Five target genes were selected in Toxoplasma gondii tachyzoites for localization studies. These five genes, detected through proteomics studies, included TgME49_227450, TgME49_223080, TgME49_262390, TgME49_230940, and TgME49_269620. Localization of these five target proteins is a first step to confirm their interaction with TgCrk2 and understand their function and role in TgCrk2 regulation of the tachyzoite cell cycle. Gene models for the targets were analyzed using ToxoDB and ApE analysis tools. Endogenous tagging constructs were created for each target. Transgenic parasites were created. Finally, localization analysis of the target proteins in tachyzoites was completed using immunofluorescent microscopy following. One protein was found to be nuclear, two were located in the cytoplasm, and two were unable to be analyzed. Future research should be completed in order to prove these putative interactors are really correlated with TgCrk2 through Co-immunoprecipitation.

Toxoplasma gondii weist eine weltweite Verbreitung auf und kann fast alle Wirbeltiere, vor allem Vögel und Menschen infizieren. Felide sind Endwirte von T. gondii, welche das infektiöse und umweltresistente Oozysten-Stadium ausscheiden können. T. gondii kann auch ohne sexuelle Vermehrung unterschiedlichste Zwischenwirte und Zwischenwirtspezies infizieren. Obwohl eine sexuelle Phase ein Teil des Lebenszyklus ist, werden rekombinierte Genotypen nur selten beobachtet. Dies ist ein Grund dafür, warum T. gondii eine klonale Populationsstruktur erkennen lässt. Während in Nordamerika und Europa drei klonale Genotypen (Typ I, II und III) dominieren, werden in Südamerika und Asien, neben den drei bekannten auch atypische und andere Genotypen beobachtet. Auch innerhalb der atypischen Genotypen lässt sich eine klonale Populationsstruktur erkennen. Die Linien I, II und III weisen Unterschiede in ihrer Virulenz für Mäuse auf. Typ-I-Stämme sind hochvirulent. Die Infektion mit nur einem Organismus führt bereits zum Tod. Klonale Typ-II- und Typ-III-Stämme sind avirulent für Mäuse. Nur Infektionen mit mehr als 103 Organismen führen zum Tod. In dieser Studie zeige ich, dass die Mehrzahl isolierter T. gondii-Oozysten dem Typ II zuzuordnen ist. Es wurde keine Typ-I-, dafür aber eine Typ-III-Infektion und vereinzelte Hinweise auf Mischinfektionen und nicht-kanonische T. gondii Genotypen beobachtet. Erstmalig kann gezeigt werden, dass aus einer Rekombination zwischen den Typen II und III genetisch unterschiedliche T. gondii in einer natürlich infizierten Katze entstanden sind. Die identifizierten nicht-kanonischen T. gondii Klone weisen unterschiedliche, meist hohe Virulenz im Mausmodell auf. Eine geringe Anzahl von T. gondii-DNA Proben von humanen Toxoplasmose-Fällen deutet auf eine Infektion mit T. gondii des Typs II hin. Ich zeige mit dieser Studie, dass sexuelle Rekombination von T. gondii in Deutschland möglich ist, und diese zur Entstehung von hochvirulenten T. gondii führen kann. / Toxoplasma gondii is a protozoan parasite that can infect almost all warm-blooded animals, including birds and humans. The definitive host is the cat which excretes the highly infectious and environmental resistant oocyst stage. Equally important for the spread of T. gondii is the transmission of T. gondii by ingestion of contaminated food (prey) between host species. Sexual recombination is a rare event observed in T. gondii. This is one of the reasons why a clonal population structure of T. gondii is observed. In Europe and North America the majority of genotypes (types) of T. gondii are members of only three clonal types, designated type I, type II and type III. In South America and Asia, T. gondii is shown to have an increased genetic diversity with a high prevalence of atypical genotypes. However, even within those atypical genotypes, a clonal population structure can be observed. More importantly, mouse virulence of types I, II and III differ markedly. While infection with T. gondii type I is always lethal in mice, infections with 104–106 parasites of type II or type III are needed to have the same effect in mice. This study shows that the majority of cats in Germany excrete T. gondii oocysts of type II. We have not observed any type I T. gondii, but show that type III and, importantly, mixed type infection as well as non-canonical T. gondii are present in Germany. For the first time we demonstrate that a sexual cross between T. gondii type II and type III in a single, naturally infected cat occurred in Germany resulting in excretion of many genetically different non-canonical T. gondii. Most of the identified non-canonical T. gondii show a high virulence in mice. The RFLP-typing analysis of a limited number of T. gondii-DNA isolated from human samples revealed only alleles of T. gondii type II. I show that genetic recombination of different T. gondii types in Germany can lead to a higher genetic diversity and generation of highly mouse-virulent T. gondii.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A toxoplasmose é uma zoonose amplamente distribuída que afeta mais de um terço da população mundial e de grande importância na saúde pública. A maioria das infecções em humanos por Toxoplasma gondii é assintomática. Entretanto, nos últimos anos, a toxoplasmose tem sido amplamente investigada uma vez que se apresenta como uma das doenças oportunistas que acometem pacientes portadores da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) e indivíduos transplantados. A toxoplasmose congênita pode provocar aborto ou até sérios danos ao feto provocando retardo mental e cegueira em crianças, reduzindo significativamente a qualidade de vida dos sobreviventes. Assim, a transmissão congênita pode ser muito mais importante do que se pensava. Estudos sobre a evolução da infecção por Toxoplasma gondii em diferentes tipos de células hospedeiras se fazem necessários para uma abordagem terapêutica adequada. Nesse estudo utilizamos as técnicas de imunofluorescência e imunocitoquímica ultraestrutural com o objetivo de investigar a participação de Bax e Bcl-2, proteínas da família Bcl-2 