Regulatorische T-Zellen (Tregs) spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulation atopischer Erkrankungen. Die Voraussetzungen für eine allergische Reaktionslage werden schon während der intrauterinen Entwicklung geschaffen. Über den Einfluss der intrauterinen Umgebung auf die Tregs zur Geburt ist bisher wenig bekannt. In der vorliegenden Arbeit sollte in der prospektiven Geburtskohorten-Studie LINA (Einfluss von Lebensstil und Umweltfaktoren auf das Allergierisiko Neugeborener) geklärt werden, inwiefern der Immunstatus der werdenden Mutter, eine atopische Familienanamnese sowie Umweltexpositionen während der Schwangerschaft den Immunstatus der Neugeborenen beeinflussen. Ein besonderer Schwerpunkt wurde dabei auf Tregs gelegt. Weiterhin sollte die Relevanz der Tregs zur Geburt für das Allergierisiko im ersten Lebensjahr des Kindes analysiert werden. Die Messung der Anzahl und Funktionalität der Tregs im Blut der werdenden Mutter in der 34. Schwangerschaftswoche und im Nabelschnurblut erfolgte sowohl durchflusszytometrisch in einer Subkohorte (n=24 Mutter-Kind Paare), als auch durch eine methylspezifische qPCR in der gesamten Kohorte der LINA-Studie (n=346 Mutter-Kind Paare). Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten erstmals darauf hin, dass mütterliche Tregs möglicherweise einen regulatorischen Einfluss hinsichtlich der Programmierung des fötalen Immunsystems haben (Hinz et al., Clin Exp Allergy 2010). Die durchflusszytometrische Charakterisierung der Tregs der Mutter-Kind Paare zeigte beim Vergleich der Expression von CD4, CD25, CD127 und FOXP3, dass der Anteil der CD4+CD25high Tregs im Nabelschnurblut deutlich höher war, der Anteil FOXP3 positiver Zellen innerhalb der CD4+CD25high Tregs Population war zur Geburt jedoch signifikant geringer, verglichen mit den werdenden Müttern. Weiterhin war eine geringe Anzahl mütterlicher Tregs während der Schwangerschaft und eine erhöhte Produktion der TH2-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13 mit erhöhten Gesamt-IgE-Spiegeln im Nabelschnurblut verbunden (Hinz et al., 2010). Durch die Quantifizierung der Tregs auf Basis des TSDR-Methylierungsstatus` im FOXP3 Gen, einer spezifischen und zuverlässigen Methode zum Nachweis stabiler Tregs, konnte der Zusammenhang zwischen einer Vielzahl pränataler Faktoren, Tregs zur Geburt und dem Allergierisiko in der gesamten Geburtskohorte geklärt werden (Hinz et al., Allergy 2011). Das männliche Geschlecht des Kindes, die Atopie der Eltern, Rauchen und Desinfektionsmittel-Exposition während der Schwangerschaft sowie eine erhöhte mütterliche Produktion von IFN-γ, IL-13 und IL-17E war mit einer geringeren Treg-Anzahl im Nabelschnurblut assoziiert. Für Kinder mit einer geringeren Treg-Anzahl im Nabelschnurblut war das Risiko für eine atopische Dermatitis und einer Sensibilisierung gegen Nahrungsmittelallergene im ersten Lebensjahr signifikant höher (Hinz et al., 2011).

In der vorliegenden Arbeit wurden die grundlegenden Mechanismen der Glukokortikoidtherapie bei der MS anhand des Tiermodells der MS, der EAE, untersucht. Hierzu wurde die EAE aktiv mithil-fe von MOG35-55 in C57Bl/6-Mäusen sowie GRdim- und lckGRdim-Mäusen induziert.  Zum einen sollte die Wirkung von Dexamethason auf Bystander- und Effektor-T-Zellen gesondert voneinander betrachtet werden. Hierzu sollte zunächst ein Modell etabliert werden, bei dem die GCs nur auf die Bystander- beziehungsweise nur auf die Effektor-T-Zellen wirkten. Trotz zahlrei-cher Experimente konnte kein Modell etabliert werden, dass den Ansprüchen für die Beantwor-tung der Frage genügte.  Zum anderen wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass lckGRdim-Mäuse trotz fehlender Dimerisierungs-fähigkeit des GRs und somit fehlender Apoptose-Induktion in T-Zellen auf die GC-Therapie ebenso gut ansprachen wie Kontrolltiere. Ebenso konnte dies bei reinen GRdim-Tieren beobachtet werden. Zunächst wurde mithilfe von Zellzählungen, FACS-Analysen nach Anfärben der Splenozyten mit AxV und einem Apoptose-Assay ausgeschlossen, dass es in den Tieren mit dem veränderten GR doch zu einer Induktion von Apoptose kam. So konnte bestätigt werden, dass Apoptose nicht es-sentiell für die Therapie der EAE ist. Anhand eines Proliferations-Assays konnte ebenso ausgeschlossen werden, dass GCs unspezifisch die gesamte Funktionalität der Zellen beeinflussen. Im Folgenden wurden weitere mögliche Me-chanismen der Wirkung von GCs in der EAE untersucht.  Anhand von FACS-Analysen und qPCR sowie histologischen Untersuchungen konnte gezeigt wer-den, dass die eingeschränkte Migration der Zellen in das RM nach Dex-Gabe eine wichtige Rolle zu spielen scheint. So sahen wir eine Herunterregulierung von Adhäsionsmolekülen sowie die ver-minderte Expression von einigen Zytokinen. Im Falle der Chemokine, die jedoch nur als Neben-schauplatz in dieser Arbeit betrachtet werden, konnte keine Herunterregulierung von RANTES in GRdim-Tieren beobachtet werden. Andere Publikationen geben jedoch Hinweise darauf, dass auch die Beeinflussung der Chemokine entscheidend am Mechanismus der GC-Therapie beteiligt ist.   Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass Transaktivierungsprozesse, im Speziellen die Induktion von Apoptose, keinen entscheidenden therapeutischen Effekt von Dex darstellen. Der tatsächliche Mechanismus konnte auch im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt wer-den. Durch die Versuche an GRdim-Tieren gibt es jedoch entscheidende Hinweise darauf, dass vor allem repressive Effekte als Wirkungsmechanismus der Kortisontherapie entscheidend sind. Hierzu zählen zum Beispiel die verminderte Expression von Adhäsionsmoleküle sowie die verminderte Ausschüttung von Zytokinen bzw. Sekretion von Chemokinen. Zusammengenommen also Prozes-se, die die Migration von T-Zellen ins ZNS beeinflussen und steuern.  Dieser Aspekt hat eine große Bedeutung für die Therapie der MS, da gerade die Gene, die durch Transaktivierung induziert werden, zu den unerwünschten Nebenwirkungen der Therapie führen. Da diese keine Bedeutung in der Wirksamkeit der GC-Therapie zu haben scheinen, könnten Medi-kamente entwickelt werden, die selektiv die Gene, die durch Transrepression aktiviert werden, ansteuern. Dies würde ein großes Benefit für MS-Patienten nach sich ziehen, die im Rahmen der notwendigen Therapie ihrer Erkrankung mit teilweise gravierenden Nebenwirkungen zu kämpfen haben.

Dendritic cells (DC) constitute a heterogeneous leukocyte population having in common a unique capacity to induce primary T cell responses and are therefore most attractive candidates for immunomodulatory strategies. Two populations of blood DC (CD11c+ CD123dim and CD11c– CD123high) have been defined so far. However, their direct isolation for experimental purposes is hampered by their low frequency and by the lack of selective markers allowing large scale purification from blood. Here we describe the monoclonal antibody (mAb) M-DC8, which was generated by immunizing mice with highly enriched blood DC. This mAb specifically reacts with 0.2–1% of blood leukocytes and enables their direct isolation by a one-step immunomagnetic procedure from fresh mononuclear cells. These cells can be differentiated from T cells, B cells, NK cells and monocytes using lineage-specific antibodies. M-DC8+ cells express HLA class II molecules, CD33 and low levels of the costimulatory molecules CD86 and CD40. Upon in vitro culture M-DC8+ cells spontaneously mature into cells with the phenotype of highly stimulatory cells as documented by the upregulation of HLA-DR, CD86 and CD40; in parallel CD80 expression is induced. M-DC8+ cells display an outstanding capacity to present antigen. In particular, they proved to be excellent stimulators of autologous mixed leukocyte reaction and to activate T cells against primary antigens such as keyhole limpet hemocyanin. Furthermore, they induce differentiation of purified allogeneic cytotoxic T cells into alloantigen-specific cytotoxic effector cells. While the phenotypical analysis reveals similarities with the two known blood DC populations, the characteristic expression of Fc=γRIII (CD16) and the M-DC8 antigen clearly defines them as a novel population of blood DC. The mAb M-DC8 might thus be a valuable tool to determine circulating DC for diagnostic purposes and to isolate these cells for studies of antigen-specific T cell priming. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Gegenstand dieser Arbeit ist die Herstellung funktioneller Polymerpartikel und deren Nutzung für biomedizinische Applikationen. Die Anwendungsgebiete der resultierenden Hybridmaterialien reichen vom Einsatz als Kontrastmittel in bildgebenden Verfahren der medizinischen Diagnostik über die Verwendung als Antimikrobium bis hin zum Einsatz als „Werkzeug“ zur Zellisolierung und aktivierung. Dazu wurden kompakte Latexpartikel und sensitive, poröse Mikrogelpartikel mittels emulgatorfreier Heterophasenpolymerisation synthetisiert. Als funktionelles Monomer wurde Glycidylmethacrylat verwendet, über dessen reaktive Epoxygruppen anschließend weitere Moleküle angebunden werden können. Die Funktionalisierung der Polymerpartikel erfolgte einerseits mit anorganischen Nanopartikeln (dotierte Lanthanfluorid-Nanopartikel, Gold- und Silbernanopartikel) und andererseits mit Biomolekülen wie Nukleotiden und Antikörpern. Einige Verwendungsgebiete, wie die Stimulierung von Memory-T-Zellen mit Antikörper-Polymer-Konjugaten oder der Einsatz der Silberkomposite aufgrund ihrer antimikrobiellen Wirkung, wurden näher untersucht. / The aim of this work was the synthesis of functional polymeric particles and their use for biomedical purposes. The application areas of the resulting hybrid materials range from contrast agents in medical diagnostics and usage due to antimicrobial properties to “tools” for cell isolation and activation. Compact core-shell particles and porous microgel particles were prepared by surfactant-free heterophase polymerization in water. All particles contain glycidyl methacrylate whose epoxy groups are capable to bind other molecules covalently. On the one hand, polymeric particles were functionalized with inorganic nanoparticles (doped lanthanum fluoride nanoparticles, gold and silver nanopariticles) and on the other hand with biomolecules such as nucleotides and antibodies. Selected application fields like the stimulation of memory T-cells with polymer-antibody-conjugates or the use of the silver composites due to their antimicrobial activity were investigated in detail.

