etoposide-induced mitochondrial alterations --- p.46 / Chapter 3.4 --- BimEL is required for etoposide-induced apoptosis in Sup-Tl cells --- p.51 / Chapter 3.5 --- The reduced level of BimEL in Sup-Tl cells is owing to the presence of constitutively active JNK --- p.58 / Chapter Chapter 4 --- Discussion --- p.67 / References --- p.79

La leucémie T de l’adulte (ATL), caractérisée par une prolifération dérégulée de lymphocytesT CD4+ activés, se développe chez des individus infectés par le virus T-lymphotropehumain (HTLV-1). Une période asymptomatique de plusieurs décennies sépare l’infection del’apparition des symptômes cliniques de l’ATL, rendant complexe la compréhension des étapesinitiales de la leucémogenèse. Le modèle de la souris humanisée dans laquelle est reconstituéun système hémato-lymphoïde humain est pertinent pour étudier ces étapes, depuis l’infectionpar HTLV-1 jusqu’à l’apparition de la lymphoprolifération. Grâce à ce modèle, mes travaux dethèse ont aidé à mieux comprendre deux mécanismes importants. D’abord, le rôle du chimiotactisme dans le contact cellule infectée-cellule non infectée in vivo. En inhibant la sécrétion de leukotriène B4, un chimioattractant, dans des souris humanisées et infectées, la charge proviraleest plus faible que celle des souris témoins et la prolifération des CD4+ activés est égalementréduite, soulignant le rôle du leukotriène B4 dans la primo-infection. Ensuite, j’ai étudié l’implicationdes protéines PDZ dans le processus leucémogène in vivo. En effet, certaines de cesprotéines, dont Scribble, interagissent avec le PBM (PDZ-domain Binding Motif) de la protéinevirale Tax. Des souris humanisées ont été infectées avec un provirus soit sauvage soit muté auniveau du PBM et j’ai montré, dès 5 semaines après infection, que l’interaction de ce domaineavec des protéines PDZ augmente la prolifération des CD4+ activés et perturbe l’expression degènes impliqués dans la prolifération, l’organisation du cytosquelette et des voies de l’apoptose.Ces résultats attestent du rôle du PBM de Tax dans le soutien de la lymphoprolifération in vivo. / Human T-Cell Leukemia Virus 1 (HTLV-1) is the causative agent of Adult T-cell Leukemia(ATL) characterized by a deregulated proliferation of activated CD4+ T cells. An asymptomaticperiod of several decades separates the infection and the onset of the leukemia, complicating thestudy of the initial leukemogenic steps. Humanized mouse models are relevant to study thosesteps as these mice harbor human hemato-lymphoid cells that can be infected by HTLV-1.I used this animal model to better characterized two biological mecanisms during my thesis.First, the role of chemotaxis in infected-non infected cell contact in vivo. Inhibiting the secretionof leukotriene B4, a potent chemoattractant, in HTLV-1-infected humanized mice reduces theproviral load and the proliferation of activated CD4+ T cells. Those results establish the importanceof leukotriene B4 in HTLV-1 primo-infection. Next, I focused on the importance of thePDZ proteins in the leukemogenic process in vivo. The PDZ-domain Binding Motif (PBM) ofthe Tax viral protein interacts with several cellular PDZ proteins including Scribble. I infectedhumanized mice either with a wild-type or a PBM-mutated provirus of HTLV-1. I showed thatinteraction of the Tax PBM with PDZ proteins enhances activated CD4+ T cells proliferationfrom 5 weeks after infection and disrupts expression of genes implicated in cell proliferation,apoptotic processes and cytoskeleton organization. This study indicated that the PBM of Taxis important for sustaining the lymphoproliferation in vivo.