que regulam a apoptose e a dinâmica mitocondrial durante a evolução da infecção das células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) por taquizoítos de T. gondii. A microscopia confocal revelou uma rede mitocondrial filamentosa marcada pelo Mito Tracker Red no citoplasma de HUVEC e após 2h de infecção essa rede se mostrou desorganizada, provavelmente por conseqüência da invasão da HUVEC pelo T. gondii. Porém, em 6h de infecção, observamos a reestruturação da rede mitocondrial no citoplasma de HUVEC que se manteve no tempo de 20h de infecção. Ainda por microscopia confocal observamos que a proteína pró-apoptótica Bax se localiza principalmente no citoplasma, na mitocôndria, e pela primeira vez foi detectada no núcleo de HUVEC. No tempo de 2h de infecção, observamos a expressão de Bax principalmente na mitocôndria. Entretanto, após 6h e 20h de infecção, essa expressão diminuiu tanto na mitocôndria quanto no citoplasma de HUVEC. A expressão de Bcl-2 não foi observada em HUVEC não infectada e infectada por 2h, 6h e 20h. Taquizoítos de T. gondii apresentaram marcação positiva para Bax e Bcl-2 ao longo de todos os tempos de infecção. A análise ultraestrutural confirmou a dinâmica mitocondrial observada por microscopia confocal durante toda a interação. Os resultados de imunocitoquímica confirmaram a expressão de Bax no núcleo de HUVEC e a expressão de Bax e Bcl-2 em taquizoítos de T. gondii isolados. Portanto, nossos resultados sugerem que o T. gondii modula a morfologia da mitocôndria e a expressão de Bax em HUVEC, interferindo possivelmente nos mecanismos de defesa das células hospedeiras, entre eles a progressão da apoptose. / Toxoplasmosis is a zoonosis widely distributed that affects over a third of world population and is of great importance on public health. Most Toxoplasma gondii infection in humans is asymptomatic. However, on recent years toxoplasmosis has been investigated since it comes as some opportunistic diseases in patients with the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and transplant patients. Congenital toxoplasmosis can cause miscarriage or serious damage to the fetus leading to mental retardation and blindness in children, significantly reducing the quality of life of survivors. Thus, congenital transmission can be much more important than previously thought. Studies on the development of Toxoplasma gondii in different host cells are necessary for an appropriate therapy. At this study we employed the immunofluorescence and ultrastructural immunocytochemical assay with the aim to investigate the involvement of Bax and Bcl-2, members of Bcl-2 family which regulate apoptosis and the mitochondrial dynamic during the infection progress of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) by tachyzoites of T. gondii. Confocal microscopy revealed a mitochondrial filamentous network stained by Mito Tracker Red within cytoplasm of HUVEC and after 2h of infection this network became desorganized, probably as a consequence of T. gondii invasion. However, at 6h of infection, we observed the restructuring of the mitochondrial network in the cytoplasm of HUVEC, which remained at the time of 20h of infection. Even by confocal microscopy we observed Bax pro-apoptotic protein located mainly in the cytoplasm, in the mitochondria, and for the first time it was detected in the nucleus of HUVEC. At the time of 2h of infection, we observed the expression of Bax mainly in mitochondria. However, after 6h and 20h of infection, this expression decreased such in mitochondria as in HUVEC cytoplasm. The Bcl-2 expression was not observed in uninfected and HUVEC infected for 2h, 6h and 20h. Tachyzoites of T. gondii presented positive labeling for Bax and Bcl-2 over all time of infection. The ultrastructural analysis confirmed the mitochondrial dynamics observed by confocal microscopy throughout the interaction. The results of immunocytochemistry confirmed Bax expression in the nucleus of HUVEC and the expression of Bax and Bcl-2 in isolated tachyzoites of T. gondii. Therefore, our results suggest that T. gondii modulates the mitochondria morphology and Bax expression in HUVEC, probably interfering on the host cells defense mechanisms, including the progression of apoptosis.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A toxoplasmose é uma zoonose amplamente distribuída que afeta mais de um terço da população mundial e de grande importância na saúde pública. A maioria das infecções em humanos por Toxoplasma gondii é assintomática. A toxoplasmose é amplamente investigada visto que se apresenta como uma doença grave em pessoas imunodeprimidas (portadores da síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), não tratados, indivíduos transplantados, paciente em tratamento quimioterápico ou em uso de drogas supressoras e gestantes). A toxoplasmose congênita frequentemente pode levar ao aborto espontâneo ou até mesmo resultar na formação de crianças com algum grau de atraso no desenvolvimento mental e/ou físicos, deste modo, a transmissão congênita pode ser muito mais importante do que se pensava, pois os parasitos encontrados na circulação sanguinea são capazes de infectar as células endoteliais dos vasos e os tecidos circunjacentes, podendo resultar no encistamento do T. gondii. Atualmente a toxoplasmose vem sendo investigada devido a sua associação a inúmeras outras doenças, assim, estudos sobre a evolução da infecção por T. gondii em diferentes tipos de células hospedeiras se fazem necessários para uma abordagem terapêutica adequada. Ao invadir a célula hospedeira o parasito possui a capacidade de recrutar as mitocôndrias promovendo mudanças na organização mitocondrial ao longo da progressão da infecção, garantindo um ambiente favorável a sua multiplicação. Diante disso, investigamos se o parasito possui a capacidade de interferir no metabolismo mitocondrial e na resposta apoptótica da célula endotelial. O presente trabalho teve como objetivo analisar o metabolismo mitocondrial através da respirometria de alta-resolução e da resposta apoptótica através do western blotting das