Die „donor lymphocyte infusion“ (DLI) stellt eine wirksame Therapieoption für ein Rezidiv bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) nach allogener Stammzelltransplantation (SZT) dar. Jedoch ist die DLI oft mit einer „graft-versus-host disease” (GvHD) assoziiert, die auf einer proinflammatorischen, gegen den Empfänger gerichteten T-Zell-vermittelten Immunantwort beruht. Eine Strategie, den „graft-versus-leukemia” (GvL)-Effekt zu steigern und dabei das Risiko einer GvHD zu mindern, besteht in dem adoptiven Transfer hoch-avider CD8+ T-Zell-Klone, welche selektiv AML-assoziierte Antigene erkennen. Daher bestand das Ziel dieser Arbeit darin, eine neue Strategie zur Generierung hoch-avider CD8+ T-Zell-Klone, welche die Leukämie-assoziierten Antigene (LAAs) Wilms‘-Tumor-Antigen 1 (WT1), Proteinase 3 (PR3), Nucleophosmin 1 (NPM1) und Survivin als attraktive Ziele für spezifische Immuntherapien erkennen, zu entwickeln. Zunächst wurden mithilfe der innovativen Streptamer-Technologie die Frequenzen von CD8+ T-Zellen mit Reaktivität gegen WT1, PR3, NPM1 und Survivin im peripheren Blut von 10 gesunden HLA-A*02:01+ Spendern analysiert. Auf diese Weise konnten jedoch nur sehr geringe bis keine detektierbaren Frequenzen LAA-spezifischer CD8+ T-Lymphozyten nachgewiesen werden. Diese Beobachtungen führten zu dem Schluss, dass AML-Peptid-spezifische CD8+ T-Zellen im Gegensatz zu Virus-spezifischen T-Zellen aufgrund deutlich geringerer Frequenzen nicht direkt aus dem peripheren Blut isoliert werden können. Daher erfolgte die in vitro-Expansion der CD8+ T-Zellen mithilfe von autologen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDCs). DCs sind als professionelle Antigen-präsentierende Zellen in der Lage, Effektorzellen des adaptiven Immunsystems zu stimulieren sowie deren Expansion zu induzieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein geeignetes Protokoll für die Generierung von Fast-MoDCs etabliert. Diese zeichneten sich durch die ausgeprägte Expression kostimulatorischer und Antigen-präsentierender Moleküle, die Sekretion großer Mengen des proinflammatorischen Zytokins IL-12 sowie ein effizientes stimulatorisches Potenzial gegenüber CD4+ T-Zellen aus. Erneute Frequenzanalysen nach zweimaliger in vitro-Stimulation mit Peptid-beladenen Fast-MoDCs mittels ELISpot ergaben einen Anstieg der Frequenzen AML-Peptid-spezifischer CD8+ T-Zellen, insbesondere von WT1126-spezifischen CD8+ T-Zellen. Daraufhin erfolgte die Anreicherung der stimulierten CD8+ T-Zellen mit Spezifität für die vier untersuchten LAAs WT1, PR3, NPM1 und Survivin mittels Streptamer-Technologie. Dabei erzielte die Anreicherung WT1126-spezifischer CD8+ T-Lymphozyten deutlich höhere Reinheiten als die von CD8+ T-Zellen mit Reaktivität gegen die Peptide PR1169, NPM1283,mut A/D und Survivin95. Aus diesem Grund wurden die weiteren Untersuchungen auf WT1126 als das bisher vielversprechendste der untersuchten Peptide begrenzt. CD8+ T-Zellen von drei gesunden Spendern wurden mit bestrahlten T2-Zellen und Fast-MoDCs, welche mit dem HLA-A*02:01-restringierten Peptid WT1126 beladen waren, stimuliert. Anschließend erfolgte die Anreicherung WT1126-spezifischer CD8+ T-Zellen mittels Streptamer-Technologie. Bereits nach einmaliger Stimulation kam es zu einer deutlichen Anreicherung WT1126-spezifischer CD8+ T-Zellen, welche effektiv in der Lage waren, Peptid-beladene Zielzellen zu lysieren. Jedoch konnte nach zweimaliger Stimulation nochmals eine deutliche Steigerung in Reinheit und Ausbeute erzielt werden. Die angereicherten Zellen wurden als Effektor-Gedächtnis-T-Zellen charakterisiert. Ausgehend von den Streptamer-isolierten CD8+ T-Zellen eines Spenders erfolgte die Generierung WT1126-spezifischer CD8+ T-Zell-Klone. Im Rahmen der Klonierung wurden 32 WT1126-spezifische CD8+ T-Zell-Klone generiert. Drei vielversprechende Klone wurden genauer hinsichtlich ihrer funktionellen Eigenschaften charakterisiert. Diese exprimierten hoch-avide T-Zell-Rezeptoren und zeigten einen heterogenen Phänotyp von zentralen Gedächtnis-T-Zellen hin zu terminal differenzierten Effektor-Gedächtnis-T-Zellen. Zudem führten sie zu einer effizienten Lyse der HLA-A*02:01+ und WT1+ Zelllinien T2 und SET-2. Darüber hinaus wurde demonstriert, dass die untersuchten Klone auch HLA-A*02:01- und WT1-exprimierende primäre Blasten von AML-Patienten effektiv lysieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Streptamer-basierte Anreicherung stimulierter Tumorpeptid-spezifischer CD8+ T-Zellen vor anschließender Klonierung eine geeignete Strategie für die Generierung hoch-avider CD8+ T-Zell-Klone mit anti-tumoraler Aktivität darstellt. So generierte CD8+ T-Zell-Klone mit Reaktivität gegen AML-assoziierte Antigene können für die Entwicklung neuer immuntherapeutischer Strategien zur Therapie eines Rezidivs bei AML-Patienten nach allogener SZT verwendet werden.