Haematological cancers like leukemia and lymphoma are characterized by genetic abnormalities, specifically chromosomal translocations. Analyses of the translocation breakpoint regions in patients have shown that some loci in the genome are more susceptible to breakage than others. However, very little is known about the mechanism of generation of many such chromosomal translocations. In the present study, we have attempted to understand the mechanism of fragility of three regions, which are prone to breaks during translocations in follicular lymphoma (FL) and T-cell leukemia. The t(14;18) translocation in FL is one of the most common chromosomal translocations. Most breaks on chromosome 18 are located at the 3’ UTR of the BCL2 gene and are broadly classified into three clusters, namely major breakpoint region (mbr), minor breakpoint cluster region (mcr) and the intermediate cluster region (icr). The RAG complex has been shown to cleave BCL2 mbr by recognizing an altered DNA structure. In the present study, by using a gel based assay, nature of the non-B DNA structure at BCL2 mbr was identified as parallel intramolecular G-quadruplex. Various studies including circular dichroism (CD), mutagenesis, DMS modification assay and 1H NMR showed the presence of three guanine tetrads in the structure. Further, evidence was also found for the formation of such a G-quadruplex structure within mammalian cells. In an effort to characterize the mechanism of fragility of mcr, a unique pattern of RAG cleavage was observed in a sequence dependent manner. Three independent nicks of equal efficiency were generated by RAGs at the cryptic sequence, “CCACCTCT”, at mcr and at a cytosine upstream of it, unlike a single specific nick at the 5’ of heptamer during V(D)J rearrangement. Interestingly, RAG nicking at mcr occured in the presence of both Mg2+ and Mn2+. Using recombination assay, followed by sequencing of the junctions, we find that mcr can recombine with standard RSS in vivo, albeit at a very low frequency. Mutations to this novel motif abolish recombination at the mcr within the cells. In order to determine the prevalence of t(14;18) translocation in the healthy Indian population, nested PCR approach followed by Southern hybridization was used. Results showed 34% prevalence of t(14;18) translocation in the Indian population. Although, no gender based difference was observed, an age dependent increase was found in adults. Further, presence of the t(14;18) transcripts was also detected. The mechanism underlying the fragility of the t(10;14) translocation involving HOX11 gene in T-cell leukemia is not known. Using primer extension assays on a plasmid DNA containing HOX11 breakpoint region, presence of consistent pause sites corresponding to two G-quadruplex forming regions, flanking the patient breakpoints, were detected. These replication blocks were dependent on K+ ions. Native gel shift assays, mutation analysis, S1 nuclease and CD, further revealed formation of intermolecular G-quadruplexes, unlike the BCL2 mbr. Further, sodium bisulfite modification assay indicated the presence of such structures in the genomic DNA within cells. Hence, we propose that two independent G-quadruplex structures formed in the HOX11 gene could interact with each other, thereby resulting in fragility of the intervening sequences, where majority of the patient breakpoints are mapped. Overall, this study has attempted to understand the role of both sequence and structure of DNA, in generating chromosomal fragility during t(14;18) translocation in FL and t(10;14) translocation in T-cell leukemia. These results may facilitate future studies in unraveling the mechanism leading to genomic instability in other lymphoid cancers.