células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) infectadas por 2, 6 e 20 horas por taquizoítos de T. gondii. A respirometria de alta-resolução revelou que o parasito interfere no metabolismo energético da célula hospedeira. A análise do conteúdo de proteínas da família Bcl-2 por western blotting revelou maior estímulo apoptótico no tempo inicial de infecção, quando comparado aos demais tempos. Os resultados dos conteúdos de caspase 3, proteína efetora da apoptose, não demonstrou diferença nos tempos iniciais de infecção Entretanto, em tempos mais tardios, o conteúdo de caspase 3 mostrou-se significativamente aumentado quando comparado às HUVEC não infectadas. A dinâmica de replicação do parasito foi observada através do monitoramento pelo sistema Time-Lapse Nikon BioStation IMQ em tempo real das células infectadas por T.gondii. Portanto, nossos resultados sugerem que o protozoário ao recrutar as mitocôndrias da célula hospedeira interfere no metabolismo mitocondrial e na modulação da apoptose para garantir um ambiente favorável a sua multiplicação. / Toxoplasmosis is a widespread zoonosis that affects more than a third of the world population and of great public health importance. Most human infections with Toxoplasma gondii are asymptomatic. Toxoplasmosis is widely investigated since it presents itself as a serious disease in immunocompromised persons (holders of acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), untreated, transplant recipients, patients undergoing chemotherapy or suppressing drugs and pregnant). Congenital toxoplasmosis can often lead to miscarriage or even result in the formation of children with some degree of developmental delay mental and / or physical, thus congenital transmission may be much more important than previously thought, because the parasites found In the bloodstream are able to infect endothelial cells of blood vessels and surrounding tissues, which may result in encystment T. gondii. Currently toxoplasmosis has been investigated because of their association with other diseases, so, studies of the evolution of T.gondii infection in different types of host cells are necessary for an adequate therapeutic approach. To invade the host cell, the parasite has the ability to recruit mitochondria promoting changes in mitochondrial organization along the progression of infection, ensuring a favorable environment for their multiplication. Therefore, we investigated whether the parasite has the ability to interfere with mitochondrial metabolism and apoptotic response of endothelial cells. This study aimed to analyze the mitochondrial metabolism by high-resolution respirometry and apoptotic response by western blotting of endothelial cells of human umbilical vein (HUVEC) infected for 2, 6 and 20 hours per tachyzoites of T. gondii. The high-resolution respirometry revealed that the parasite interferes with the energy metabolism of the host cell. The analysis of the family protein content of Bcl-2 by western blotting revealed higher apoptotic stimulus at the initial time of infection, as compared to other times. The results of the contents of caspase 3 protein effector of apoptosis, showed no difference in the initial days of infection However, in more recent times, the content of caspase 3 was significantly increased when compared to non-infected HUVEC. The dynamics of parasite replication was observed by monitoring the system Time-Lapse Nikon BioStation IMQ in real time from infected cells by T. gondii. Therefore, our findings suggest that mitochondria in recruiting protozoan host cell interfere with mitochondrial metabolism and in the modulation of apoptosis to ensure a favorable environment for multiplication.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A toxoplasmose é uma zoonose amplamente distribuída que afeta mais de um terço da população mundial e de grande importância na saúde pública. A maioria das infecções em humanos por Toxoplasma gondii é assintomática. A toxoplasmose é amplamente investigada visto que se apresenta como uma doença grave em pessoas imunodeprimidas (portadores da síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), não tratados, indivíduos transplantados, paciente em tratamento quimioterápico ou em uso de drogas supressoras e gestantes). A toxoplasmose congênita frequentemente pode levar ao aborto espontâneo ou até mesmo resultar na formação de crianças com algum grau de atraso no desenvolvimento mental e/ou físicos, deste modo, a transmissão congênita pode ser muito mais importante do que se pensava, pois os parasitos encontrados na circulação sanguinea são capazes de infectar as células endoteliais dos vasos e os tecidos circunjacentes, podendo resultar no encistamento do T. gondii. Atualmente a toxoplasmose vem sendo investigada devido a sua associação a inúmeras outras doenças, assim, estudos sobre a evolução da infecção por T. gondii em diferentes tipos de células hospedeiras se fazem necessários para uma abordagem terapêutica adequada. Ao invadir a célula hospedeira o parasito possui a capacidade de recrutar as mitocôndrias promovendo mudanças na organização mitocondrial ao longo da progressão da infecção, garantindo um ambiente favorável a sua multiplicação. Diante disso, investigamos se o parasito possui a capacidade de interferir no metabolismo mitocondrial e na resposta apoptótica da célula endotelial. O presente trabalho teve como objetivo analisar o metabolismo mitocondrial através da respirometria de alta-resolução e da resposta apoptótica através do western blotting das células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) infectadas por 2, 6 e 20 horas por taquizoítos de T. gondii. A respirometria de alta-resolução revelou que o parasito interfere no metabolismo energético da célula hospedeira. A análise do conteúdo de proteínas da família Bcl-2 por western blotting revelou maior estímulo apoptótico no tempo inicial de infecção, quando comparado aos demais tempos. Os resultados dos conteúdos de caspase 3, proteína efetora da apoptose, não demonstrou diferença nos tempos iniciais de infecção Entretanto, em tempos