Langlebige Gedächtnis-CD4 T Lymphozyten spielen eine entscheidende Rolle für die Bildung, Erhaltung und Reaktivierung anderer Gedächtnislymphozyten. Im Verlauf einer Immunreaktion wandern einige antigen-erfahrene CD4 T Zellen aus den sekundär lymphoiden Organen (SLO) ins Knochenmark (KM), wo sie als professionelle Gedächtnis-CD4 T Zellen ruhen und überdauern. Es ist jedoch weitgehend unverstanden wie die Vorläuferzellen in SLO gebildet werden. Der erste Teil dieser Arbeit identifiziert aktivierte CD49b+T-bet+/CXCR3+ CD4 T Zellen der Milz als Vorläuferzellen von KM-Gedächtnis-CD4 T Zellen. Der zweite Teil der Arbeit zeigt, dass die Vorläuferzellen nach einer verstärkten Zellproliferation und längerer kognitiver Interaktion mit dendritischen Zellen während der späten Aktivierungsphase der primären Immunantwort entstehen. Die Behandlung mit einem Zytostatikum oder die späte Blockade des kostimulatorischen CD28/B7-Signalweges verhindert wiederum deren Generierung. Fluoreszenzfarbstoffmarkierungsexperimente zeigen, dass mit zunehmender Zellteilung die Expression des Chemokinrezeptors CCR7 in den Vorläuferzellen verringert ist und die Expression des Zytokinrezeptors IL-2Rb erhöht ist. CCR7 ist für die Persistenz in der T-Zellzone von SLO entscheidend, sowie IL-2Rb für das langfristige Überleben der Zellen. Der dritte Teil dieser Arbeit untersucht die Rolle von B Zellen für die Etablierung des CD4 T-Zellgedächtnisses im KM. B Zellen wirken sich in der frühen Phase einer Immunantwort negativ auf die Akkumulation von Gedächtnis CD4 T Vorläuferzellen im KM aus, beeinflussen jedoch nicht die Proliferation von aktivierten CD4 T Zellen in der Milz während der Aktivierungsphase. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern neue Einblicke in die Generierung von Gedächtnis CD4 T Zellen des KM, die für neue Ansätze zur therapeutischen Stärkung des Immungedächtnisses im Rahmen von Impfungen oder dessen Ablation bei Autoimmunerkrankungen beitragen können. / Long-lived memory CD4 T lymphocytes play a crucial role in the generation, maintenance and reactivation of other memory lymphocytes. During an immune reaction, some antigen-experienced CD4 T cells relocate from secondary lymphoid organs (SLOs) to the bone marrow (BM) and reside and rest there as professional memory CD4 T cells. However, it remains elusive how the precursors of BM memory CD4 T cells are generated in SLOs. The first part of this thesis identifies splenic CD49b+T-bet+/CXCR3+ activated CD4 T cells as the precursors of BM memory CD4 T cells. The second part of this thesis describes that precursors of BM memory CD4 T cells are generated following enhanced cell proliferation and prolonged cognate interactions with dendritic cells (DCs) during the late activation phase of a primary immune response. Treatment with a cytostatic drug or blockage of the CD28/B7 costimulatory pathway in the late activation phase in turn abrogates the generation of precursors of BM memory CD4 T cells. Fluorescent-dye labeling experiments demonstrate that the more CD49b+CXCR3+ activated CD4 T cells divide, the more they lose the expression of CCR7, a chemokine receptor crucial for the persistence in the T cell zone of SLOs, and gain the expression of IL-2Rb, a cytokine receptor crucial for long-term survival. The third part of this thesis investigates the role of B cells for the establishment of resting CD4 T cell memory in the BM. B cells negatively impact the accumulation of memory CD4 T cell precursors in the BM during the early phase of an immune response but do not affect the cell division of activated CD4 T cells in the spleen during the activation phase. In sum, the results obtained in this thesis provide new insight into the generation of BM memory CD4 T cells that may help for the therapeutic strengthening of immune memory in the context of vaccination or its abolishment within the scope of autoimmune diseases.

