Die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen wird durch eine Vielzahl verschiedener Faktoren verursacht, darunter gewisse Umwelteinflüsse, genetische Veranlagungen oder Virusinfektionen. So vielfältig die Ursprünge von Autoimmunerkrankungen sind, so divers sind die daraus resultierenden Erkrankungen, wodurch die Entwicklung zuverlässiger Therapien erschwert wird. Obwohl verschiedene Behandlungsmöglichkeiten existieren, welche die Symptome bei Autoimmunerkrankungen wie neuroinflammatorischer Multipler Sklerose (MS) mildern können, z.B. mit monoklonalen Antikörpern (mAk), wirken die meisten Medikamente breit und unspezifisch. Dies beeinträchtigt die Funktionalität des Immunsystems, was wiederum zu einem höheren Risiko für bakterielle und virale Infektionen, maligne Erkrankungen oder sekundäre Autoimmunität führen kann. Andere Therapieansätze untersuchen daher Möglichkeiten einer Antigen-abhängigen Immuntoleranz-Induktion. Allerdings befinden sich diese noch in den frühen Entwicklungsphasen und deren klinische Wirksamkeit muss noch bewiesen werden. Alternativ hat es sich in der onkologischen Immuntherapie als erfolgreich erwiesen, entweder natürliche oder gentechnisch veränderte Immunzellen zu aktivieren. Bisher wurden humane T-Zellen, welche mit Hilfe chimärer Antigenrezeptoren (CAR) mit ausgewählter Spezifität ausgestattet sind, sehr erfolgreich in der Klinik gegen Tumorerkrankungen genutzt. Basierend auf diesen klinischen Erfolgen stellt sich die Frage, ob CAR T-Zellen auch zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen eingesetzt werden können. Herkömmlichen CAR T-Zellen mangelt es jedoch sowohl an Flexibilität als auch an Kontrollierbarkeit, da sie mit einem CAR gegen ein einzelnes Antigen ausgestattet sind und in Gegenwart des Zielantigens dauerhaft aktiviert und nicht kontrollierbar sind. Um Limitationen konventioneller CARs zu überwinden, wurden universelle Adapter-CARs (UniCARs, RevCARs) in der Gruppe von Prof. Bachmann entwickelt. Die modulare UniCAR-Plattform besteht aus universell einsetzbaren UniCAR T-Zellen und anpassbaren antigenspezifischen Zielmodulen (TMs). Die Bindungseinheit des UniCAR basiert auf einem mAk mit Spezifität gegen ein Peptidepitop, das Teil des TMs ist und welches spezifisch an Zielantigene auf Tumorzellen bindet. Das TM fungiert als Adaptermolekül, das eine Vernetzung der UniCAR T-Zelle mit der Zielzelle herstellt. Nach der Vernetzung mit der Zielzelle über das TM wird die UniCAR T-Zelle aktiviert, so dass die Zielzelle eliminiert wird. Eine vor Kurzem vorgenommene Modifikation der extrazellulären UniCAR-Domäne führte zu der Reverse CAR (RevCAR)-Plattform, welche die Spezifität und Sicherheit noch weiter erhöhen sowie tonische Signale konventioneller CARs reduzieren soll. Dabei wurde die extrazelluläre mAk-basierte UniCAR-Domäne mit dem Peptidepitop des TM ausgetauscht. Eines der am besten untersuchten Autoantigene bei neuroinflammatorischen Erkrankungen ist das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG). Dieses Protein befindet sich ausschließlich im zentralen Nervensystem an der abaxonalen Membran der nervenschützenden Myelinscheide. Obwohl neuroinflammatorische Erkrankungen wie MS hauptsächlich durch T-Zellen verursacht werden, wurden bei MS-Patienten auch Autoantikörper gegen MOG nachgewiesen, was auf die Beteiligung autoreaktiver B-Zellen an der Verschlimmerung der Krankheit hinweist. Diese Ergebnisse werden durch die wirksame Behandlung von MS-Patienten mit anti-CD20-mAks belegt. In dieser Arbeit wurde MOG als erstes Modell-Zielantigen für das Retargeting von CAR-modifizierten T-Zellen gegen anti-MOG-Ak-exprimierende humane Zellen verwendet. Ziel dieser Arbeit war neue TMs basierend auf der extrazellulären Domäne des MOG Antigens zu entwickeln, die dazu dienen, UniCAR oder RevCAR T-Zellen zur Eliminierung von anti-MOG Ak-exprimierenden Zielzellen zu aktivieren. Zur Bestimmung des optimalen MOG-Antigen TM-Formats wurden für die UniCAR-Plattform ein monovalentes (25 kDa) und ein bivalentes MOG-Antigen TM (50 kDa) entwickelt. Die Wirksamkeit des UniCAR-Systems wurde in vitro demonstriert. Es konnte dabei gezeigt werden, dass beide TMs bereits nach einer kurzen Inkubationszeit von 8 Stunden eine TM-spezifische Lyse Anti-MOG scFv-exprimierender menschlicher Zelllinien durch UniCAR-T-Zellen vermitteln. Darüber hinaus war es möglich, das zytotoxische Potential der UniCAR-T-Zellen durch die Dosierung der TMs zu kontrollieren. Um zu überprüfen, ob der Effekt basierend auf der UniCAR-Platform gegen anti-MOG scFv-exprimierende Zielzellen noch gesteigert werden kann, wurde ein monovalentes MOG-Antigen RevTM für die RevCAR-Plattform entwickelt. In Kombination mit RevCAR-T-Zellen übertraf die Anwendung des RevTM beide UniCAR TMs hinsichtlich Bindungsaffinität und dosisabhängiger Zytotoxizität gegen zwei anti-MOG scFv-exprimierende Zelllinien in vitro. Außerdem war die Freisetzung proinflammatorischer und T-Zellwachstum-fördernder Zytokine im Vergleich zu UniCAR T-Zellen höher und ausgeprägter. Weiterhin wurde die Funktionalität des RevCAR-Systems gegen anti-MOG-scFv-exprimierende Zielzellen in vivo bewiesen. Zusammenfassend kann geschlussfolgert werden, dass die modularen Adapter-CAR T-Zell-Plattformen neben der Krebsimmuntherapie auch bemerkenswertes Potential für die Behandlung von MOG-assoziierten