Neuropilin-2 (NRP2) is a single transmembrane receptor and was first found in the nervous system to play a role in axon guidance. Interestingly, NRP2 was also found on many tumor cells and various studies showed that NRP2 is associated with a poor prognosis in different cancers and is involved in migration and therapy resistance. We investigated the prognostic potential of NRP2 in the pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) and found out that in contrast to other kinds of cancer a high expression of NRP2 is associated with a longer cancer specific survival. We hypothesized that this effect could be either triggered through an expression of different interaction partners of NRP2. Both semaphorine 3F and VEGFs can bind to NRP2 but have different effects on cancer cells. Semaphorine 3F was found to have a great potential as a cancer inhibitor in pancreatic cancer whereas VEGFs are often associated with a worse prognosis. Both compete for the binding to NRP2. Furthermore, we found high expression of NRP2 in tumor-associated macrophages (TAMs) in PDACs. Until now, NRP2 expression and function is poorly analyzed in the immune system. Therefore, we next focused on the investigation of NRP2 in the immune system during cancer progression. We used LysM:cre-NRP2LoxP/LoxP (conditional knock-out of NRP2 in macrophages) and Vav:cre-NRP2LoxP/LoxP (conditional knock-out in all immune cells) for our experiments. We showed that NRP2 is upregulated during the differentiation/maturation of macrophages. Next, we injected LLC cells subcutaneously to analyze the effect of NRP2 knock-out in macrophages (LysM:cre) or in the all immune cells (Vav:cre). No difference was detected in tumor size, but the vascularization was impaired in both mouse models. Different tumor models with extended tumor growth times and metastasis should be performed next to proof the importance of NRP2 in immune cells during tumor progression. Due to the broad expression of NRP2 in the immune system we used the Vav:cre-NRP2LoxP/LoxP mouse to investigate the role of NRP2 during an immune response. We used a mild allergic inflammation model of the lung and analyzed the different immune cell populations. Interestingly, T cells and eosinophils were reduced during the inflammation indicating, that the conditional knock-out of NRP2 is inhibiting the immune response. We further analyzed the role of NRP2 in T cells and found out, that the expression of NRP2 is very different in the various T cell populations. CD8+ T cells express ca. 10 times as much mRNA for NRP2 compared to CD4+ T cells. Also, the CD4 subpopulation showed a diverse expression of NRP2. Th2 and Th17 express a lot of NRP2 and Treg and Th1 very low levels. These results suggest an important role of NRP2 in certain cells. The knock-out of NRP2 in Th2 cells leads to an upregulation of IL-13, IL-5 and IL10. We first showed the importance of NRP2 during an immune response and found interesting regulations in immune cell populations and important cytokines. More work needs to be done to understand the functions of NRP2 during an immune response.:INDEX OF ABBREVIATIONS IV TABLE OF FIGURES VI LIST OF TABLES VIII 1 INTRODUCTION 1 1.1 Neuropilins 1 1.1.1 Neuropilin-2 3 1.1.2 Neuropilin-2 in cancer 5 1.2 Pancreatic ductal adenocarcinoma 6 1.3 The immune system 8 1.4 Neuropilin-2 in the immune system 9 1.5 Mouse models 11 2 METHODS 12 2.1 NRP2 related survival study in human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) using a Tissue Micro Array (TMA) 12 2.2 Role of NRP2 in the immune system using different mouse models 12 2.2.1 Mouse lines 12 2.2.2 LysM:cre-NRP2LoxP/LoxP 13 2.2.3 Vav:cre-NRP2LoxP/LoxP 14 2.2.4 Genotyping 14 2.3 Cell culture 15 2.3.1 Cell lines 16 2.3.2 Primary culture 16 2.3.3 Isolation and differentiation of bone marrow derived macrophages (BMDM) 16 2.3.4 Isolation of primary T cells 17 2.3.5 Isolation of T lymphocytes with positive and negative selection 18 2.3.6 Isolation of lymphatic and/or splenic CD8+ cells 18 2.3.7 Isolation of lymphatic and splenic native CD4+ cells 18 2.3.8 Differentiation and culture of naïve CD4+ cells 19 2.4 Lewis lungs carcinoma model 20 2.5 Immunohistochemistry 20 2.5.1 Paraffin embedded tissue 20 2.5.1.1 Fixation 21 2.5.1.2 Cutting 21 2.5.1.3 