mais tardios, o conteúdo de caspase 3 mostrou-se significativamente aumentado quando comparado às HUVEC não infectadas. A dinâmica de replicação do parasito foi observada através do monitoramento pelo sistema Time-Lapse Nikon BioStation IMQ em tempo real das células infectadas por T.gondii. Portanto, nossos resultados sugerem que o protozoário ao recrutar as mitocôndrias da célula hospedeira interfere no metabolismo mitocondrial e na modulação da apoptose para garantir um ambiente favorável a sua multiplicação. / Toxoplasmosis is a widespread zoonosis that affects more than a third of the world population and of great public health importance. Most human infections with Toxoplasma gondii are asymptomatic. Toxoplasmosis is widely investigated since it presents itself as a serious disease in immunocompromised persons (holders of acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), untreated, transplant recipients, patients undergoing chemotherapy or suppressing drugs and pregnant). Congenital toxoplasmosis can often lead to miscarriage or even result in the formation of children with some degree of developmental delay mental and / or physical, thus congenital transmission may be much more important than previously thought, because the parasites found In the bloodstream are able to infect endothelial cells of blood vessels and surrounding tissues, which may result in encystment T. gondii. Currently toxoplasmosis has been investigated because of their association with other diseases, so, studies of the evolution of T.gondii infection in different types of host cells are necessary for an adequate therapeutic approach. To invade the host cell, the parasite has the ability to recruit mitochondria promoting changes in mitochondrial organization along the progression of infection, ensuring a favorable environment for their multiplication. Therefore, we investigated whether the parasite has the ability to interfere with mitochondrial metabolism and apoptotic response of endothelial cells. This study aimed to analyze the mitochondrial metabolism by high-resolution respirometry and apoptotic response by western blotting of endothelial cells of human umbilical vein (HUVEC) infected for 2, 6 and 20 hours per tachyzoites of T. gondii. The high-resolution respirometry revealed that the parasite interferes with the energy metabolism of the host cell. The analysis of the family protein content of Bcl-2 by western blotting revealed higher apoptotic stimulus at the initial time of infection, as compared to other times. The results of the contents of caspase 3 protein effector of apoptosis, showed no difference in the initial days of infection However, in more recent times, the content of caspase 3 was significantly increased when compared to non-infected HUVEC. The dynamics of parasite replication was observed by monitoring the system Time-Lapse Nikon BioStation IMQ in real time from infected cells by T. gondii. Therefore, our findings suggest that mitochondria in recruiting protozoan host cell interfere with mitochondrial metabolism and in the modulation of apoptosis to ensure a favorable environment for multiplication.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A toxoplasmose é uma zoonose amplamente distribuída que afeta mais de um terço da população mundial e de grande importância na saúde pública. A maioria das infecções em humanos por Toxoplasma gondii é assintomática. Entretanto, nos últimos anos, a toxoplasmose tem sido amplamente investigada uma vez que se apresenta como uma das doenças oportunistas que acometem pacientes portadores da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) e indivíduos transplantados. A toxoplasmose congênita pode provocar aborto ou até sérios danos ao feto provocando retardo mental e cegueira em crianças, reduzindo significativamente a qualidade de vida dos sobreviventes. Assim, a transmissão congênita pode ser muito mais importante do que se pensava. Estudos sobre a evolução da infecção por Toxoplasma gondii em diferentes tipos de células hospedeiras se fazem necessários para uma abordagem terapêutica adequada. Nesse estudo utilizamos as técnicas de imunofluorescência e imunocitoquímica ultraestrutural com o objetivo de investigar a participação de Bax e Bcl-2, proteínas da família Bcl-2 que regulam a apoptose e a dinâmica mitocondrial durante a evolução da infecção das células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) por taquizoítos de T. gondii. A microscopia confocal revelou uma rede mitocondrial filamentosa marcada pelo Mito Tracker Red no citoplasma de HUVEC e após 2h de infecção essa rede se mostrou desorganizada, provavelmente por conseqüência da invasão da HUVEC pelo T. gondii. Porém, em 6h de infecção, observamos a reestruturação da rede mitocondrial no citoplasma de HUVEC que se manteve no tempo de 20h de infecção. Ainda por microscopia confocal observamos que a proteína pró-apoptótica Bax se localiza principalmente no citoplasma, na mitocôndria, e pela primeira vez foi detectada no núcleo de HUVEC. No tempo de 2h de infecção, observamos a expressão de Bax principalmente na mitocôndria. Entretanto, após 6h e 20h de infecção, essa expressão diminuiu tanto na mitocôndria quanto no citoplasma de HUVEC. A expressão de Bcl-2 não foi observada em HUVEC não infectada e infectada por 2h, 6h e 20h. Taquizoítos de T. gondii apresentaram marcação positiva para Bax e Bcl-2 ao longo de todos os tempos de infecção. A análise ultraestrutural confirmou a dinâmica mitocondrial observada por microscopia confocal durante toda a interação. Os resultados de imunocitoquímica confirmaram a expressão de Bax no núcleo de HUVEC e a expressão de Bax e Bcl-2 em taquizoítos de T. gondii isolados. Portanto, nossos resultados sugerem que o T. gondii modula a morfologia da mitocôndria e a expressão de Bax em HUVEC, interferindo possivelmente nos mecanismos de defesa das células hospedeiras, entre eles a progressão da apoptose. / Toxoplasmosis is a zoonosis widely distributed that affects over a third of world population and is of great importance on public health. Most Toxoplasma