Autoimmunerkrankungen hat. Damit konnte ein erster Grundstein dafür gelegt werden, CAR T-Zellen auf die Anwendung in Autoimmunerkrankungen zu übertragen, um zukünftig gezielt fehlerhafte Immunzellen zu beseitigen, die nachweislich zur Verschlimmerung von Autoimmunerkrankungen beitragen.:Table of contents I List of abbreviations VI 1 Introduction 1 1.1 The human immune system 2 1.2 B cells and antibodies 3 1.2.1 Antibody structure 3 1.2.2 Tolerance induction 4 1.2.3 B cell activation 5 1.2.4 B cell functions in autoimmune diseases 6 1.3 Multiple sclerosis – an example for neuroinflammatory demyelination diseases 8 1.3.1.1 Disease phenotypes 9 1.3.1.2 Immunopathogenesis 9 1.3.2 Autoantigen myelin oligodendrocyte glycoprotein 11 1.4 Immunotherapy 14 1.4.1 Monoclonal antibody therapy 14 1.4.2 Chimeric antigen receptor therapy 16 1.4.2.1 UniCAR and RevCAR T cell system 18 1.4.2.2 CAR T cells in autoimmune diseases 22 1.5 Objectives 23 2 Materials and Methods 25 2.1 Materials 25 2.1.1 Consumables 25 2.1.2 Devices and software 27 2.1.3 Chemicals and reagents 32 2.1.4 Buffers and solutions 36 2.1.5 Enzymes and enzyme buffers 38 2.1.6 Kit systems 39 2.1.7 Plasmid vectors 39 2.1.8 Oligonucleotides 41 2.1.9 Antibodies 41 2.1.10 Basic media, additives, and recombinant proteins 43 2.1.11 Composition of culture media 44 2.1.12 Bacterial strain 46 2.1.13 Cell lines 46 2.1.14 Mouse strain 47 2.2 Methods 47 2.2.1 Molecular biological and microbiology methods 47 2.2.1.1 DNA digestion with restriction enzymes 47 2.2.1.2 Dephosphorylation of vectors 48 2.2.1.3 Agarose gel electrophoresis 48 2.2.1.4 Isolation and purification of DNA fragments from agarose gels 48 2.2.1.5 Ligation of DNA fragments 49 2.2.1.6 Heat-shock transformation of competent E. colis 49 2.2.1.7 Plasmid mini preparation 49 2.2.1.8 Plasmid midi preparation 50 2.2.1.9 Determination of DNA concentration 50 2.2.1.10 DNA sequencing 50 2.2.2 Cell biology methods 50 2.2.2.1 Cultivation of eukaryotic cells 50 2.2.2.2 Freezing and thawing cultured cells 51 2.2.2.3 Determination of cell number 52 2.2.2.4 Lentiviral transduction of eukaryotic cells 52 2.2.2.5 Immunofluorescence labeling 54 2.2.2.6 Flow cytometry and analysis of flow cytometry data 55 2.2.2.7 Isolation of human peripheral blood mononuclear cells 57 2.2.2.8 Isolation of T cells from PBMCs with magnetic-activated cell sorting 58 2.2.2.9 Stimulation of isolated human T cells 58 2.2.2.10 Engraftment of T cells with chimeric antigen receptors 59 2.2.3 Methods of protein biochemistry 59 2.2.3.1 Isolation of target module constructs 59 2.2.3.2 Dialysis of purified target module constructs 60 2.2.3.3 Discontinuous Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis 60 2.2.3.4 Determination of concentration and immunochemical detection of target module constructs 62 2.2.3.5 Determination of binding affinities of target modules using enzyme-linked immunosorbent assay 63 2.2.4 In vitro functional studies 64 2.2.4.1 T cell activation and exhaustion assay 65 2.2.4.2 Luciferase assay (cytotoxicity assay) 65 2.2.4.3 Determination of cytokine concentration 65 2.2.5 In vivo functionality studies 66 2.2.5.1 Evaluation of tumor killing in vivo 66 2.2.5.2 Optical imaging of luciferase-expressing tumors in vivo 67 2.2.6 Statistical evaluation 67 3 Results 68 3.1 Design and generation of novel MOG target modules 68 3.1.1 MOG target module constructs 68 3.1.2 Expression of target modules 69 3.2 Establishment of scFv MOG-presenting cell models 72 3.3 Binding properties of MOG target modules 74 3.3.1 Determination of binding affinity between anti-MOG antibody and MOG target modules with enzyme-linked immunosorbent assay 74 3.3.2 Determination of binding affinity between anti-MOG receptor-expressing cell lines and MOG target modules with flow cytometry 75 3.4 Generation of human CAR-expressing T cells and binding of MOG target modules 80 3.4.1.1 Genetic modification of human T cells for UniCAR expression 81 3.4.1.2 Genetic modification of human T cells for RevCAR expression 83 3.5 Redirection of UniCAR T cells in vitro 85 3.5.1 Activation of redirected UniCAR T cells 85 3.5.2 Cytokine profile of redirected UniCAR T cells 87 3.5.3 Elimination of scFv MOG-positive target cells by UniCAR T cells 89 3.5.3.1 Time-dependent retargeting of scFv MOG-positive target cells by UniCAR T cells 89 3.5.3.2 Efficacy of UniCAR target modules 91 3.6 Redirection of RevCAR T cells in vitro 92 3.6.1 Activation of redirected RevCAR T cells 92 3.6.2 Cytokine profile of redirected RevCAR T cells 95 3.6.3 Elimination of scFv MOG-positive target cells by RevCAR T cells 99 3.6.3.1 Time-dependent retargeting of scFv MOG-positive target cells using RevCAR T cells 99 3.6.3.2 Efficacy of RevCAR target module 101 3.7 Investigation of RevCAR T cell-mediated cytotoxicity in vivo 103 4 Discussion 105 4.1 Structure and purification of MOG target modules 106 4.2 Expression and purification of target modules 107 4.3 Binding properties of MOG target modules 107 4.4 In vitro cytotoxic potential of UniCAR and RevCAR T cells redirected by MOG target modules 110 4.4.1 Target module-specific redirection of UniCAR T cells to scFv MOG-expressing target cells 110 4.4.2 Target module-specific redirection of RevCAR T cells to scFv MOG-expressing target cells 112 4.5 Future prospective 116 5 Summary 119 6 Zusammenfassung 121 7 References 124 List of figures 145 List of tables 147 Acknowledgement 148