Natürlich vorkommende regulatorische T-Zellen spielen eine entscheidende Rolle für die intestinale Immunhomöostase und Limitierung von (Auto)-Immunität. Sie exprimieren den Transkriptionsfaktor Foxp3 und an der Oberfläche die α-Kette des IL-2 Rezeptors (CD25). Im Tiermodell verhindern regulatorische T-Zellen Autoimmunopathien, Transplantatabstoßungen und entzündliche Darmerkrankungen. Da Foxp3+ regulatorische T-Zellen nur äußerst geringe Mengen an Interleukin-2 synthetisieren, sind sie auf eine adäquate Versorgung angewiesen. Konventionelle T-Zellen werden als bedeutende IL-2 Quelle für Treg-Zellen vermutet, doch über die Mechanismen und räumlich-zeitliche Dynamik der Treg-Effektor-Zellinteraktion ist bisher nur wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden Foxp3+ regulatorische T-Zellen in Mausgeweben analysiert und Zellinteraktionen mit Effektorzellen im Darm charakterisiert. Es wurde ein theoretisches Modell zur Evaluierung von Zell-Zellkontakten erarbeitet und experimentell überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass in der Akutphase einer T-Zell-induzierten Kolitis und im Kolon von gesunden Wildtyp-Mäusen Foxp3+ regulatorische T-Zellen an Ki-67+ proliferierenden T-Zellen akkumulieren. Diese Zellinteraktionen sind abhängig von Interleukin-2, da IL-2 defiziente Mäuse keine signifikanten Treg-Effektor-Zellakkumulationen aufweisen. Die Analyse der Genexpression konnte zeigen, dass Ki-67+ Zellen Interleukin-2 produzieren. Lokal sezerniertes Interleukin-2 könnte als Sensor für Entzündungsprozesse chemotaktisch auf Foxp3+ regulatorische T-Zellen wirken und die Akkumulation an proliferierenden, IL-2 produzierenden Effektorzellen bedingen. Dieser Mechanismus könnte einerseits zur lokalen Versorgung mit IL-2 dienen und gleichzeitig regulierend auf Effektorzellen in unmittelbarer Umgebung wirken. Dieser Prozess würde zur Erhaltung von regulatorischen T-Zellen in der Peripherie und zur Sicherung der intestinalen Immunbalance beitragen.:Bibliographische Beschreibung Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Charakterisierung von intestinalen Foxp3+ regulatorischen T-Zellen 1.2 Mechanismen der Treg-vermittelten Immunregulation 1.3 Zielstellung der Arbeit 2 Publikation Cell-Cell-Neighborhood Relations in Tissue Sections - A Quantitative Model for Tissue Cytometry 3 Appendix A Herleitung des Modellsystems zur Berechnung der zufälligen Kontaktwahrscheinlichkeit 4 Appendix B Automatische Bildanalyse mit CellProfiler 4.1 Einleitung 4.2 Algorithmus der histologischen Bildanalyse mit CellProfiler 4.3 Validierung der Messdaten 4.4 Zusammenfassung 4.5 Detaillierte Darstellung des CellProfiler-Algorithmus 5 Unpublizierte Experimente Die Rolle von Interleukin-2 für die Akkumulation von Foxp3+ Treg-Zellen an Ki-67+ proliferierenden Effektorzellen im Darm 5.1 Einleitung 5.2 Material und Methoden 5.2.1 Mausgewebe 5.2.2 Immunfluoreszenzfärbung 5.2.3 Laser-Mikrodissektion 5.2.4 RNA Isolation, Reverse Transkription, quantitative Real-Time PCR 5.2.5 Sequenzierung 5.3 Ergebnisse 6 Abschließende Diskussion 7 Zusammenfassung der Arbeit Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit Lebenslauf Danksagung Literaturverzeichnis

Regulatorische CD4+CD25+ T-Zellen (Tregs) stellen eine kleine Zellpopulation dar (1-5% der peripheren Blutzellen), die hauptsächlich für die Regulierung von Immunreaktionen verantwortlich ist. In der vorliegenden Arbeit wurden diese Zellen gemeinsam mit Stammzellen syngen und allogen kotransplantiert, um ihren Effekt auf das Anwachsen der Spenderzellen und die Rekonstitution der Hämatopoese nach Ganzkörperbestrahlung zu untersuchen. Es wurden humanisierte dreifach transgene Empfängermäuse (C57Bl/6-TTG) verwendet (human CD4+, murin CD4-, human HLA-DR+), wodurch sowohl bei syngener als auch bei allogener Transplantation eine Unterscheidung zwischen Spender- und Empfängerzellen möglich ist. Zunächst wurden CD4+CD25+ T-Zellen durch Separation aus Milzzellen bzw. Buffy Coats gewonnen und in vitro mittels Durchflusszytometrie und ELISpot charakterisiert. Anschließend fanden syngene und allogene Transplantationen mit einer Laufzeit von 61 Tagen statt. Überleben und Gewicht wurden täglich ermittelt und außerdem wurden wöchentlich Blutbilder erstellt und durchflusszytometrische Chimärismusanalysen (murines und humanes CD4, CD8, MHC (H2Db, H2Kd)) durchgeführt. Durch die magnetische Separation konnte die FoxP3-Expression der murinen Zellen (Transplantat) von 1,6% in der Ausgangspopulation auf 68,5% in der CD4+CD25+ Population gesteigert werden. In den ELISpot-Assays zeigten diese separierten Zellen, wie für Tregs typisch, keine Produktion von Interleukin-2. Nach syngener Transplantation (Spender: wildtyp C57Bl/6) von 2x106 Knochenmarkzellen und 1x106 CD4+CD25+ T-Zellen überlebten 100% der Tiere, wie zu erwarten war. Dabei setzte bei Tregs-kotransplantierten Tieren die Blutbildung nach bestrahlungsbedingter Leukozytopenie aufgrund bisher nicht bekannter Mechanismen früher wieder ein und der Donor-Zell-Chimärismus war an Tag 19 nach Transplantation signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Dies zeigt, dass regulatorische T-Zellen im syngenen Transplantationsmodell einen positiven Effekt auf die Akzeptanz bzw. das Anwachsen des Transplantats haben. Dieses Modell entspricht klinisch einer autologen Transplantation. Nach einer knochenmarkzerstörenden Therapie werden dem Patienten eigene Stammzellen reinfundiert, um die Blutbildung und das Immunsystem wieder in Gang zu bringen. Der Zusatz von regulatorischen T-Zellen zum autologen Stammzelltransplantat könnte das Anwachsen der Zellen beschleunigen und die gefährliche Phase der Immunsuppression, in der es häufig zu Sekundärinfektionen