gondii infection in humans is asymptomatic. However, on recent years toxoplasmosis has been investigated since it comes as some opportunistic diseases in patients with the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and transplant patients. Congenital toxoplasmosis can cause miscarriage or serious damage to the fetus leading to mental retardation and blindness in children, significantly reducing the quality of life of survivors. Thus, congenital transmission can be much more important than previously thought. Studies on the development of Toxoplasma gondii in different host cells are necessary for an appropriate therapy. At this study we employed the immunofluorescence and ultrastructural immunocytochemical assay with the aim to investigate the involvement of Bax and Bcl-2, members of Bcl-2 family which regulate apoptosis and the mitochondrial dynamic during the infection progress of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) by tachyzoites of T. gondii. Confocal microscopy revealed a mitochondrial filamentous network stained by Mito Tracker Red within cytoplasm of HUVEC and after 2h of infection this network became desorganized, probably as a consequence of T. gondii invasion. However, at 6h of infection, we observed the restructuring of the mitochondrial network in the cytoplasm of HUVEC, which remained at the time of 20h of infection. Even by confocal microscopy we observed Bax pro-apoptotic protein located mainly in the cytoplasm, in the mitochondria, and for the first time it was detected in the nucleus of HUVEC. At the time of 2h of infection, we observed the expression of Bax mainly in mitochondria. However, after 6h and 20h of infection, this expression decreased such in mitochondria as in HUVEC cytoplasm. The Bcl-2 expression was not observed in uninfected and HUVEC infected for 2h, 6h and 20h. Tachyzoites of T. gondii presented positive labeling for Bax and Bcl-2 over all time of infection. The ultrastructural analysis confirmed the mitochondrial dynamics observed by confocal microscopy throughout the interaction. The results of immunocytochemistry confirmed Bax expression in the nucleus of HUVEC and the expression of Bax and Bcl-2 in isolated tachyzoites of T. gondii. Therefore, our results suggest that T. gondii modulates the mitochondria morphology and Bax expression in HUVEC, probably interfering on the host cells defense mechanisms, including the progression of apoptosis.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The Toxoplasma gondii is a protozoan of great clinical importance can cause functional and biochemical changes in the host cells mainly in the central nervous system. These changes are usually associated with the inflammatory response to tissue damage and cell oxidation in immunocompetent hosts. T. gondii infection stimulate the production of high levels of cytokines such as IL-12 and IFN-γ by cells of the immune system, consisting of a main point in parasite control and disease resistance. As a potent antioxidant, resveratrol has become an important research subject due to its antioxidant and anti-inflammatory properties. However, the mechanism by which resveratrol exerts its effects are hampered by the low solubility and bioavailability. Accordingly, one way to improve the bioavailability of resveratrol is to associate with inclusion complexes. Thus, this study aimed to investigate the benefits of resveratrol associated with sulfamethoxazole-trimethoprim (ST) in the treatment of experimentally infected mice with T. gondii. For the study, 60 mice were divided into two groups: non-infected (n = 24) and infected with T. gondii (n = 36). The two groups were divided into subgroups and treated with resveratrol (free and inclusion complex 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin) isolated and associated with ST. The groups A to D composed by healthy mice and groups E to J consisting of animals infected by T. gondii (VEG strain). The treatment started 20 days post-infection for 10 consecutive days with oral doses of 0.5 mg kg-1 of ST (groups B and F), 100 mg kg-1 of free resveratrol (groups C and G) and inclusion complex of resveratrol (inclusion complex containing resveratrol) (groups D and H), as well as with an association of both drugs (groups I and J). Groups A and E were used as control, untreated. Behavioral tests (memory, anxiety and locomotion) were performed after treatment. Blood samples, liver and brain fragments were collected to evaluate the cytokine profile, pathological changes, brain cysts counts, as well as oxidant/antioxidant profile. Infected animals showed behavioral changes such as anxiety and memory loss. The combination ST and resveratrol was able to restore time latência in passive avoidance task. A reduction of the number of brain cyst was observed on animals treated with the combination of drugs. Infected animals show an increase in pro-inflammatory cytokines and reduction of anti-inflammatory cytokine (IL-10), as well as increased protein oxidation in liver and brain tissue. The combination of resveratrol and ST with free inclusion complex in increased the total antioxidant capacity (TAC) and ferric reducing antioxidant power (FRAP) levels in liver and brain that can be interpreted by the protective effect of resveratrol. In addition, resveratrol in inclusion complex form when combined with ST improved therapeutic effect of ST reducing oxidative damage in liver and brain, reducing the number of cysts in the treatment of mice infected with T. gondii. Therefore, it is possible to suggest that the ST with resveratrol on treatment of infected mice can exerts a protective effect on host cells. The resveratrol in inclusion complex form was the best treatment option, for controlled tissue and serum immune responses, as well as oxidative stress in mice infected with T. gondii. / O Toxoplasma gondii é um protozoário de grande importância clínica capaz de ocasionar alterações bioquímicas e funcionais nas células do hospedeiro, principalmente no sistema nervoso central. Essas alterações, geralmente estão associadas à resposta