Die Arbeit beschreibt zuerst alle relevanten Grundlagen zum angeborenen und erworbenen Immunsystem. Insbesondere die anatomischen und histologischen Bestandteile und deren Funktion, sowie Blutbildung, Lymphozyten-Selektion und Interaktion der Bestandteile. Antikörperklassen und Blutzellen werden dabei ebenso tabellarisch zusammengefasst. Die ablaufenden Prozesse der angeborenen und erworbenen Immunantwort (letztere unterteilt in humoral und zellvermittelt, sowie primär und sekundär) werden näher erläutert. Ebenso wird die Antigenerkennung und die Funktionalität von B-Zellen und T-Zellen detailliert erklärt. Anschließend werden intensiv Störungen des Immunsystems wie Allergien und Immunsuppressionen beschrieben. Anhand etlicher Stoffe und Stoffklassen, wie Cyclosporin A, Thalidomid und polyhalogenierter Kohlenwasserstoffe, werden die vielfältigen Wirkmechanismen toxikologischer Substanzen auf das Immunsystem beschrieben und anschaulich dargestellt. Zuletzt wird ein Vorschlag unterbreitet, wie der Inhalt in das Toxnetz-Körpermodell eingearbeitet werden kann. Als Beispiel wurde der immunmodulierende Antikörper Pembrolizumab ausgewählt, ein Protein, welches bei der Krebstherapie eingesetzt wird und die T-Zell-Erkennung von Krebszellen wieder aktiviert.

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CD8+ T Zellen unterstützen die Beseitigung von Pathogenen und sind somit entscheidend bei der Bekämpfung von Infektionen. Neben der Antigendosis und dem inflammatorischen Zytokinemilieu hat auch die Stimulation durch den TZR einen entscheidenden Einfluss auf die CD8+ T Zellantwort. Das transkriptionelle Programm, die finale Größe und Dauer der klonalen Expansion und der Start der Kontraktionsphase werden durch die TZR-Signalstärke bestimmt. Schwache TZR-Stimulation führt zu einer verminderten Expansion und vermittelt eine frühzeitige Kontraktionsphase, die eine Entwicklung von Gedächtniszellen auf den Kosten der Effektorzellen favorisiert. IRF4 wird nach TZR-Ligand-Interaktion in CD8+ T-Zellen hoch reguliert. Seine Expressionskinetik ist stark von der TZR-Signalstärke der Aktivierung abhängig, übersetzt diese und sorgt für die Umsetzung in ein entsprechendes transkriptionelles und differentielles Programm. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass die IRF4-Defizienz in CD8+ T-Zellen zu einem verfrühten Abbruch der Expansion und zu einem vorzeitigen Beginn der Kontraktion führt, die durch den FAS-vermittelten Tod-induzierenden Signalweg initiiert wird. Außerdem präsentieren IRF4-defiziente CD8+ T-Zellen vermehrt Phosphatidylserine an ihrer Oberfläche und Komplementdeposition, beides begünstigt die Erkennung und Aufnahme durch Phagozyten. Diese Ergebnisse weisen zudem stark darauf hin, dass durch die fehlende Expression von IRF4 in CD8+ T Zellen, ein schwaches TZR-Signal übermittelt wird, unabhängig von der tatsächlichen Stärke und Dauer des aktivierenden Signals, dass zu einer Verkürzung der Expansionsphase führt und eine verfrühte Kontraktionsphase der Effektorzellen auslöst. Diese Arbeit erweitert schon bekanntes Wissen um IRF4 als Schlüsselregulator für die Differenzierung und Funktionalität der ag-spezifischen CD8+ T-Zellen, da es den Beginn der Kontraktionsphase diktiert mittels Aktivierung von verschiedenen Apoptose- und Phagocytose Signalwegen. / CD8+ T cells promote pathogen clearance and play a crucial role in controlling infections. Besides antigen dose and inflammatory cytokine milieu, the TCR stimulation contributes to the programming of the CD8+ T cell response. A distinct developmental program, the final magnitude and duration of clonal expansion, as well as the timing of the onset of T cell contraction, are determined by the TCR signaling strength. Weak TCR stimulation results in a diminished magnitude of expansion and accelerates the onset of contraction, as it favors the development of memory cells at the expense of effector cells. IRF4 is a transcription factor, that is upregulated in CD8+ T cells following TCR stimulation. Furthermore, its expression kinetic is highly dependent on the TCR signaling strength, which initiated activation. Therefore, it translates the strength of the activating signal and transmits it into a proper transcriptional and developmental program. This study provides unique evidence that the absence of IRF4 expression in CD8+ T cells leads to a hasted termination of clonal expansion and a premature contraction, initiated by the FAS-mediated cell death pathway. Moreover, IRF4-deficient CD8+ T cells exposed phosphatidylserine on their cell surface and showed complement deposition, both facilitating their recognition and uptake by phagocytes. The findings of this study additionally strongly indicate that IRF4 deficiency mimics weak TCR engagement and in turn transmits every TCR signal, independent of its actually affinity and duration, into a developmental program, that give rise to an early memory formation and results in a premature onset of effector CD8+ T cell contraction. This data extend previous knowledge of IRF4 being essential for the differentiation and functionality of ag-specific effector CD8+ T cells, as it furthermore dictates the onset of CD8+ T cell contraction via the activation of several death and phagocytosis inducing pathways.