Hydration 22 2.5.1.4 H&E 22 2.5.2 Evaluation of necrotic areas 22 2.5.3 PAS-Staining 22 2.5.4 CD31 Staining 23 2.5.5 Fluorescent staining on frozen tissue against CD31 and CD206 24 2.5.6 Evaluation of fluorescence CD31 and CD206 staining with ImageJ/Fiji 24 2.5.7 Evaluation of the amount of M2-macrophages in LLC tumors 25 2.6 Mild allergic model of the lung 25 2.7 Quantitative Real-Time PCR (qPCR) 26 2.7.1 RNA isolation 26 2.7.2 cDNA synthesis 27 2.7.3 qPCR 27 2.8 Flow cytometry 28 3 RESULTS 30 3.1 Neuropilin-2 as a prognostic marker in PDAC 30 3.2 Effects of NRP2 deficiency on macrophages and role of NRP2 in immune cells during tumor progression in mice 35 3.2.1 Effects of NRP2 depletion on macrophages 35 3.2.2 Role of a conditional knock-out of NRP2 in immune cells during tumor progression 38 3.3 Role of NRP2 knock-out in immune cells during inflammation 45 3.3.1 Mild allergic model of the lung 45 3.3.2 Analysis of NRP2 deficient T cells 49 4 DISCUSSION 55 4.1 Neuropilin-2 as a prognostic marker in PDAC 55 4.1.1 Sema3F as a potential important factor in PDACs 56 4.1.2 NRP2b as a potential anti-tumorigenic splice variant 57 4.1.3 VEGF-C as a prognostic marker in PDACs 59 4.1.4 Prognostic potential of co-expression of NRP2 and VEGF-C in PDACs 59 4.2 Effects of NRP2 deficiency on macrophages and the role of NRP2 in immune cells during tumor progression in mice 60 4.2.1 Effects of NRP2 depletion on macrophages 61 4.2.2 Analysis of NRP2 deficient macrophages on LLC growth 62 4.2.3 Influence of NRP2 deficiency in hematopoietic stem cells on bones and blood cells 63 4.2.4 Effects of NRP2 deficient immune cells on tumor pathology 64 4.2.5 The role of NRP2 on the vascularization in LLC tumors 65 4.3 The role of NRP2 in during an inflammatory response 68 4.4 Conclusion 72 5 SUMMARY 73 REFERENCES 74 ACKNOWLEDGMENTS/DANKSAGUNG 85 VERSICHERUNG 87

Einleitung: Jeder sechste Mann und jede siebte Frau in der westlichen Welt werden am Myokardinfarkt und seinen Folgepathologien sterben. Nach einem Infarkt ist das Herz nicht fähig die nekrotisierten Kardiomyozyten zu regenerieren, es findet lediglich eine Defektheilung statt. Das entstehende Platzhaltergewebe besteht aus Bindegewebe und ist Ziel fortlaufender Heilungs- und Umbauprozesse. Ob diese in einer stabilen funktionalen Narbe oder in einem Herzwandaneurysma mit sich verschlechternder Herzfunktion enden, hängt im Wesentlichen von dem physiologischen Abschluss des Entzündungsprozesses ab. Den ersten Schritt der Heilung stellt die sterile Entzündung dar, welche durch Proteolyse und Phagozytose die strukturelle Grundlage für die Proliferation des Narbengewebes schafft. Doch auch in späteren Heilungsphasen steuern immunologische Prozesse den regenerativen Ablauf und kommen im besten Fall mit der Ausheilung der Narbe zum Erliegen. Es kann allerdings auch zu einem pathologischen Persistieren dieser Entzündungsantwort kommen, was meist zu einer chronischen Verschlechterung der Organfunktion führt. In welche Richtung sich diese Entzündungsantwort entwickelt, scheint maßgeblich von der Art der Reaktivität des adaptiven Immunsystems auf das ausheilende Gewebe abzuhängen. Nachdem Autoimmunität lange Zeit nur in ihrem pathologischen Kontext untersucht wurde, zeigten mehrere Wundheilungsmodelle die notwendige Beteiligung des adaptiven Immunsystems für eine physiologische Regeneration. Dabei reagieren heilungsförderliche Lymphozyten auf gewebespezifische Autoantigene. Dies zeigte sich auch durch die Aktivierung regulatorischer T-Helfer-Zellen nach einem experimentellen Myokardinfarkt (EMI) in Mäusen, die ihrerseits myokardiale Entzündungsprozesse, Heilung und Remodeling positiv modulieren. Ein Autoantigen, welches in diesem Kontext diskutiert wird, ist das Kardiomyosin. Es wird ausschließlich herzrestriktiv exprimiert und ist in der Lage immunstimulierend zu wirken. Ziele der Untersuchung: In der vorliegenden Arbeit wurde die Relevanz der Antigenspezifität bezüglich Kardiomyosin in immunologischen Heilungsprozessen untersucht. Dabei wurde im Speziellen auf die Beeinflussung der T-Zell-Reaktivität durch das Milieu des infarzierten Herzens eingegangen. Tiere, Material und Methoden: Es wurden Kardiomyosin-spezifische Thy1.1+ CD4+ T- Helfer-Zellen (TCR-M) in gesunde Thy1.2+ Wildtyp-BALB/c- und