kommt, verkürzen. Die Transplantation der gleichen Zahl von allogenen Spenderzellen (wildtyp Balb/c) führte überraschend zum Tod aller dreifach transgenen Empfängertiere. Der Vergleich zu Experimenten mit wildtyp C57Bl/6-Empfängertieren zeigte, dass dreifach transgene Mäuse sehr viel höhere Zellzahlen im Transplantat zum Überleben benötigen (Daten nicht gezeigt). Das Ausbleiben der Blutbildung nach der Bestrahlung führte zu vermindertem Allgemeinbefinden, gestörter Futter- und Wassseraufnahme und Exsikkose bis zum Tod bzw. aus Tierschutzgründen zur Euthanasie. Durch Erhöhung der Zellzahl im Transplantat auf 1x107 Knochenmark + 5x106 Milzzellen überlebten 25% der Mäuse, bei 3x107 Knochenmark + 5x106 Milzzellen waren es 50%. Anders als im syngenen Modell führte die Kotransplantation 1,5x106 allogener CD4+CD25+ T-Zellen zu 3x107 Knochenmark + 5x106 Milzzellen zum Versterben der Tiere. Dies verdeutlicht, dass regulatorische T-Zellen in diesem allogenen Transplantationsmodell das Anwachsen des Transplantats behindern (Transplantatversagen). Hier gilt es zu klären, ob dieser Effekt spezifisch für die gewählten Mausstämme ist und welche Mechanismen für das Transplantatversagen verantwortlich sind. In einem dreifach transgenen Mausmodell konnte ein positiver Effekt von regulatorischen T-Zellen auf die Rekonstitution der Hämatopoese bei syngener Kotransplantation nachgewiesen werden. Im allogenen Transplantationsmodell hingegen führte die Kotransplantation CD4+CD25+ T-Zellen zum Versterben der Empfänger. Der beschriebene und schon publizierte positive Effekt spenderspezifischer Tregs zur Behandlung von Graft versus Host Disease nach allogener Stammzelltransplantation widerspricht diesen Ergebnissen nicht, da es bei diesen Patienten schon zum Engraftment von hämatopoetischen Stammzellen gekommen ist. Dies hat weitreichende Konsequenzen für die therapeutische Anwendung regulatorischer T-Zellen bei hämatologischen Erkrankungen in der Human- und Veterinärmedizin. / Regulatory CD4+CD25+ T cells (Tregs) represent a small cell population (1-5% of peripheral blood cells) mainly responsible for the regulation of the immune system. In the present work, these cells were cotransplanted with syngeneic and allogeneic stem cells in order to analyze the effect of Tregs on the reconstitution of hematopoiesis after total body irradiation. Humanized triple transgenic hosts (C57Bl/6-TTG) (human CD4+, murine CD4-, human HLA-DR+) were applied allowing differentiation of donor and host cells in syngeneic and allogeneic transplantation settings. Murine and human CD4+CD25+ T cells were magnetically separated out of splenocytes or buffy-coats and characterized in vitro by means of flow cytometry and ELISpot. Afterwards syngeneic and allogeneic transplantation experiments were performed for a period of 61 days. Survival and weight were assessed daily and once a week blood parameters and chimerism analyses (murine and human CD4, CD8, MHC (H2Db/ H2Kd)) were carried out. FoxP3 expression increased from 1,6% in the initial murine cell fraction to 68,5% in the separated CD4+CD25+ T cells. ELISpot assays showed the typical lack of interleukin 2 production of Tregs. After syngeneic transplantation (donor: wildtype C57Bl/6) of 2x106 bone marrow cells and 1x106 CD4+CD25+ T cells, 100% of mice survived what was to be expected. Cotransplanted animals showed earlier reconstitution of hematopoiesis after leukocytopenia and significant higher donor-cell-chimerism on day 19 after transplantation. The mechanisms for this positive effect of Tregs in syngeneic transplantation on the engraftment have to be investigated. This model clinically correspond an autologous transplantation where patients are treated with their own stem cells after a myeloablative treatment (chemotherapy or irradiation). The addition of regulatory T cells to the transplant could accelerate the engraftment and shorten the risky period of immunosuppression. Injection of the same numbers of allogeneic cells (donor: wildtype Balb/c) did not preserve hosts from mortality. Compared to experiments with wildtype recipients, results showed that triple transgenic mice need much higher cell numbers in the transplant for survival (data not shown). The failure of hematopoiesis after irradiation led to reduced general condition, disordered ingestion and exsikkosis leading to death respectively to euthanasia for reasons of protection of animals. By scaling up the cell number in the inoculum to 1x107 bone marrow cells + 5x106 splenocytes 25% of mice survived, with 3x107 bone marrow cells + 5x106 splenocytes survival was 50%. In contrast to syngeneic experiments, cotransplantation of 1,5x106 allogeneic CD4+CD25+ T cells and 3x107 bone marrow cells + 5x106 splenocytes did not prevent animals from mortality. In this allogeneic transplantation model Tregs restrain engraftment (graft failure). It has to be clarified if this effect is specific for the utilized mouse strains and which mechanisms are responsible for the graft failure. In the syngeneic triple transgenic mouse model cotransplantation of CD4+CD25+ T cells showed a positive effect on reconstitution of hematopoiesis after irradiation. In the allogeneic setting however cotransplantation of allogeneic regulatory T cells avoided the engraftment of transplanted cells. The described and published effect of donor-specific Tregs for treatment of graft versus host disease after allogeneic transplantation does not contradict the presented results because treated patients already possessed engrafted hematopoietic stem cells. The results have wide consequences for the therapeutic appliance of regulatory T cells in hematological diseases in human and veterinary medicine.