inflamatória com danos teciduais e oxidação celular em hospedeiros imunocompetentes. A infecção por T. gondii estimula a produção de altos níveis de citocinas, tais como IL-12 e IFN-γ, pelas células do sistema imunológico, consistindo em um ponto principal no controle do parasito e resistência à doença. Como um potente antioxidante, o resveratrol tem se tornado um importante alvo de pesquisas graças a suas propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias. No entanto, os mecanismos pelo qual o resveratrol exerce seu efeito são prejudicados pela baixa solubilidade e biodisponibilidade. Nesse sentido, uma forma de melhorar a biodisponibilidade do resveratrol é associá-lo a um complexo de inclusão. Desta maneira, os objetivos deste estudo foram investigar os benefícios do resveratrol associado a sulfamethoxazol-trimetropin (ST) no tratamento de camundongos infectados experimentalmente com T. gondii. Para o estudo, 60 camundongos foram divididos em dois grupos: não-infectados (n=24) e infectados com T.gondii (n=36). Os dois grupos foram subdivididos em subgrupos (n= 10) e tratados com resveratrol (livre e em complexo de inclusão 2- hidroxipropil-β-ciclodextrina) isolado e associado com ST. Os grupos A-D foram compostos por animais saudáveis; grupos E-J consistiram de animais infectados por T. gondii (cepa VEG). O tratamento foi iniciado 20 dias após a infecção e manteve-se por 10 dias consecutivos nas doses orais de 0.5 mg kg-1 de ST (grupos B e F), 100 mg kg-1 de resveratrol livre (grupos C e G) e na forma de complexo de inclusão (grupos D e H), bem como na associação de ambas drogas (grupos I e J). Grupos A e E foram usados como controles, não tratados. Testes comportamentais (memória, ansiedade e locomoção) foram avaliados após o tratamento. Amostras de sangue, fragmentos de fígado e cérebro foram coletados a fim de avaliar os níveis de citocinas, alterações histopatológicas, contagem de cistos cerebrais, como também perfil oxidativo/antioxidante. Animais infectados com T. gondii apresentaram alterações comportamentais como ansiedade e perda de memória. A combinação com ST e resveratrol foi capaz de restaurar o tempo de latência no teste de esquiva inibitória. Uma redução na contagem de cistos foi observada nos animais tratados com a associação de drogas assim como redução das lesões teciduais. Animais infectados apresentam aumento de citocinas pró-inflamatórias e redução da citocina anti-inflamatória (IL-10), assim como maior oxidação proteica em tecido hepático e cerebral. A combinação de ST com resveratrol livre e em complexo de inclusão aumentou os a capacidade antioxidante total (TAC) e os produtos de redução férrica (FRAP) em fígado e cérebro que pode ser interpretado pelo efeito protetor do resveratrol. Além disso, o resveratrol na forma de complexo de inclusão quando combinado à ST melhorou o efeito terapêutico da ST reduzindo os danos oxidativos, lesões hepáticas e número de cistos cerebrais no tratamento de camundongos infectados com T. gondii. Portanto, é possível sugerir que a combinação de ST com resveratrol em camundongos infectados parece exercer um efeito protetor nas células hospedeiras. O resveratrol na forma de complexo de inclusão foi a melhor opção terapêutica, pois controlou as respostas imunológicas séricas e teciduais, assim como o estresse oxidativo em camundongos infectados com T. gondii.

Mais de 2 bilhões de pessoas em todo o mundo encontram-se infectadas com Toxoplasma gondii. Na região endêmica de Erechim, RS, cerca de 90% da população é soropositiva e cerca de 18% destes indivíduos apresentam lesões oculares com manifestações clínicas. A estrutura genética das populações do T. gondii tem sido bastante investigada, a despeito da infecção ter se espalhado pelo mundo, do grande número de hospedeiros intermediários e da capacidade do parasita de se reproduzir sexualmente. Linhagens de T. gondii com atípica ou nova combinação de alelos têm sido isoladas de animais não domésticos ou em outros continentes, como América do Sul e África, e de pacientes com apresentações clínicas incomuns. Em modelos murinos, as linhagens com o genótipo tipo I são altamente virulentas, em contraste às cepas tipo II e tipo III que são menos virulentas. Este trabalho propõe a caracterização fenotípica da resposta imune do hospedeiro frente a infecção por diferentes cepas de T. gondii, bem como o isolamento e a caracterização genotípica das linhagens de T. gondii que infectam indivíduos de Erechim no Rio Grande do Sul. Para a caracterização fenotípica utilizamos duas cepas de T. gondii já bem estabelecidas, a cepa RH (tipo I) e a ME49 (tipo II), e uma cepa isolada a partir de gatos domésticos do Brasil, chamada TgCatBr71. Sendo assim, através da fenotipagem das células dendríticas de camundongos C57Bl/6 infectados com as cepas citadas, foi possível observar que essas cepas induzem expressão das moléculas de superfície CD40, CD80, CD86 e MHC classe II em DCs CD11c+, porém sem significativa diferença entre as cepas. Com relação as células CD4+ e células CD8+, observamos o aumento das células CD8+ no decorrer da infecção pelas cepas RH e ME49, indicando a importância deste tipo celular na resposta protetora contra T. gondii. Avaliamos também a produção de citocinas IL-12, IFN-g e IL-10 em células esplênicas de camundongos infectados pelas três cepas no decorrer da infecção e detectamos que camundongos infectados pela cepa tipo II (ME49) apresentam síntese maior dessas citocinas do que camundongos infectados pela cepa tipo I (RH) e pela cepa TgCatBr71. Assim, concluímos que esta cepa TgCatBr71 se assemelha bastante a cepa do tipo I (RH), tanto em relação a evolução da doença no camundongos como nos padrões da resposta imune do hospedeiro. E que apesar dessas duas cepas diferirem da cepa tipo II (ME49), resultando em graus diferentes de patologia em camundongos C57Bl/6, todas a três cepas parecem produzir semelhante resposta imune protetora do hospedeiro. / More than 2 billion people are infected with Toxoplasma gondii around the world. In the endemic region of Erechim, RS, Brazil, about 90% of the population