transgene Do11.10- Empfängermäuse transferiert. Einen Tag später wurde durch die Ligatur eines Herzkranzgefäßes ein permanenter Infarkt ausgelöst. An Tag 7 post operationem wurden die Qualität des Heilungsvorganges und die Herzfunktion mittels Echokardiographie beurteilt. An Tag 7 und 49 post operationem wurden die Organe (Herz, Mediastinallymphknoten, Kniefaltenlymphknoten und Milz) entnommen und das T-Zellkompartiment, sowie dessen organspezifische Abundanz mittels Durchflusszytometrie und Light-Sheet Flourescence Microscopy (LSFM) charakterisiert. Die Experimente wurden mit 3-23 Mäusen pro Gruppe jeweils 2-5 Mal unabhängig voneinander durchgeführt. Für die statischen Analysen wurden die Mittelwerte der Variablen mittels ungepaarter t-Tests (Vergleich zweier Mittelwerte) oder two-way ANOVA gefolgt durch die Šidák Korrektur (Vergleich von mehr als zwei Mittelwerten) verglichen. Wahrscheinlichkeitswerte von p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Ergebnisse: Durchflusszytometrie und LSFM Analysen stellten eine erhöhte Akkumulation und Aktivierung der TCR-M in Herzen infarzierter Mäuse zur Hochphase des Heilungsprozesses (Tag 7) im Vergleich zur Sham-Gruppe (Kontroll-operierte Mäusen ohne Infarkt) dar. Dieses Phänomen konnte nicht an anderen untersuchten Orten im Körper (Milz, Kniefaltenlymphknoten) festgestellt werden. In den Mediastinallymphknoten kam es sowohl unter Kontroll-, als auch Infarktbedingungen zu einer Akkumulation und Aktivierung der TCR-M, was auf konstitutiv ablaufende autoimmune Prozesse hindeutet. In der chronischen Heilungsphase (Tag 49) verteilte sich diese Zellpopulation gleichmäßig auf die untersuchten Organe, was für eine selbstlimitierende Autoreaktivität post-EMI der T-Zellen spricht. Bemerkenswerterweise differenzierten transferierte TCR-M, die in ihren Spendertieren pathogen wirken und eine letale Autoimmunmyokarditis auslösen, in infarzierten Mäusen zu regulatorischen T-Zellen. Dort agieren sie kardioprotektiv, was letztendlich zum Erhalt der echokardiographisch erhobenen Herzfunktionsparameter führte. Schlussfolgerung: Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern Evidenz für die ursächliche Rolle des herzspezifischen Antigens Kardiomyosin in der postinfarziellen T-Zell-Reaktivität. Weiterhin wird der determinierende Einfluss des Infarktkontextes unabhängig von Antigenspezifität demonstriert. Dieser polarisiert T-Helfer-Zellen in ihrer Funktion zu regulatorischen T-Zellen und führt zu einer protektiven und heilungsförderlichen Autoimmunantwort.
:1. Einleitung - 1 2. Literaturübersicht und Zielstellung - 3 2.1. Der Myokardinfarkt - 3 2.2. Pathophysiologie des Myokardinfarktes - 4 2.3. T-Zellen - 10 2.3.1. Die funktionelle Rolle der T-Zellen - 10 2.3.2. Konventionelle T-Zellen - 11 2.3.3. Regulatorische T-Zellen - 14 2.3.4. Der T-Zell-Rezeptorkomplex - 16 2.3.5. Genesis und Toleranz des T-Zell Kompartiments - 19 2.3.6. T-Zellen im Myokardinfarkt - 22 2.4. Antigenspezifität und Autoimmunität im Myokardinfarkt - 23 2.5. Zielstellung der Studie - 24 3. Material und Methoden - 25 3.1. Versuchsaufbau - 25 3.2. Versuchstiere - 25 3.3. Organentnahmen - 26 3.4. Adoptiver CD4+ T-Zell Transfer - 26 3.5. Fluorescence-Activated Cell Sorting - 27 3.6. Experimenteller Herzinfarkt - 31 3.7. Echokardiographie - 33 3.8. Light-Sheet Fluorescence Microscopy - 35 3.9. Statistische Analysen - 35 4. Ergebnisse - 36 4.1. TCR-M Akkumulation post-EMI in med-LN und Herz - 36 4.2. TCR-M Aktivierung und Differenzierung zu Tregs post-EMI - 40 4.3. Kardioprotektion post-EMI durch TCR-M in DO11.10-Empfängertieren - 43 5. Diskussion - 46 5.1. Wahl des Kandidatenantigens - 46 5.2. Kritische Betrachtung der Analysemethoden - 47 5.3. Interpretation der Daten - 48 5.4. Vergleich der Tiermodelle - 52 5.5. Vergleich der chirurgischen Modelle - 53 5.6. Belastungseinschätzung - 54 6. Zusammenfassung - 56 7. Summary - 58 8. Literaturverzeichnis - 60 9. Danksagung - 74

We determined in a rat model (1) the presence and dynamics of alloantibodies recognizing MHC complexes on quiescent Brown-Norway (BN) splenic cells in the sera of Lewis (LEW) recipients of Brown-Norway iliolumbar vein grafts under tacrolimus immunosuppression; and (2) the presence of immunoglobulins in the wall of acute rejected vein allografts.