Einleitung: Das Probiotikum E. coli Nissle 1917 (EcN) wird seit einigen Jahren erfolgreich in der Behandlung chronisch entzündlicher Darmerkrankungen angewendet, der zugrunde liegende Wirkmechanismus ist jedoch nur unzureichend geklärt. T-Zellen spielen in der intestinalen Immunhomöostase und der Pathogenese von CED eine zentrale Rolle. Ziel: Den Einfluss von EcN auf humane T-Zellen weitergehend zu charakterisieren. Methoden: CD3-stimulierte periphere und Lamina propria T-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen eines E. coli Nissle 1917 konditionierten Mediums (EcN-CM) oder aber hitzeinaktivierten E. coli Nissle 1917 (hi-EcN) kultiviert. Die Expression von zellzyklus- und apoptoseassoziierten Regulationsproteinen sowie DNA-Gehalt, Zellzykluskinetik, Apoptoserate und Zellexpansion wurden durchflusszytometrisch und im Western Blot bestimmt. Die Sekretion von Cytokinen wurde mit dem Cytometric Bead Assay bestimmt. Ergebnisse: EcN-CM, nicht aber hitzeinaktivierte E. coli Nissle 1917 hemmt die Zellzyklusprogression und die Expansion von stimulierten, humanen peripheren T-Zellen. Ursächlich hierfür ist eine verminderte Expression der Cykline A, B1, D2 und E mit einer konsekutiv verminderten Phosphorylierung des Retinoblastomaproteins. Periphere T-Zellen sezernieren unter EcN-CM vermindert IL-2, IFN-gamma und TNF-alpha, während die Sekretion des antiinflammatorischen IL-10 durch EcN-CM heraufreguliert wird. Im Gegensatz zur potenten Beeinflussung des Zellzyklus, wurde die Apoptose von PBT durch E. coli Nissle 1917 nicht moduliert. Während periphere T-Zellen durch EcN-CM in ihrer Zellzyklusprogression und Expansion gehemmt wurden, zeigte sich kein derartiger Effekt auf ortständige Lamina propria T-Lymphozyten. Diskussion: Bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen kommt es zu einer Rekrutierung und Aktivierung von peripheren T-Zellen in die intestinale Mukosa. Durch die differenzielle Beeinflussung des Immunsystems, bei der aktivierte periphere T-Zellen inhibiert, die ortsständigen T-Zellen jedoch in ihrer Funktion nicht gestört werden, könnte E. coli Nissle 1917 dazu beitragen, die mukosale Entzündungsreaktion zu limitieren, während die intestinale Immunhomöostase gewahrt bleibt. Als wirksames Agens kommen kleine, hitzestabile bakterielle Produkte wie Lipopolysaccharide, bakterielle Lipoproteine, CPG-DNA, Lipoteichonsäuren und Peptidoglykane in Frage. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit liefern weitere Hinweise, dass Probiotika einen breiten Einfluss auf das humane Immunsystem haben und decken zugrundeliegende Mechanismen auf. / Introduction: Although probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 (EcN) has been proven to be efficacious for the treatment of inflammatory bowel diseases, the underlying mechanisms of action still remain elusive. T cells play a major role in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Aims: To analyze the effects of E. coli Nissle 1917 on cell cycling and apoptosis of peripheral blood and lamina propria T cells. Methods: Anti-CD3-stimulated peripheral or lamina propria T cells were treated with E. coli Nissle 1917-conditioned medium (EcN-CM) or heat-inactivated E. coli Nissle 1917. Expression of cell cycle or apoptosis related proteins was determined by immunoblotting, DNA content, cell cycle kinetics, cell expansion and apoptosis were measured by flow cytometry. Cytokine levels in culture supernatants were assessed by cytometrc bead array. Results: EcN-CM but not heat-inactivated EcN inhibits cell cycling and expansion of peripheral T cells. EcN-CM decreases expression of Cyclin A, B1, D2 and E and thus reduces phosphorylation of retinoblastomaprotein in CD3-stimulated peripheral T cells. Further, secretion of proinflammatory cytokines IL-2, IFN-gamma and TNF-alpha is reduced while antiinflammatory IL-10 is increased under treatment with EcN-CM. In contrast to peripheral T cells, expansion and cell cycle progression of lamina propria T cells was not affected by EcN-CM. Apoptosis of was not modulated by EcN-CM. Discussion: The differential reaction of circulating and tissue-bound T cells towards E. coli Nissle 1917 may explain the beneficial effect of EcN in intestinal inflammation. EcN may downregulate the expansion of newly recruited T cells into the mucosa and thus limit intestinal inflammation, while already activated tissue-bound T cells may eliminate deleterious antigens in order to maintain immunological homeostasis. Possible agents, for which immunomodulatory effects are known, include heat-stable bacterial products like lipopolysaccharids, bacterial lipoproteins or bacterial DNA-motifs.