Le virus humain T lymphotrope de type 1 (HTLV-1) est l’agent étiologique de la leucémie/lymphome T de l’adulte (ATLL) qui se développe après plusieurs décennies et pour laquelle il n’existe à ce jour pas de traitement efficace. Parmi les protéines virales de HTLV-1, Tax et HBZ jouent un rôle déterminant dans le développement de l’ATLL. Si Tax participe au processus leucémogène dès les étapes précoces, HBZ jouerait plutôt un rôle dans le maintien du phénotype tumoral dans les étapes tardives. Dans ce contexte, là nous nous sommes intéressés à la régulation de l’expression des protéines anti-apoptotiques Bfl-1 et Bcl-xL, par les protéines virales Tax et HBZ. Nous avons montré que Tax induit l’expression des protéines anti-apoptotiques Bfl-1 et Bcl-xL de la famille Bcl-2 via la voie NF-κB, alors que HBZ n’a aucun effet sur leur expression. De plus, Tax coopère avec les facteurs de transcription c-Jun et JunD de la voie AP-1 pour augmenter l’expression de ces gènes anti-apoptotiques. En revanche, HBZ module uniquement la trans-activation de bfl-1 induite par Tax. L’ensemble de nos résultats indique donc que Tax joue un rôle prépondérant dans l’activation de l’expression de Bfl-1 et de Bcl-xL et suggère que Bfl-1 et Bcl-xL sont exprimées au cours des étapes précoces et tardives du développement de l’ATLL. Par une stratégie d’ARN interférence, nous avons ensuite montré que Bfl-1 et/ou Bcl-xL sont impliquées dans la survie de lignées cellulaires T infectées par HTLV-1, suggérant que Bfl-1 et Bcl-xL représentent des cibles thérapeutiques potentielles pour traiter l’ATLL. Actuellement, il existe des petites molécules ciblant les membres anti-apoptotiques de la famille Bcl-2, mais aucune ne cible spécifiquement Bfl-1. En collaboration avec la société IMAXIO, nous avons identifié par deux cribles à haut débit 83 molécules capables d’inhiber l’activité anti-apoptotique de Bfl-1. L’une de ces molécules induit spécifiquement la mort de lignées cellulaires T infectées par HTLV-1 pour lesquelles Bfl-1 représente un gène de survie. Ainsi, ce travail doit permettre à terme de développer de futurs médicaments dirigés contre Bfl-1 et de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique ciblée contre l’ATLL / Human T lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is the etiological agent of adult T-cell leukemia/lymphoma (ATLL) that develops after several decades and for which there is no effective treatment. Among the viral proteins of HTLV-1, Tax and HBZ play a major role in the development of ATLL. If Tax participates in the initiation of leukemogenesis from the early stages, HBZ rather plays a role in maintaining the tumor phenotype in the late stages. The aims of our study were to better understand the regulation of Bfl-1 and Bcl-xL anti-apoptotic protein expression by Tax and HBZ viral proteins, as well as their role in the survival of HTLV-1-infected T-cells to propose new therapeutic strategies. We showed that Tax induces Bfl-1 and Bcl-xL expression via the NF-κB pathway, whereas HBZ has no effect on their expression. Tax also cooperates with c-Jun and JunD transcription factors of AP-1 family to increase the expression of these anti-apoptotic genes. By contrast, HBZ modulates the Tax-induced bfl-1 trans-activation. Altogether, our data indicate that Tax plays a key role in activating Bfl-1 and Bcl-xL expression and suggests that Bfl-1 and Bcl-xL are potentially expressed during the early and the late stages of ATLL development. Using short hairpin RNA strategy, we then showed that Bfl-1 and/or Bcl-xL are involved in HTLV-1-infected T-cell line survival, indicating that Bfl-1 and Bcl-xL represent potential therapeutic targets in the case of ATLL. One approach currently being developed in anti-cancer drug discovery is to search for small inhibitory compounds targeting anti-apoptotic proteins of the Bcl-2 family. But so far, no drug specifically targeting Bfl-1 is available. In collaboration with the IMAXIO Company, we have identified 83 molecules able to inhibit Bfl-1 anti-apoptotic activity using two high-throughput screening. One of these molecules specifically induced the death of HTLV-1-infected T-cell for which Bfl-1 represents a survival gene. This work provides new insight for long-term development of future drugs directed against Bfl-1 and should allow us to propose new therapeutic strategy for ATLL treatment