CD4+-T-Helferzellen sind in großer Zahl in der entzündeten Synovialmembran bei rheumatoider Arthritis (RA) sowie in Arthritismodellen vorhanden und spielen mit großer Wahrscheinlichkeit eine bedeutende Rolle in der Pathogenese von Arthritiden. Bei der präventiven Behandlung mit drei verschiedenen Anti-CD4 monoklonalen Antikörpern (mAk) im Modell der Adjuvansarthritis der Ratte (AA) wurden abhängig von dem jeweils eingesetzten mAk unterschiedliche klinische Verbesserungen beobachtet. Im Mittelpunkt der Untersuchungen stand deshalb die Suche nach Parallelen zwischen der unterschiedlichen klinischen Effizienz der Anti-CD4 mAk W3/25, OX35 (klinisch effizient) und RIB5/2 (klinisch ineffizient) bei der präventiven Therapie der AA und ihren in vitro Effekten auf TZell-Funktionen als Erklärung für die unterschiedlichen Therapieeffekte. Keine klaren Parallelen zur differentiellen klinischen Effizienz ergaben sich bei den folgenden Untersuchungen: 1.) Bestimmung der Affinitäten der mAk zum CD4-Molekül. 2.) Inhibition der Proliferation in der primären gemischten Lymphozytenkultur (1° MLC) mit CD4+-T-Zellen und CD8+-T-Zellen durch die drei mAk 3.) Beeinflussung der Produktion der Zytokine IL-2, IFNg, IL-10 und IL-4 in verschiedenen experimentellen Ansätzen (sekundäre MLC nach Anwesenheit der mAk in der 1° MLC, Kreuzvernetzung des CD4-Moleküls mittels der mAk nach bzw. vor einer Stimulation von CD4+-T-Zellen über den TZR). 4.) Einfluss der drei Anti-CD4 mAk auf die TZR-vermittelte Apoptose. 5.) Mobilisierung von intrazellulärem Kalzium durch CD4-Kreuzvernetzung mittels der mAk. 6.) Aktivität der Tyrosinkinasen p56lck und p59fyn nach CD4-Kreuzvernetzung mittels der mAk. 7) Phosphorylierung des Shc-Adaptermoleküls durch CD4-Kreuzvernetzung mittels der drei mAk. 8.) Effekte der drei mAk auf die Aktivität der Transkriptionsfaktoren NF-AT und AP-1. Dagegen ergaben sich bei den Untersuchungen zur Produktion von TNFa und zur Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-kB eindeutige Parallelen zur differentiellen klinischen Effizienz: 1.) Die Kreuzvernetzung des CD4-Moleküls mittels des mAk RIB5/2 nach bzw. vor einer Stimulation von CD4+-T-Zellen über den TZR induzierte eine signifikant höhere Sekretion von TNFa als mit den mAk W3/25 und OX35. 2.) Die Kreuzvernetzung des CD4-Moleküls mittels des mAk RIB5/2 vor einer Stimulation von CD4+-T-Zellen über den TZR führte zu einer signifikant stärkeren Erhöhung der Aktivität von NF-kB als mit den mAk W3/25 und OX35. Beide differentiellen Effekte könnten daher die Erklärung für die unterschiedliche klinische Effizienz der drei Anti-CD4 mAk darstellen.