Ungefähr 1% der Bevölkerung der westlichen Welt leidet an rheumatoider Arthritis (RA). In einem T-Zellrezeptor transgenen Mausmodell, dem K/BxN Modell, wird die ubiquitär exprimierte Glukose-6-phosphat Isomerase (G6PI) von autoreaktiven T- und B-Zellen erkannt. Diese Mäuse entwickeln spontan eine antikörpervermittelte Arthritis, die viele Gemeinsamkeiten mit der humanen RA aufweist. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die Immunisierung mit G6PI eine Arthritis auch in nicht-transgenen Mäuse induzieren kann. Die Immunisierung mit heterologer humaner G6PI führte zur Entwicklung einer peripheren symmetrischen Polyarthritis in über 95% der DBA/1 Mäuse. Damit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass eine Immunreaktion gegen ein systemisches exprimiertes Antigen zur einer organspezifischen Erkrankung in normalen nicht-transgenen Mäusen führt. Die Tiere entwickeln nach 9 Tagen eine Arthritis, die bis Tag 15 ihr Maximum erreicht hat und dann langsam abnimmt. Histologisch ist die Arthritis durch eine frühe Synovitis charakterisiert, gefolgt von massiven Erosionen des Knorpel und Knochens und anschließenden Reparaturprozessen, inklusive Fibrose. Obwohl die Tiere hohe Antikörpertiter entwickeln, kann die Arthritis nicht durch aufgereinigte Antikörper kranker Mäuse transferiert werden. Trotzdem spielen Antikörper eine große Rolle, da FcR-gamma-Kette defiziente Mäuse eine Arthritis mit geringer Inzidenz und mildem Verlauf entwickeln. Die Depletion der CD4 positiven Zellen verhindert die Entwicklung der Arthritis völlig, und eine Depletion während der Erkrankung führt zur schnellen Heilung. Daneben ist für die Entwicklung der Arthritis auch das Komplementsystem und TNF-alpha entscheidend, was durch Depletion von C5 bzw. durch Blockade von TNF-alpha gezeigt wurde. Zusätzlich wurde die Rolle der G6PI bei der Pathogenese der RA im Menschen untersucht. RA-Patienten zeigten keine erhöhte Frequenz von CD4 positiven T-Zellen, die nach Restimulation mit G6PI TNF-alpha oder IFN-gamma produzierten. Außerdem konnten keine erhöhten anti-G6PI Titer in Patienten mit RA oder anderen rheumatischen Erkrankungen detektiert werden. / About 1% of the of the population of the western world suffers from rheumatoid arthritis (RA). In a T-cell receptor transgenic mouse model, the K/BxN model, the ubiquitously expressed glucose-6-phosphate isomerase (G6PI) is recognized by autoreactive T- and B-cells. These mice do develop an antibody dependent arthritis which show a lot of features of human RA. In this study it was examined whether arthritis could be induced in normal non-transgenic mice by immunization with G6PI. Immunization with heterologous human G6PI induces a symmetric polyarthritis in over 95% of DBA/1 mice. Therewith showing for the first time that an immune reaction against an systemic expressed antigen will lead to the development of an organ specific disease in normal non-transgenic mice. The mice develop arthritis 9d after immunization, reach their maximum at d15 and then arthritis slowly resolve. Histologically, the disease is characterized by early synovitis followed by massive cartilage destruction and erosions of the bones and later repair processes including fibrosis. Although antibody titers in the mice are high, transfer of purified anti-G6PI antibodies of sick mice alone do not transfer disease. Anyway, antibodies seem to play a major role since FcR-gamma-chain deficient mice develop disease with a much lower frequency and reduced severity. Depletion of CD4 positive T cells completely prevents disease and depletion during disease leads to an rapid resolution of arthritis. Aside this, complement and TNF-alpha is critical for the development of arthritis, which could shown by depletion of C5 and blockade of TNF-alpha. In addition, the role of G6PI in the pathogenesis of RA in humans was examined. RA patients do not show a higher frequency of CD4 positive T-cells which produce TNF-alpha and IFN-gamma after restimulation with G6PI. Furthermore, no elevated anti-G6PI titers could be detected in RA patients and in patients with other rheumatic diseases.

Das Proteasomsystem ist die Hauptquelle von Peptiden für die MHC Klasse I Antigen-Präsentation. In Vertebraten kann dieses durch die Expression verschiedener Subtypen des 20S Proteasoms moduliert werden. Die häufigsten Subtypen sind konstitutive Proteasomen (c20S) mit den katalytischen Untereinheiten beta1, beta2 und beta5 und Immunoproteasomen (i20S) mit den Immunountereinheiten beta1i, beta2i und beta5i. Die Expression von i20S optimiert in der Regel die MHC Klasse I Antigen-Präsentation, indem die Bildung von Peptiden mit hoher Affinität zu MHC I Molekülen verstärkt wird. Die Bildung von i20S wird momentan durch ein Modell der kooperativen Assemblierung erklärt, das auf der präferentiellen Interaktion zwischen den Immunountereinheiten beruht. In dieser Arbeit wurde die Assemblierung von 20S Proteasomen in beta5i defizienten Mäusen nach Infektion mit Listeria monocytogenes analysiert. In diesem Modell konnte keine präferentielle Interaktion zwischen den Untereinheiten festgestellt werden. Stattdessen zeigen die Ergebnisse, daß die Integration von konstitutiven oder Immunountereinheiten durch direkte Kompetition reguliert wird. Des Weiteren wurde während der Infektion eine beta5i-abhängige Zunahme der zellulären Proteasommenge festgestellt und somit ein neuer Mechanismus zur Regulation des zellulären Proteasomgehaltes entdeckt. Funktionell führt die beta5i-Defizienz zu einer verringerten MHC I Expression auf antigenpräsentierenden Zellen und zu einer verminderten Prozessierung des bakteriellen Antigens LLO296-304. Bei der Analyse der LLO296-304 spezifischen CD8 T Zell Antwort konnte jedoch kein Unterschied zwischen Wildtyp- und beta5i defizienten Mäusen festgestellt werden .Die Kontrolle der Infektion in den beta5i defizienten Mäusen ist jedoch in der Leber verzögert. Dies deutet darauf hin, dass die Erkennung und Elimination infizierter Zellen durch cytotoxische CD8 T Zellen auf Grund der geringeren MHC Klasse I Präsentation bakterieller Antigene behindert wird. / The proteasome-system is the main source of peptides for MHC class I antigen presentation. In vertebrates this system can be modulated by the expression of different subtypes of the 20S proteasome. The most common subtypes are constitutive proteasomes (c20S) with the catalytic subunits beta1, beta2 and beta5 and immunoproteasomes (i20S) with the immunosubunits beta1i, beta2i and beta5i. Expression of i20S generally optimizes MHC class I antigen presentation by increasing the generation of peptides with high affinity to MHC class I molecules. Currently, the formation of i20S is explained by a model of cooperative proteasome assembly, which is based on preferential interactions among the immunosubunits. Here, the assembly of 20S proteasomes was analysed in beta5i deficient mice during an ongoing infection with Listeria monocytogenes. In this model, no preferential interactions among constitutive subunits or immunosubunits could be determined. Instead, the results show that the integration of constitutive subunits or immunosubunits is regulated by direct competition. Further, a beta5i-dependent increase in cellular proteasome quantity was observed following infection. This reveals a novel mechanism for the regulation of cellular proteasome quantity, which is based on the differential expression of beta5i. Functionally, the deficiency in beta5i results in a reduced MHC class I cell surface expression on professional antigen presenting cells and a drastically diminished processing of the bacterial antigen LLO296-304. However, the analyses of LLO296-304 specific CD8 T cells did not reveal differences in the frequencies of these T cells between wild-type and beta5i deficient mice. Still, the control of infection in the liver of beta5i deficient mice was delayed. This phenotype suggests that the recognition and elimination of infected target cells by cytotoxic CD8 T cells is constrained due to the lowered MHC class I presentation of bacterial antigens.