is soropositive and about 18% of these individuals have ocular lesions with clinical manifestations. The genetic structure of strains of T. gondii has been investigated, despite the infection has spread throughout the world, the large number of intermediate hosts and the ability to reproduce sexually. Strains of T. gondii with atypical or new combination of alleles have been isolated from wild animals and other continents, such as South America and Africa, and also from patients with unusual clinical presentations. In murine models, the type I genetic lineage are highly virulent, in contrast to strains type II and type III.Our work proposes the phenotypic characterization of the host immune response against the infection by different strains of T. gondii, and the isolation and genetic strains characterization of T. gondii that infect individuals of Erechim in RS, Brazil. In the phenotypic characterization were used two strains of T. gondii already well established, the strain RH (type I) and ME49 (type II), and a strain isolated from domestic cats from Brazil, called TgCatBr71 (type BrI). Thus, by phenotyping dendritic cells of C57BL/ 6 mice infected with the strains mentioned, we observed that these strains upregulated the expression of surface molecules such as CD40, CD80, CD86 and MHC class II in DC CD11c+ although with no significant difference between the strains. With respect to the CD4+ and CD8+ cells, the observed increase in CD8+ T cells during the infection by strains RH and ME49, indicating the importance of this cell type in the protective response against T. gondii. We also evaluated the production of cytokines IL-12, IFN-g and IL-10 from spleen cells and found that mice infected by the strain type II (ME49) have increased synthesis of these cytokines than mice infected by the strain type I (RH) and the strain type BrI (TgCatBr71). Thus, we concluded that type BrI (TgCatBr71) strain is similar to type I (RH) strain, both for the evolution of the disease and also concerning the immunological parameters evaluated. Besides, despite these two strains differ from the strain type II (ME49), resulting in different degrees of pathology in mice C57BL / 6, all three strains seem to produce similar protective immune response of the host.

Die Toxoplasmose gehört zu den bedeutsamsten Zoonosen. Sie wird durch den weltweit verbreiteten Erreger T. gondii ausgelöst und verläuft bei immunkompetenten Menschen meist subklinisch. Dennoch können Rezidivierungen und schwere Krankheitsverläufe auftreten. Besonders gefährdete Personen sind Immunsupprimierte und seronegative Schwangere. T. gondii kann alle warmblütigen Lebewesen infizieren. In der Folge kommt es zur Bildung von Gewebezysten in Muskulatur und Organen. Daten zum Vorkommen und zur Verbreitung des Erregers bei deutschen Schlachtputen liegen nicht vor und sollten im Rahmen dieser Arbeit gewonnen werden. Das hohe Infektionsrisiko bei oraler Aufnahme von rohem oder nicht vollständig durchgegartem zystenhaltigem Fleisch ist bekannt. Exakte Erkenntnisse zur Tenazität der T.-gondii-Gewebezysten gegenüber dem Einfluss von Salz, pH-Wert und Wurstreifungsprozessen liegen jedoch nicht vor. Da sowohl Schweine- als auch Putenfleisch häufig zur Herstellung von Fleischerzeugnissen wie z. B. Rohwürsten und Rohschinken eingesetzt wird, sollte die Persistenz der Gewebezysten unter dem Einfluss verschiedener Salzgehalte und pH-Werte sowie kombiniert im Rahmen der Wurstreifungsprozesse untersucht werden. Ziel ist eine genauere Beurteilung des Infektionsrisikos beim Verzehr kurz gereifter Rohwürste (Mettwurst) und anderer nicht erhitzter Fleischzeugnisse. Untersuchungen: 1. Es wurden 1913 Blutserumproben von Schlachtputen aus 14 Mastbetrieben in fünf Bundesländern mittels kinetischem ELISA auf das Vorkommen von IgG-Antikörpern gegen T. gondii untersucht. 2. In den In-vitro-Studien wurde der Einfluss von NaCl bzw. Nitritpökelsalz (NPS) in wurstrelevanten Konzentrationen (2,0, 2,5 3,0 %) und des pH-Wertes (5, 6, 7) auf die Gewebezysten in Mäusemuskulatur und -hirn untersucht. Die Überprüfung der Infektiosität der exponierten Gewebezysten erfolgte mittels Maus-Bioassay. 3. Putenrohwurstbrät (2,0 % NaCl oder NPS, mit und ohne Starterkultur) wurde mit zystenhaltiger Mäusemuskulatur beimpft. Während der Wurstreifung wurde die Infektiosität der Zysten im Maus-Bioassay untersucht. Ergebnisse:  Die T.-gondii-Gesamtseroprävalenz in deutschen Schlachtputenbeständen betrug 18,4 %. Dieser Wert ist überraschend hoch. Es handelt sich um die ersten in Deutschland durchgeführten Erhebungen. Jahreszeitliche Schwankungen wurden beobachtet, wobei in den Wintermonaten gemästete Putenherden eine höhere Prävalenz zeigten als die im Sommer gehaltenen Tiere.  Gewebezysten besitzen eine gewisse pH-Wert-Toleranz. Sie blieben bei pH-Werten von 5 bis 7 bis zu 26 Tage infektiös.  Gewebezysten sind gegenüber dem Einfluss von Salz empfindlich. Bei NaCl Konzentrationen von 2,0 % blieben sie bis zu acht Tagen infektiös, bei  2,5 % maximal ein Tag.  Gegenüber NPS sind die Zysten offenbar empfindlicher als gegenüber NaCl; sie blieben bei 2,0 % NPS-Konzentration vier Tage infektiös.  Bei Kombination der Effekte von Salz und pH-Wert verkürzt sich die Infektionsfähigkeit der Zysten in der Rohwurstreifung auf ca. 24 Stunden. Schlussfolgerungen: Die unerwartet hohen Seroprävalenzen weisen daraufhin, dass Putenfleisch ein Infektionsrisiko für Toxoplasmose darstellen kann. Weiterführende Untersuchungen zum Vorkommen des Erregers in Schlachtputen sind notwendig. Tendenziell zeigen die Ergebnisse der Tenazitätsuntersuchungen einen raschen Verlust der Infektiosität des Erregers, so dass in lang gereiften Rohwürsten oder in herkömmlich produzierten kurz gereiften Rohwürsten (NPS > 2,5 %) nicht mit einem Vorkommen von infektiösen Zysten zu rechnen ist. Eine Ausnahme könnten allerdings salzreduzierte (NaCl  2,0 %), ohne NPS hergestellte oder sehr kurz gereifte Rohwürste darstellen, hierbei kann ein Infektionsrisiko nicht vollständig ausgeschlossen werden. Zur Beurteilung von Rohschinken sind weitere Untersuchungen notwendig.