Colitis ulcerosa (CU) und Morbus Crohn (MC) zählen zur Gruppe der chronischen Darmerkrankungen (CED). Im Gegensatz zu CU lässt sich bei MC eine transmurale Entzündung und eine Ummantelung des entzündeten Dünndarms mit mesenterialen Fettgewebe, dem sogenannten “creeping fat”, feststellen. In dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Mechanismen der Immunregulation in der Pathogenese von CED untersucht: 1) Der SOCE-Signalweg (store-operated Ca2+ entry) stellt eine wichtige Signalkaskade dar, die die Aktivierung von T-Zellen steuert. Wir haben die Auswirkung einer pharmakologischen Blockade von SOCE auf die Funktion von Immunzellen untersucht, die aus der intestinalen Mukosa therapierefraktärer CED-Patienten isoliert wurden. Anschließend konnten wir die Sicherheit einer systemischen Verabreichung von SOCE-Inhibitoren in vivo im einem murinen IBD-Modell bestätigen und zeigen, dass die Blockade von SOCE eine therapeutische Option für die Behandlung von CED darstellen könnte. 2) Darüber hinaus untersuchten wir, ob das Fehlen von Fettgewebe eine entzündungsfördernde oder -hemmende Rolle bei der Entstehung von CED spielt. Daher wurde die Zusammensetzung des mukosalen Immunsystems sowie die Funktion der intestinalen Epithelbarriere in einem Mausmodell mit Adipozytenatrophie sowohl im steady-state als auch nach induzierter Kolitis verglichen. Wir konnten zeigen, dass eine Fettgewebsatrophie vor dem Ausbruch einer Kolitis schützt, und führte zu einer erhöhten Resistenz der intestinalen Barriere. Schließlich verglichen wir die Merkmale des lipoatrophischen Mausmodells mit denen eines seltenen Patienten mit erworbener Lipodystrophie und MC und kamen zu dem Schluss, dass die chirurgische Resektion von mesenterialen Fettgewebes für Patienten mit einem MC, bei denen eine intestinale Resektionen durchgeführt wird, sinnvoll sein könnte. / Inflammatory bowel disease (IBD) is a group of chronic intestinal autoimmune disorders, including ulcerative colitis (UC) and Crohn's disease (CD). In contrast to UC, CD is characterized by transmural inflammation and mesenteric adipose tissue wrapping the inflamed small intestine, known as "creeping fat." Despite all currently available drug therapies, treating IBD remains a major challenge, underlying the necessity of identifying new therapeutic targets. In this work, two different mechanisms of immune regulation in the pathogenesis of IBD were investigated: First, because the store-operated Ca2+ entry (SOCE) signaling pathway is a crucial Ca2+ signaling cascade for T cell activation, we investigated the effect of pharmacological SOCE-blockade on intestinal immune cells isolated from therapy refractory IBD patients. Subsequently, we confirmed the efficacy and safety of systemic administration of SOCE inhibitors in vivo in an IBD murine model, demonstrating that the blockade of SOCE may represent a therapeutic option for treating IBD. Second, we investigated whether adipose tissue plays a pro- or anti-inflammatory role in the development of IBD. Therefore, we characterized the mucosal immune system and intestinal epithelial barrier in a murine model affected by adipocyte atrophy both at steady-state and after induction of colitis. We demonstrated that lipodystrophy protected against the onset of colitis and increased intestinal barrier resistance. Finally, we compared the lipoatrophic mouse model with a rare patient with acquired generalized lipodystrophy and CD, concluding that adipokines might play a pro-inflammatory role in IBD. Therefore, we suggest that surgical resection of mesenteric adipose tissue in CD patients might be a beneficial intervention in patients undergoing bowel resection.

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In dieser Arbeit wurde die Expression von XCR1 in B6XCR1lacZ+/+ Reporter Mäusen charakterisiert, die β-Galaktosidase unter der Kontrolle des XCR1-Promotors exprimieren. In Gewebeschnitten konnten wir zeigen, dass eine starke XCR1-Expression nur in lymphatischen Organen wie Milz, Lymphknoten und Thymus nachweisbar ist. In der Milz fanden sich XCR1+ Zellen vor allem in der Marginal Zone, aber auch in der roten Pulpa und der T-Zell-Zone. Durchflusszytometrische Analysen zeigten, dass XCR1 in der Milz ausschließlich von dendritischen Zellen DZ exprimiert wird, hauptsächlich von der CD8+DZ Subpopulation aber auch von einer Minderheit der CD4−CD8−DZ. In vivo migrierten diese XCR1+ Zellen nach Applikation von chemotaktischen oder inflammatorischen Substanzen: Die Injektion sowohl einer ATAC-sezernierenden Zelllinie als auch von LPS lösten nach 3-9 h eine Translokation der XCR1+Zellen in die T-Zell-Zone der Milz aus. Untersuchungen der Phagozytose-Aktivität ergaben, dass nur XCR1+CD8+DZ, aber keine anderen DZ Subpopulationen, injizierte allogene Zellen aufnahmen, und dass eine Transfektion dieser Zellen mit ATAC diese Phagozytose signifikant verstärkte. Daher konnten wir allogene Zellen, die intrazellulär Ovalbumin OVA exprimierten, für die selektive Applikation von Antigen auf XCR1+DZ verwenden. Diese selektive Antigen-Applikation induzierte eine starke antigenspezifische zytotoxische Antwort von endogenen T-Zellen, ohne dass es zur Produktion von OVA-spezifischen Antikörpern kam. In Abwesenheit von ATAC war diese endogene zytotoxische Aktivität verringert. Durch adoptivem Transfer und Aktivierung von Wildtyp- oder ATAC-defizienten OVA-spezifischen transgenen CD8+TZellen konnten wir bestätigen, dass ATAC für die Erzeugung einer optimalen zytotoxischen Antwort benötigt wird. Die selektive Applikation von Antigen auf CD8+DZ stellt daher eine vielversprechende Strategie dar, um optimierte Vakzinierungs-Ansätze für die Auslösung einer zytotoxischen Immunantwort zu entwickeln / The G protein-coupled receptor