Hintergrund: Die Funktion von Immunzellen hängt von einer konstanten und ausreichenden Energieversorgung ab, die über die OXPHOS in den Mitochondrien und die Glykolyse im Zytosol realisiert wird. Die wichtigsten Substrate dafür sind Sauerstoff und Glukose. Fragestellung: Bei schweren Erkrankungen oder in Entzündungsgebieten ist die zelluläre Energieversorgung stark beeinträchtigt, weil in der Mikroumgebung der Zelle Sauerstoff und Nährstoffe inadäquat bereitgestellt werden. Ziel war herauszufinden, ob und wie humane Immunzellen ihre Lebensfähigkeit und funktionellen Aktivitäten unter solchen Umständen aufrechterhalten. Methoden: Humane CD4+ T-Zellen und CD14+ Monozyten wurden durch MACS aus peripherem Blut gesunder Spender isoliert. Die Sauerstoffverbrauchsmessung mittels Clark-Elektrode war Maß der oxidativen Energiebildung, die mit Myxothiazol und Glukoseentzug gehemmt wurde. Die CD3/CD28-stimulierte T-Zell-Proliferation wurde durchflußzytometrisch mittels CFDA SE analysiert. Basierend auf dem Paraformaldehyd-Saponin-Prozedere wurde die Zytokinsynthese ebenfalls am FACS bewertet, nachdem die T-Zellen in Anwesenheit von Brefeldin A mit PMA/Ionomycin stimuliert wurden. Mit einem käuflichen Testsystem (FACS-Technik) wurde die monozytäre Phagozytose untersucht. Die HIF-1alpha-Expression wurde nach PMA-Ionomycin-Stimulation von Myxothiazol-behandelten T-Zellen auf mRNA- und Proteinebene gemessen. Ergebnisse: Bei Glukoseanwesenheit waren alle untersuchten Immunfunktionen trotz vollständig gehemmter OXPHOS unbeeinträchtigt. Erst bei gleichzeitigem Glukoseentzug, der per sé Proliferation und Phagozytose signifikant beeinträchtigte, waren sie signifikant vermindert. Es wird vermutet, daß T-Zellen die Energieverluste mit einem überschießenden Effekt ihres Sauerstoffverbrauchs und stark angetriebener Glykolyse kompensieren. HIF-1alpha ist dabei nicht entscheidend für die Umschaltung auf anaerobe Energiesynthese. Schlußfolgerung: Die Daten quantifizieren die Energieanforderungen der funktionellen Aktivität in hochgereinigten humanen Immunzellfraktionen. Es wurde nachgewiesen, daß sich Immunzellen unerwartet lange an eine massiv beeinträchtigte Energetik adaptieren können und ihre spezifischen Funktionen aufrechterhalten. / Background: The function of immune cells is dependent upon a constant and adequate supply of energy. Energy is formed via OXPHOS in the mitochondria and via cytosolic glycolysis. Oxygen and glucose are the main substrates for energy synthesis. Objective: In severe diseases or in inflamed areas cellular energy supply is significantly impaired due to inadequate supply of cellular microenvironment with oxygen and nutrients. The aim of this study was to answer the question, whether and how human immune cells maintain viability and functional activity under these circumstances. Methods: Human CD4+ T cells and CD14+ monocytes were isolated by MACS from peripheral blood of healthy donors. The extent of oxidative energy formation was determined via measurement of oxygen consumption using a Clark type electrode. Energy production was restricted in glucose-free cell culture medium and by gradually inhibited OXPHOS using myxothiazol. T cell proliferation was flow-cytometrically analysed using CFDA SE after stimulation with CD3 and CD28 antibodies. Cytokine synthesis was assessed by flow-cytometrical immunofluorescence and the paraformaldehyde-saponin procedure after stimulation of T cells with PMA/ionomycin in the presence of brefeldin A. Phagocytosis of monocytes was measured using a commercial test system (FACS technique). HIF-1alpha expression was assessed by semiquantitative PCR and immunoblot after the stimulation of myxothiazol treated T cells with PMA/ionomycin. Results: In glucose-containing medium all investigated immune functions were unaffected even under complete suppression of OXPHOS. Only when OXPHOS and glycolysis were simultaneously and almost completely suppressed a significant decrease was found. Glucose deprivation per se caused both a significantly reduced proliferation and phagocytosis. It is supposed, that T cells are able to compensate for an energy deficit by an excess of oxygen consumption and strongly induced glycolysis. However, HIF-1alpha was found to be not crucial for switching to anaerobic energy synthesis. Conclusion: These data quantify the energy requirement of functional activity in highly purified human immune cell fractions. An unexpectedly high adaptive potential of immune cells to maintain specific functions even under massively impaired energetic conditions could be demonstrated.