Regulatorische T-Zellen (Tregs) spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulation atopischer Erkrankungen. Die Voraussetzungen für eine allergische Reaktionslage werden schon während der intrauterinen Entwicklung geschaffen. Über den Einfluss der intrauterinen Umgebung auf die Tregs zur Geburt ist bisher wenig bekannt. In der vorliegenden Arbeit sollte in der prospektiven Geburtskohorten-Studie LINA (Einfluss von Lebensstil und Umweltfaktoren auf das Allergierisiko Neugeborener) geklärt werden, inwiefern der Immunstatus der werdenden Mutter, eine atopische Familienanamnese sowie Umweltexpositionen während der Schwangerschaft den Immunstatus der Neugeborenen beeinflussen. Ein besonderer Schwerpunkt wurde dabei auf Tregs gelegt. Weiterhin sollte die Relevanz der Tregs zur Geburt für das Allergierisiko im ersten Lebensjahr des Kindes analysiert werden. Die Messung der Anzahl und Funktionalität der Tregs im Blut der werdenden Mutter in der 34. Schwangerschaftswoche und im Nabelschnurblut erfolgte sowohl durchflusszytometrisch in einer Subkohorte (n=24 Mutter-Kind Paare), als auch durch eine methylspezifische qPCR in der gesamten Kohorte der LINA-Studie (n=346 Mutter-Kind Paare). Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten erstmals darauf hin, dass mütterliche Tregs möglicherweise einen regulatorischen Einfluss hinsichtlich der Programmierung des fötalen Immunsystems haben (Hinz et al., Clin Exp Allergy 2010). Die durchflusszytometrische Charakterisierung der Tregs der Mutter-Kind Paare zeigte beim Vergleich der Expression von CD4, CD25, CD127 und FOXP3, dass der Anteil der CD4+CD25high Tregs im Nabelschnurblut deutlich höher war, der Anteil FOXP3 positiver Zellen innerhalb der CD4+CD25high Tregs Population war zur Geburt jedoch signifikant geringer, verglichen mit den werdenden Müttern. Weiterhin war eine geringe Anzahl mütterlicher Tregs während der Schwangerschaft und eine erhöhte Produktion der TH2-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13 mit erhöhten Gesamt-IgE-Spiegeln im Nabelschnurblut verbunden (Hinz et al., 2010). Durch die Quantifizierung der Tregs auf Basis des TSDR-Methylierungsstatus` im FOXP3 Gen, einer spezifischen und zuverlässigen Methode zum Nachweis stabiler Tregs, konnte der Zusammenhang zwischen einer Vielzahl pränataler Faktoren, Tregs zur Geburt und dem Allergierisiko in der gesamten Geburtskohorte geklärt werden (Hinz et al., Allergy 2011). Das männliche Geschlecht des Kindes, die Atopie der Eltern, Rauchen und Desinfektionsmittel-Exposition während der Schwangerschaft sowie eine erhöhte mütterliche Produktion von IFN-γ, IL-13 und IL-17E war mit einer geringeren Treg-Anzahl im Nabelschnurblut assoziiert. Für Kinder mit einer geringeren Treg-Anzahl im Nabelschnurblut war das Risiko für eine atopische Dermatitis und einer Sensibilisierung gegen Nahrungsmittelallergene im ersten Lebensjahr signifikant höher (Hinz et al., 2011).:Bibliografische Beschreibung II Abkürzungsverzeichnis IV 1. Einleitung 1 1.1. Hintergrund der Untersuchungen 1 1.2. Historischer Hintergrund/Definition „Allergie“ 1 1.3. T-Zellpopulationen mit Relevanz für die Entwicklung allergischer Erkrankungen 2 1.4. Regulatorische T-Zellen 5 1.5. Bedeutung des Immunstatus zur Geburt - prädiktive Marker für die Allergieentstehung 8 1.6. Ursachen der frühkindlichen Allergieentstehung – genetische Prädisposition und pränatale Umgebung 10 1.7. Die LINA-Studie 13 2. Zielstellung 15 3. Originaldateien 16 4. Diskussion 34 4.1. Unterschiede im Phänotyp und der Funktion der Tregs in der Schwangerschaft und zur Geburt 36 4.2. Zusammenhang zwischen dem Immunstatus der werdenden Mutter und dem des Kindes zur Geburt 37 4.3. Geschlechtsspezifische Unterschiede in der Anzahl der Tregs zur Geburt 41 4.4. Zusammenhänge zwischen der familiären Prädisposition und der Anzahl der Tregs im Nabelschnurblut 42 4.5. Zusammenhänge zwischen Umweltfaktoren während der Schwangerschaft und der Anzahl der Tregs im Nabelschnurblut 44 4.6. Zusammenhang zwischen der Anzahl der Tregs zur Geburt, Sensibilisierung und allergischen Erkrankungen im ersten Lebensjahr des Kindes 46 4.7. Stärken und Schwächen der Untersuchungen 47 5. Zusammenfassung 49 6. Literaturverzeichnis 52 Anlage – Supplemental Materials 66 Hinz et al., Clin Exp Allergy 2010 66 Hinz et al., Allergy 2011