XCR1 has been described as the sole receptor for the chemokine ATAC. As contradictory data were published on the expression pattern of XCR1, its role in the immune system has not yet been defined. In this work, expression of XCR1 was characterized in B6.XCR1 lacZ+/+ reporter mice which express β galactosidase under the control of the XCR1 promoter. In tissue sections, strong expression of XCR1 was only detected in lymphoid organs like spleen, lymph nodes and thymus. In the spleen, XCR1+ cells were mainly found in the marginal zones, but also in the red pulp and the T cell zones. Flow cytometric analysis demonstrated exclusive expression of XCR1 on DC, mainly on the CD8+ DC subset, but also on a minority of CD4− CD8− DC. In vivo, these XCR1+ cells migrated in response to chemotactic or inflammatory stimuli: application of either an ATAC-expressing cell line or LPS induced within 3 9 h the translocation of XCR1+ cells to the T cell area of the spleen. When tested for phagocytic capacity, XCR1+ CD8+ DC, but not other DC subsets, specifically took up injected allogeneic cells, and transfection of these cells with ATAC significantly enhanced their endocytosis by XCR1+ CD8+ DC. Thus, we could employ allogeneic cells expressing OVA intracellularly to target antigen selectively to XCR1+ DC. This antigen targeting induced a strong antigen-specific cytotoxic response by endogenous T cells without a generation of OVA-specific antibodies. In the absence of ATAC, the endogenous cytotoxic activity was markedly diminished. Adoptive transfer and activation of wild type or ATAC-deficient OVA-specific CD8+ transgenic T cells confirmed that ATAC is required for the generation of an optimal cytotoxic response. Targeting of antigen to CD8+ DC via XCR1 may thus be a promising strategy for the development of new vaccination approaches aimed at optimizing the induction of cytotoxic T cells.

Ein wichtiges Merkmal der normalen Schwangerschaft ist die Toleranz des mütterlichen Immunsystems gegenüber den fremden fetalen Antigenen. Regulatorische T-Zellen (Treg-Zellen) steigen während der frühen Schwangerschaft an und leisten einen entscheidenden Beitrag zur fetalen Toleranz. Allerdings sind die genauen Mechanismen ihres Anstieges und ihrer Wirkungsweise noch weitgehend ungeklärt. Erste Untersuchungen zeigten, dass die Anzahl an Treg-Zellen in der empfänglichen Phase des Estruszyklus in der Maus am höchsten war. Es kann vermutet werden, dass die erhöhte Anzahl an Treg-Zellen zum Zeitpunkt der Insemination eine frühe Erkennung von väterlichen Antigenen begünstigt und somit zur Vorbereitung des mütterlichen Immunsystems auf die Implantation des Embryos beiträgt. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass Alloantigene im Ejakulat den frühen Anstieg der Treg-Zellen in der Schwangerschaft bedingen und dass das in der Samenblasenflüssigkeit enthaltene Zytokin TGF-beta die Expansion der Treg-Zellen unterstützt. Diese Ergebnisse befürworten eine Alloantigen-vermittelte Expansion der Treg-Zellen während der frühen Schwangerschaft, die darüber hinaus durch TGF-beta begünstigt wird. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ebenfalls belegt werden, dass das Schwangerschaftshormon hCG einen entscheidenden Einfluss auf die Treg-Zellen im Verlauf der Schwangerschaft ausübt. Untersuchungen unter Verwendung von menschlichem Probenmaterial konnten deutlich zeigen, dass hCG die Migration von Treg-Zellen zu Trophoblasten vermittelt und zur Konvertierung von konventionellen T-Zellen in Treg-Zellen beiträgt. Darüber hinaus konnten Versuche im Mausabortmodell zeigen, dass die Applikation von hCG die Expansion und Funktion der Treg-Zellen entscheidend beeinflusst, wodurch das Auftreten von Aborten in Abortweibchen verhindert werden konnte. HCG vermittelt demnach die Generierung, Migration und Funktion der Treg-Zellen und trägt entscheidend zum erfolgreichen Verlauf der Schwangerschaft bei. / Normal pregnancy is characterized by the generation of maternal immune tolerance towards the foreign fetal antigens. Regulatory T cells (Treg cells) have been shown to increase in number during early pregnancy stages and to be essential for the establishment of fetal tolerance. However, the mechanisms and factors supporting their increase and function are not well defined. First investigations showed that Treg cells accumulated in the sexually receptive phase of the murine estrous cycle. Thus, it can be assumed that the accumulation of Treg cells around the time of insemination favours early recognition of paternal antigens and thereby prepares the maternal immune system for the implantation of the blastocyst into the maternal endometrium. Experiments investigating the increase of Treg cells during early pregnancy suggest that alloantigens present in the ejaculate mediated early Treg cell augmentation. Moreover TGF-beta, which represents a major component in the seminal fluid, provoked the proliferation of Treg cells. These results suggest that the early expansion of Treg cells is alloantigen-mediated and that seminal fluid-derived TGF-beta is involved in this expansion. Additionally it has been shown that the pregnancy hormone human Chorionic Gonadotropin (hCG) has an important impact on Treg cells during pregnancy. By using human samples it has been proven that hCG mediates the migration of Treg cells to trophoblast cells and supports the conversion of naïve T cells into Treg cells directly at the fetal-maternal interface. In mice, the application of hCG resulted in an increase in the number and function of Treg cells and thereby prevented abortion in a mouse abortion-prone model. Thus, hCG mediates the generation, migration and function of Treg cells and contributes to a successful pregnancy outcome.