La protéine Tax du virus HTLV-1 a les propriétés d'un oncogène viral et joue un rôle important dans l'induction de la transformation cellulaire menant à l'ATL. L'activité oncogène de Tax résulte d'effets pléiotropes sur divers mécanismes cellulaires y compris l'activation de l'expression de gènes cellulaires spécifiques par la voie NF-&61547;B et la dérégulation de la progression du cycle cellulaire. Dans ce travail, nous avons mis en évidence que Tax est une protéine hautement modifiée dans diverses lignées cellulaires y compris dans les lymphocytes T transformés par HTLV-1. L'ensemble des modifications post-traductionnelles de Tax forment une suite hiérarchisée qui contrôlent la localisation intracellulaire de Tax, sa capacité d'activer les kinases IKK et la voie de signalisation des facteurs NF-&61547;B et sa capacité d'induire un arrêt dans la progression de la mitose. En effet, la phosphorylation de Tax contrôle son ubiquitination et son passage dans le noyau où elle est sumoylée et acétylée. L’ubiquitination et la sumoylation de Tax agissent de manière concertée pour permettre l’activation de l’expression des gènes par la voie NF-& / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les lymphomes T périphériques (PTCLs) sont des entités hétérogènes dont la classification a récemment été révisée. Plus de 25 entités de lymphomes T ou NK matures sont ainsi classées selon leur présentation clinico-biologique et leur origine cellulaire présumée, justifiant l’étude approfondie de leur phénotype. Des récepteurs NK (NKRs) ont été mis en évidence dans certains lymphomes cutanés. En outre, un lymphome intra-épithélial intestinal, appelé maladie coeliaque réfractaire de type II (MCRII), dérive d’un lymphocyte caractérisé par des marqueurs T et NK. Ces constatations nous ont amenés à évaluer l’expression de NKRs sur un panel représentatif de PTCLs, constitué en particulier de PTCLs primitifs intestinaux et de leucémies/lymphomes T de l’adulte associés à l’HTLV-1 (ATL). Dans l’ATL, nous montrons que KIR3DL2 est exprimé par les cellules tumorales des formes aigües. Le virus HTLV-1 et la méthylation de son promoteur jouent un rôle dans l’expression de KIR3DL2. Enfin, un anticorps monoclonal dirigé contre KIR3DL2, IPH4102, est capable de tuer spécifiquement les cellules primaires d’ATL KIR3DL2 ex vivo par un mécanisme dépendant d’effecteurs NK autologues. Dans les lymphoproliférations T intestinales primitives, nous montrons que NKp46 est un nouveau biomarqueur pour leur diagnostic et leur stratification thérapeutique. En effet, NKp46 est exprimé sur les cellules anormales de la MCRII, et sur les lymphomes T primitifs intestinaux agressifs, mais pas sur les indolents et les MC non compliquées. Enfin, les cellules primaires exprimant NKp46 sont sensibles ex vivo à la cytotoxicité induite par un anticorps monoclonal dirigé contre NKp46 et couplé à une toxine.Ces résultats nous ont permis de discuter l’origine cellulaire de ces lymphomes et le rôle de ces NKRs dans la lymphomagénèse. Dans une optique translationnelle, l’expression des NKRs peut aider au diagnostic de ces entités parfois difficiles à individualiser, et enfin constituer une cible thérapeutique intéressante. / Peripheral T-cell lymphoma (PTCLs) are heterogeneous entities whose classification has recently been revised. More than 25 entities are thus classified according to their clinico-biological presentation and their presumed cellular origin, justifying the in-depth study of their phenotype. NK receptors (NKRs) have been demonstrated in some cutaneous lymphomas. In addition, a less known intestinal lymphoma, called type II refractory celiac disease (RCDII), arises from an intraepithelial lymphocyte characterized by T and NK markers. These findings led us to evaluate the expression of NKRs on a representative panel of PTCLs, focusing on primary gastrointestinal (GI) T-cell lymphoproliferative diseases (T-LPD) and HTLV-1 associated adult T leukemia/lymphoma (ATL).In ATL, we show that KIR3DL2 expression is mainly associated with acute-type ATL. HTLV-1 has a preferential tropism for KIR3DL2+ lymphocytes and may play a role in KIR3DL2 expression induction, combined with the hypomethylation status of KIR3DL2 promoter. The benefit of targeting KIR3DL2 by IPH4102 should be further investigating in acute ATL patients.In GI T-LPD, we show that NKp46 is a novel biomarker useful for diagnosis and therapeutic stratification, as NKp46 is a hallmark of RCDII tumor cells, shared by EATL. Strong preclinical rationale identifies anti-NKp46-PBD as a promising therapy for RCDII, EATL and MEITL.These results allowed us to discuss the cellular origin of these lymphomas and the role of NKRs in lymphomagenesis. From a translational point of view, NKRs could represent useful biomarkers in these entities that are sometimes difficult to individualize, and finally constitute an interesting therapeutic target.

No description available.