Verstärkte Anstrengungen zur Förderung der T-Zell-basierten Immunität haben eine zwingende Notwendigkeit für unser Verständnis der menschlichen T-Zell-Funktion und –Erhaltung geschaffen. Das Paradigma, dass Gedächtnis-T-Lymphozyten kontinuierlich durch den Körper zirkulieren wurde vor kurzem durch die Entdeckung der Gedächtnis-T-Zellen, die in einer Vielzahl von Geweben, einschließlich des Knochenmarks angesiedelt sind, herausgefordert. Allerdings bleibt der Unterschied zwischen Funktionsweise von zirkulierenden und gewebeansässigen Gedächtnis-T-Zellen nur unzulänglich verstanden. Die Knochenmark ist die Heimat für eine große Anzahl Gedächtnis-T-Zellen. CD4+ Gedächtnis-T-Zellen aus dem Knochenmark beinhalten ein breites Spektrum an Antigenspezifitäten. Interessanterweise wurden CD4+ Gedächtnis-T-Zellen spezifisch für systemische Kindheitsantigene im Knochenmark von älteren Menschen gefunden, auch wenn sie nicht mehr in der Blutzirkulation nachgewiesen werden konnten. Gedächtnis-T-Zellen aus dem Knochenmark sind sesshaft und ruhend und Langzeitgedächtnis gegen systemische Antigene erhalten. Sowohl der Überlebensmechanismus von Gedächtnis-T-Zellen, als auch die Kapazität von gewebsansässigen Gedächtnis-T-Zellen nach einer systemischen Herausforderung mobilisiert zu werden, sind bisher nur unzureichend geklärt. Ich habe gezeigt, dass Gedächtnis-T-Zellen aus dem peripheren Blut und Knochenmark unterschiedliche Überlebensfähigkeiten haben. Weiterhin habe ich die Rolle von Überleben Faktoren in ihrer Erhaltung identifiziert. Zudem habe ich bestimmt, dass Gedächtnis-T-Zellen aus dem Blut und Knochenmark unterschiedliche Zellpopulationen sind, mit unterschiedliche TCRβ Repertoires. Schließlich konnte ich zeigen, dass sesshafte Gedächtnis-T-Zellen, die spezifisch für systemische Antigene sind, schnell in die Blutzirkulation mobilisiert werden. Zusammenfassend bieten diese Studien ein umfassenderes Verständnis der Funktion und des Erhalts des immunologischen Gedächtnisses. / Intensified efforts to promote protective T cell-based immunity in vaccines and immunotherapies have created a compelling need to expand our understanding of human T cell function and maintenance. The paradigm that memory T lymphocytes are continuously circulating through the body in search of their cognate antigen has been recently challenged by the discovery of memory T cells residing in a variety of tissues, including the bone marrow (BM). However, the division of labor and lifestyle of circulating versus tissue resident memory T cells remains poorly understood. The human BM is home to a great number of memory T cells. BM memory CD4+ T cells contain a wide array of antigen specificities. Interestingly, memory CD4+ T cells specific for systemic childhood antigens have been found in the BM of elderly humans, even when they were no longer detectable in peripheral blood (PB) circulation. BM memory T cells are resident, resting and maintain long-term memory to systemic antigens. The survival mechanisms of circulating and BM resident memory T cells; as well as the capacities of tissue resident memory T cells to be mobilized into blood circulation after systemic antigen re-challenge to confer us with immune protection remains to be elucidated. I have shown that PB and BM memory T cells have different survival capacities, as well as identified the role of survival factors in their maintenance. Moreover, using sequencing analysis of the TCRβ repertoire, I have determined that PB and BM memory T cells are separated cell populations. Finally, by tracking the dynamics of antigen-specific memory CD4+ T cells after systemic MMR re-vaccination I could show that TRM CD4+ T cells specific for systemic antigens can be rapidly mobilized into blood circulation and contribute to the immune response. These studies provide a more comprehensive understanding of the function and maintenance of immunological memory in humans.