Während der letzten 10 Jahre, wurden viele neue immunsuppremierende Medikamente für die Verbesserung des Kurzzeit-Transplantationsergebnisses entwickelt (Halbwertzeit bzw. Abstoßung einer Niere nach ca. 10-12 Jahren). Das heutige therapeutische Ziel besteht auf der einen Seite aus der Minimierung der Kosten bzw. der Minimierung der Nebenwirkungen verursacht durch die Immunsuppressiva und auf der anderen Seite der Verbesserung des Langzeit-Überleben eines Transplantates. Um eine dosis-abhängige Zerstörung des Transplantates durch die Immunsuppressiva zu vermeiden, bedarf es der spezifischen Entwicklung von zusätzlichen Toleranzprotokollen. Ein Top-Kandidat für die Toleranzinduktion in Transplantationen stellen die CD4+CD25high regulatorischen T Zellen dar. Da humane regulatorische T Zellen jedoch nur 1-2 % der peripheren CD4+ T Zellen repräsentieren, ist es nicht möglich ausreichende Zellmengen auf zu reinigen. Dazu ist die Etablierung adäquater Protokolle für die Isolation und ex vivo Expansion von CD4+CD25high Treg’s notwendig. In unserem System ist es uns möglich die CD4+CD25high zellen mit einer sehr hohen Reinheit zu isolieren ( ca. 80% CD4+CD25highFoxp3+). Danach werden die isolierten Treg’s mit verschiedenen Protokollen, wie der Expansion mit CD2-,CD3- und CD28 Expansionbeads oder allogenen Feederzellen, expandiert. Das suppressive Potential der expandierten CD4+CD25+ Treg’s wurde in drei funktionellen Assays, einem CFSE-basierenden Proliferationsassay, einem Cytokin-Bead-Array und einem Elispot bestimmt. Basierend auf den genannten Methoden wurde das Proliferationspotential allogen stimulierter Responder T Zellen, die IFNg Produktion und das Th1/TH2 Cytokinprofil in einer gemischten Lymphozytenreaktion mit unterschiedlichen Mengen der expandierten Treg’s untersucht Ein weiterer Aspekt dieses Projektes ist die Expansion isolierter regulatorischer T Zellen mit zusätzlichem Rapamycin. Das immunsuppremierende Medikament Rapamycin blockiert die Il2-abhängige T Zellproliferation durch die Inhibition von mTOR und induziert die Expansion regulatorischer T Zellen. / During the last decade, a broad set of immunosuppressive drugs has been developed which improve short-term transplant results (1yr survival, acute graft rejection), but not long-term results (graft half life, e.g. kidney rejection after approx. 10-12 years). In this regard, the therapeutic aim is to minimise costs and long-term side effects caused by immunosuppressive drugs on the one hand, and on the other to considerably improve the long term survival of transplanted patients. To avoid dose-dependent damage of the transplant by immunosuppressive drugs, a specific development of additional tolerance protocols is mandatory. One top candidate for the tolerance induction in transplantation is the population of CD4+CD25high regulatory T cells (Treg’s). Because Tregs constitute 1-2% of peripheral CD4+ T cells in human, it may not be possible to purify sufficient cells ex vivo. Therefore it is necessary to establish appropriate protocols for isolation and expansion of CD4+CD25high Treg’s. In our system we are able to isolate CD4+CD25high cells with a very high purity (approx. 80% CD4+CD25highFoxp3+). Afterwards we expand the isolated Treg’s by different expansion protocolls such as expansion with CD3-, CD2- and CD28-expansionsbeads as well as allogeneic feedercells. The suppressive potential of the expanded CD4+CD25+ Treg’s was determined by three different functional assays, a CFSE-based proliferationassay, a Cytokine-Bead-Array, and an IFNGamma-Elispot. Based on mentioned methods, the proliferative potential of allogenic stimulated responder T cells, IFNGamma production and Th1/Th2 cytokine profile, as well as the IFNGamma producing T-cells in a mixed lymphocyte reaction with different amounts of the expanded regulatory T cells were tested. Another aspect of our project is the expansion of the isolated regulatory T cells with additional rapamycin. The immunosuppressive drug rapamycin is a powerful pharmacological agent which blocks IL2-dependent T cell proliferation by accumulation with mTOR and induces expansion of regulatory T cells.