Mais de 2 bilhões de pessoas em todo o mundo encontram-se infectadas com Toxoplasma gondii. Na região endêmica de Erechim, RS, cerca de 90% da população é soropositiva e cerca de 18% destes indivíduos apresentam lesões oculares com manifestações clínicas. A estrutura genética das populações do T. gondii tem sido bastante investigada, a despeito da infecção ter se espalhado pelo mundo, do grande número de hospedeiros intermediários e da capacidade do parasita de se reproduzir sexualmente. Linhagens de T. gondii com atípica ou nova combinação de alelos têm sido isoladas de animais não domésticos ou em outros continentes, como América do Sul e África, e de pacientes com apresentações clínicas incomuns. Em modelos murinos, as linhagens com o genótipo tipo I são altamente virulentas, em contraste às cepas tipo II e tipo III que são menos virulentas. Este trabalho propõe a caracterização fenotípica da resposta imune do hospedeiro frente a infecção por diferentes cepas de T. gondii, bem como o isolamento e a caracterização genotípica das linhagens de T. gondii que infectam indivíduos de Erechim no Rio Grande do Sul. Para a caracterização fenotípica utilizamos duas cepas de T. gondii já bem estabelecidas, a cepa RH (tipo I) e a ME49 (tipo II), e uma cepa isolada a partir de gatos domésticos do Brasil, chamada TgCatBr71. Sendo assim, através da fenotipagem das células dendríticas de camundongos C57Bl/6 infectados com as cepas citadas, foi possível observar que essas cepas induzem expressão das moléculas de superfície CD40, CD80, CD86 e MHC classe II em DCs CD11c+, porém sem significativa diferença entre as cepas. Com relação as células CD4+ e células CD8+, observamos o aumento das células CD8+ no decorrer da infecção pelas cepas RH e ME49, indicando a importância deste tipo celular na resposta protetora contra T. gondii. Avaliamos também a produção de citocinas IL-12, IFN-g e IL-10 em células esplênicas de camundongos infectados pelas três cepas no decorrer da infecção e detectamos que camundongos infectados pela cepa tipo II (ME49) apresentam síntese maior dessas citocinas do que camundongos infectados pela cepa tipo I (RH) e pela cepa TgCatBr71. Assim, concluímos que esta cepa TgCatBr71 se assemelha bastante a cepa do tipo I (RH), tanto em relação a evolução da doença no camundongos como nos padrões da resposta imune do hospedeiro. E que apesar dessas duas cepas diferirem da cepa tipo II (ME49), resultando em graus diferentes de patologia em camundongos C57Bl/6, todas a três cepas parecem produzir semelhante resposta imune protetora do hospedeiro. / More than 2 billion people are infected with Toxoplasma gondii around the world. In the endemic region of Erechim, RS, Brazil, about 90% of the population is soropositive and about 18% of these individuals have ocular lesions with clinical manifestations. The genetic structure of strains of T. gondii has been investigated, despite the infection has spread throughout the world, the large number of intermediate hosts and the ability to reproduce sexually. Strains of T. gondii with atypical or new combination of alleles have been isolated from wild animals and other continents, such as South America and Africa, and also from patients with unusual clinical presentations. In murine models, the type I genetic lineage are highly virulent, in contrast to strains type II and type III.Our work proposes the phenotypic characterization of the host immune response against the infection by different strains of T. gondii, and the isolation and genetic strains characterization of T. gondii that infect individuals of Erechim in RS, Brazil. In the phenotypic characterization were used two strains of T. gondii already well established, the strain RH (type I) and ME49 (type II), and a strain isolated from domestic cats from Brazil, called TgCatBr71 (type BrI). Thus, by phenotyping dendritic cells of C57BL/ 6 mice infected with the strains mentioned, we observed that these strains upregulated the expression of surface molecules such as CD40, CD80, CD86 and MHC class II in DC CD11c+ although with no significant difference between the strains. With respect to the CD4+ and CD8+ cells, the observed increase in CD8+ T cells during the infection by strains RH and ME49, indicating the importance of this cell type in the protective response against T. gondii. We also evaluated the production of cytokines IL-12, IFN-g and IL-10 from spleen cells and found that mice infected by the strain type II (ME49) have increased synthesis of these cytokines than mice infected by the strain type I (RH) and the strain type BrI (TgCatBr71). Thus, we concluded that type BrI (TgCatBr71) strain is similar to type I (RH) strain, both for the evolution of the disease and also concerning the immunological parameters evaluated. Besides, despite these two strains differ from the strain type II (ME49), resulting in different degrees of pathology in mice C57BL / 6, all three strains seem to produce similar protective immune response of the host.