T Zellen können in zwei Hauptpopulationen mit unterschiedlichen Aufgaben unterschieden werden. CD4+ T Zellen exprimieren im Zuge ihrer Aktivierung CD40L, welches ein zentraler kostimulatorischer Rezeptor zur Induktion von B-Zell basierter humoraler Immunität, APC Aktivierung und einer effizienten Effektor CD8+ T Zell Entwicklung ist („Helfer-Funktion“). Im Gegensatz dazu sind die zytotoxischen CD8+ T Zellen dazu vorbestimmt, infizierte oder maligne Zellen direkt abzutöten. Jedoch wurde eine Fraktion von CD8+ T Zellen identifiziert, die nach Aktivierung CD40L exprimiert. Bisher ist nicht verstanden, wie in solchen CD8+ T Zellen a) die CD40L Expression reguliert ist, b) wann und wie die Fähigkeit CD40L zu exprimieren implementiert wird und c) was die Folgen für das Immunsystem sind. In dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass sowohl in CD4+ als auch in CD8+ T Zellen die CD40L Expression durch DNA-Methylierung regulatorischer Regionen des CD40LG Lokus reguliert wird. Die Demethylierung zentraler Elemente wird im Thymus implementiert, manifestiert sich mit der T-Zell Reifung und geht mit einer zunehmenden Stabilität der CD40L Expression einher. Erhöhte Expression von CD5 und NUR77 in CD40L+ CD8+ SP Thymozyten weisen auf eine positive Selektion mit hoher Affinität gegen Selbst-peptide während der Reifung im Thymus hin, welche das weitere Schicksal der CD40L exprimierenden CD8+ T Zellen beeinflusst. Naive CD40L+ CD8+ T Zellen besitzen ein anderes TCR Repertoire als CD40L- CD8+ T Zellen und reifen im Zuge ihrer Aktivierung bevorzugt zu Gedächtniszellen mit Zytokin- und Chemokinrezeptorprofilen von Tc2, Tc17 und Tc22 Zellen heran. Mit ihrem nicht-zytotoxischen Phänotyp und ihrer Genexpressionsignatur ähneln diese Zellen stark Helfer-CD4+ T Zellen und können von den klassisch zytotoxischen Tc1 und Tc17+1 Zellen durch ihre IL-6R und fehlende SLAMF7 Expression sowie der Expression von Markern die auf eine Fähigkeit in die Haut zu wandern schließen lassen, unterschieden werden. Zusammenfassend zeigen wir hier, dass naive CD8+ T Zellen von den frühsten Entwicklungsstadien im Thymus an nicht homogen sind und die Fähigkeiten über CD40L Expression eine Helferfunktion auszuüben beziehungsweise über die Sekretion zytolytischer Moleküle Zielzellen abzutöten unabhängig vom CD4+ or CD8+ T-Zell Status sind. Zellen mit Zytokin- und Genexpressionsignaturen, die mit denen der CD8+ Helfer-T Zellen übereinstimmen, wurden von uns und anderen in Geweben (Haut, Lunge) identifiziert und tragen zu den verschiedensten autoinflammatorischen Erkrankungen bei. Diese Arbeit insinuiert daher die Notwendigkeit einer grundlegenen Neubewertung der CD8+ T Zell Fähigkeiten und Funktionen in Immunantworten. / The T cell compartment consists of two major subsets with diverse assignments. CD4+ T cells express CD40L upon activation, a central co-stimulatory receptor to induce B cell mediated humoral immunity, activate APCs and prime efficient effector CD8+ T cell development (“helper function”). In contrast, cytotoxic CD8+ T cells are predetermined to kill infected or malignant cells directly. However, a fraction of CD8+ T cells expressing CD40L upon activation was identified. So far, it is not understood in CD8+ T cells a) how CD40L expression is regulated, b) when and how the ability of CD40L expression is implemented and c) what are the implications for the immune system. In this thesis, we found that CD40L expression is regulated by DNA-methylation of regulatory regions of the CD40LG locus in CD4+ as well as CD8+ T cells. The de-methylation of central elements is implemented in the thymus and increases with T cell maturation reflected by enhanced stability of CD40L expression. Elevated CD5 and NUR77 expression of CD40L+ CD8+ SP thymocytes suggests that high affine detection of self-peptides during positive selection in the thymus implements CD40L expression ability and predetermines the fate of the CD40L imprinted CD8+ T cells. CD40L+ naïve CD8+ T cells differ in their TCR repertoire from their CD40L- counterparts and preferentially mature into memory cell subsets with cytokine and chemokine receptor profiles of Tc2, Tc17 and Tc22 cells. With their non-cytotoxic phenotype and gene expression signatures, the CD40L+ memory CD8+ T cell subsets Tc2, Tc17 and Tc22 widely resemble helper CD4+ T cells and can be distinguished from classical cytotoxic Tc1 and Tc17+1 cells by their IL-6R and absent SLAMF7 expression and their skin migratory phenotype. Altogether, we demonstrate that from the earliest developmental stages in thymus onwards naive CD8+ T cells are not homogenous and the abilites to provide “CD40L based help” or “cytotoxicity mediated killing” are independent of the CD4+ or CD8+ T cell status. Cells with helper-type CD8+ T cell cytokine and gene-expression signatures were found at barrier sites (skin, lung) by us and others where they contribute to multiple autoinflammatory diseases. Therefore, this work insinuates the need to revisite CD8+ T cell capablities and function in immune responses.