In this work, the influence of the second messenger cAMP on the functional plasticity of M-DC8+ dendritic cells (DC) was examined. The marker M-DC8 defines a population of native DC first described in blood. After their isolation, M-DC8+ DC acquire a mature CD83+ phenotype during a short culture ex vivo. After a challenge with LPS and IFN-g, M-DC8+ DC secrete large amounts of the proinflammatory cytokines IL-12(p70) and TNF-a surpassing by far other DC populations and monocytes. Due to their preferential induction of TH1-dominated T cell responses, M-DC8+ DC might play a role in the pathogenesis of inflammatory diseases. Different cAMP-elevating agents suppressed the proinflammatory cytokine production and enhanced the secretion of anti-inflammatory IL-10. Activity of phosphodiesterase (PDE) 4, the most important cAMP-hydrolysing enzyme in immune cells, was detected and RT-PCR revealed the expression of PDE4 subtypes 4A, 4B and 4D in M-DC8+ DC, whereas 4C was not detectable. The PDE4-specific inhibitors AWD12-281 and Roflumilast were then used to elevate cAMP concentrations. These substances have been proven to be efficient in anti-inflammatory therapies. In the presence of PDE4 inhibitors, the LPS/IFN-g-induced production of IL-12 and TNF-a was decreased by 90 % and 60 %, respectively, whereas the IL-10-release was doubled. These effects were only observed, if the PDE4 inhibitors where present from the beginning of the culture. The inhibition of the IL-12 secretion was reverted using an a-IL-10-receptor antibody. PDE4 inhibitor-treated M-DC8+ DC showed a reduced capacity to polarize TH1-cells, which was demonstrated analysing culture supernatants by ELISA and by single-cell analysis detecting intracellular IFN-g und IL-4. These results suggest that PDE4 inhibitors may not only be useful in the therapy of TH2-mediated diseases but also in TH1-dominated indications such as multiple sclerosis and Crohn´s disease. Despite the shift of the cytokine profile, the in vitro maturation of M-DC8+ DC was not affected by PDE4 inhibitors. The expression of CD83, CD80, CD86, MHC-molecules as well as CD54 and CD58, was assessed by FACS analysis. Correspondingly, in the presence of AWD12-281, M-DC8+ DC efficiently stimulated the proliferation of allogeneic CD4+CD45RA+ T-cells. In the second part of this study, the effects of an inhibition of cAMP-synthesis in M-DC8+ DC were analyzed. Two adenylyl cyclase (AC) inhibitors, 2,5-Dideoxyadenosine and SQ22536, clearly hampered the in vitro maturation of M-DC8+ DC. The expression of the DC maturation marker CD83 could be reconstituted using the stable cAMP-analogon 8-Br-cAMP. Measuring the intracellular cAMP concentration in M-DC8+ DC, initially low cAMP-levels were observed, but within 30 min the concentration raised and returned to original levels within 2 hrs. Blocking the cAMP synthesis by AC inhibitors, the LPS/IFN-g-induced production of IL-12, TNF-a and IL-10 was strongly reduced. Furthermore, it was demonstrated that M-DC8+ DC can only release IL-12 after a transient elevation of cAMP, i.e. they acquire a "license". Such a regulation of the IL-12 production has not been described before. Protein kinase A is an important effector molecule of cAMP. Inhibiting its activity resulted in a reduced expression of the DC maturation marker CD83 and a lower cytokine production underlining the importance of cAMP-signalling for the activation of M-DC8+ DC. In conclusion, this study provides evidence for a new concept of the immune-regulatory function of cAMP. Here, cAMP is essentially involved in the initial activation and maturation of DC and enables them to secrete large amounts of IL-12 and TNF-a upon stimulation with a TLR ligand. Conversely, a long-term elevation of cAMP-concentrations inhibits the proinflammatory effector functions of M-DC8+ DC and can induce anti-inflammatory responses by enhancing the secretion of IL-10. / In dieser Arbeit wurde der Einfluss des second messengers cAMP auf die funktionelle Plastizität von M-DC8+ dendritischen Zellen (DC) untersucht. Der Oberflächenmarker M-DC8 definiert eine zunächst im Blut beschriebene Population nativer DC. Nach ihrer Isolation erlangen M-DC8+ DC während einer kurzen Kultur einen maturen CD83+ Phänotyp. Nach Stimulation mit LPS und IFN-g produzieren native M-DC8+ DC deutlich höhere Mengen der proinflammatorischen Zytokine IL-12(p70) und TNF-a als andere DC-Populationen oder Monozyten. Dies resultiert in einer Programmierung TH1-dominierter T-Zellantworten. M-DC8+ DC könnten daher an der Pathogenese entzündlicher Krankheiten beteiligt sein. Unterschiedliche cAMP-erhöhende Substanzen supprimierten die proinflammatorische Zytokinproduktion und verstärkten gleichzeitig die Sekretion des anti-inflammatorischen IL-10. In M-DC8+ DC konnte die Aktivität von Phosphodiesterase (PDE) 4, dem wichtigsten cAMP-hydrolysierenden Enzym in Immunzellen, nachgewiesen werden. Durch RT-PCR wurde die Expression der PDE4-Subtypen 4A, 4B und 4D gezeigt, nicht aber 4C. Zur Erhöhung der cAMP-Konzentration wurden dann die PDE4-spezifischen Inhibitoren AWD12-281 und Roflumilast eingesetzt, deren klinische Effizienz bei anti-inflammatorischen Therapien belegt ist. Auch diese Substanzen verringerten die LPS/IFN-g-induzierte Produktion von IL-12 und TNF-a durch M-DC8+ DC um 90 % bzw. 60 %, während die IL-10-Freisetzung etwa verdoppelt wurde. Diese starken Effekte konnten nur erzielt werden, wenn die PDE4-Inhibitoren von Beginn der Kultur an eingesetzt wurden. Die Hemmung der IL-12-Sekretion wurde in Gegenwart eines a-IL-10-Rezeptor-Antikörpers aufgehoben. Unter dem Einfluss von PDE4-Inhibitoren war die TH1-Programmierung durch M-DC8+ DC deutlich reduziert, was sowohl durch die Analyse der Zellüberstände mittels ELISA als auch auf Einzelzell-Ebene durch intrazelluläre Detektion von IFN-g und IL-4 nachgewiesen wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass PDE4-Inhibitoren nicht nur für TH2-vermittelte Erkrankungen sondern auch für TH1-dominierte Indikationen wie Multiple Sklerose oder Morbus Crohn von Nutzen sein könnten. Trotz der starken Modulation des Zytokinprofils blieb die in vitro-Ausreifung M-DC8+ DC unbeeinflusst von PDE4-Inhibitoren. Untersucht wurde die Expression von CD83, CD80, CD86, MHC-Molekülen, CD54 und CD58 mittels FACS-Analyse. Entsprechend induzierten M-DC8+ DC auch in Anwesenheit von AWD12-281 die Proliferation allogener CD4+CD45RA+ T-Zellen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, wie sich die Blockade der cAMP-Synthese auf M-DC8+ DC auswirkt. Zwei Adenylatcyclase-Inhibitoren, 2,5-Dideoxyadenosine und SQ22536, hemmten die in vitro-Maturation von M-DC8+ DC deutlich. Die CD83-Expression wurde mit 8-Br-cAMP rekonstituiert. Messungen der intrazellulären cAMP-Konzentration in unbehandelten M-DC8+ DC zeigten initial niedrige cAMP-Spiegel, die innerhalb von 30 min anstiegen und nach 2 h wieder auf das Ausgangsniveau abfielen. Die LPS/IFN-g-induzierte Produktion von IL-12, TNF-a und IL-10 wurde durch AC-Inhibitoren deutlich vermindert. M-DC8+ DC erhalten nur nach einer transienten cAMP-Erhöhung die "Lizenz" IL-12 freizusetzen. Eine derartige Regulation der IL-12-Sekretion ist bisher nicht beschrieben. Eine Hemmung des cAMP-Effektormoleküls Proteinkinase A resultierte in der reduzierten Expression des DC-Maturationsmarkers CD83 und einer verringerten Zytokinproduktion. Dies unterstreicht die Bedeutung von cAMP für die Aktivierung M-DC8+ DC. Zusammenfassend gibt diese Arbeit am Beispiel nativer humaner DC Anhalt für ein neues Konzept der immunregulatorischen Funktion von cAMP. Hierbei ist cAMP wesentlich an der Ausreifung von M-DC8+ DC beteiligt, woraufhin diese große Mengen IL-12 und TNF-a sekretieren können. Dagegen wirkt eine langfristige cAMP-Erhöhung durch die Induktion von IL-10 anti-inflammatorisch.

Nierenzellkarzinome (NZKs) gelten als stark immunogene Tumore. Dies ist insbesondere auf die Infiltration durch verschiedene Immunzellpopulationen, wie T-Lymphozyten und Natürliche Killer (NK)-Zellen, sowie das klinische Ansprechen auf immuntherapeutische Strategien zurückzuführen. Bisher existieren jedoch nur sehr wenige Studien zur Rolle von humanen nativen dendritischen Zellen (DCs) in NZK-Geweben und über die Tumor-vermittelte Modulation dieser DCs. DCs nehmen als professionelle Antigen-präsentierende Zellen eine zentrale Schlüsselrolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung der angeborenen sowie adaptiven Immunantwort ein. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals der Effekt von klarzelligen NZKs auf den Phänotyp sowie die immunmodulatorischen Fähigkeiten von 6-sulfo LacNAc+ (slan)DCs evaluiert. SlanDCs, welche eine große Subpopulation humaner Blut-DCs darstellen, sind neben der Sekretion großer Mengen proinflammatorischer Zytokine dazu befähigt, Tumorzellen direkt zu lysieren. Des Weiteren sind slanDCs in der Lage, die antitumoralen Effekte von NK-Zellen zu fördern und CD4+ T-Helfer-Zellen sowie Tumor-reaktive CD8+ T-Lymphozyten effizient zu stimulieren. Angesichts dieser proinflammatorischen Eigenschaften können slanDCs wesentlich an einer Tumor-gerichteten Immunantwort beteiligt sein. Auf dieser Grundlage erfolgte im Rahmen der vorliegenden Arbeit der immunhistochemische Nachweis von slanDCs in klarzelligen NZK-Geweben. Im Vergleich zu Tumor-freiem Nierengewebe trat in den primären Tumorgeweben eine erhöhte Zahl infiltrierender slanDCs auf. Zudem wurde die Präsenz von slanDCs in Lymphknoten- sowie Fernmetastasen von NZK-Patienten beobachtet. Weiterführende Untersuchungen an frischen klarzelligen NZK-Geweben demonstrierten, dass NZK-infiltrierende slanDCs einen unreifen Phänotyp ausprägen und Interleukin-10 produzieren. Ausgehend von diesen Erkenntnissen erfolgten funktionelle Analysen, bei denen der Einfluss der kommerziell erhältlichen klarzelligen NZK-Linien ACHN und Caki-1 sowie der primären klarzelligen NZK-Linien MZ1257RC und MZ2877RC auf bedeutende immunmodulatorische Fähigkeiten von slanDCs untersucht wurde. In diesem Zusammenhang zeigte sich, dass NZK-Zellen effektiv in der Lage sind, sowohl die slanDC-vermittelte Proliferation von CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten, als auch die slanDC-induzierte Differenzierung naïver CD4+ T-Lymphozyten in proinflammatorische T-Helfer 1-Zellen zu inhibieren. Darüber hinaus wurde demonstriert, dass NZK-Zellen das Potenzial von slanDCs zur Aktivierung von NK-Zellen hemmen. Untersuchungen der zugrunde liegenden Mechanismen zeigten, dass die funktionelle Inhibition von slanDCs durch klarzellige NZK-Zellen über membranständige Moleküle vermittelt wird. Die im Rahmen dieser Dissertation gewonnenen Erkenntnisse weisen darauf hin, dass NZKs die Ausreifung sowie wesentliche funktionelle Eigenschaften von DCs inhibieren. Dies deutet auf einen neuen Immunescape-Mechanismus klarzelliger NZKs hin, welcher auf einer Tumorzell-vermittelten Generierung von tolerogenen slanDCs basiert und eine unzureichende Aktivierung der angeborenen sowie adaptiven Tumor-gerichteten Immunantwort zur Folge hat. Diese neuen Erkenntnisse können einen Beitrag zu einem besseren Verständnis der Interaktion von NZKs mit nativen humanen DCs leisten und die Konzeption neuer therapeutischer Strategien ermöglichen, welche auf einer Verstärkung der antitumoralen Eigenschaften von DCs beruhen.