Made available in DSpace on 2013-08-07T19:05:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000422340-Texto+Completo-0.pdf: 14563536 bytes, checksum: b6883cbe3401270733359041afa6d671 (MD5) Previous issue date: 2010 / BACKGROUND: Mononuclear cells (MCs) from bone marrow have been used in various treatments of diseases in an attempt to regenerate tissues. The objective of this study was to evaluate the access and proliferation of mononuclear cells in a critical defect, with the addition of platelet-rich plasma (PRP) and / or TGF-β1 (transforming growth factor beta 1), and then to evaluate bone repair at defective sites on the femurs of rats. METHODS: We created a critical defect on the bilateral femurs of 33 Wistar- Kyoto rats. Mononuclear bone marrow cells, TGF-β and PRP were added to the lesion on the treated side and saline on the contralateral side. We determined the adhesion of mononuclear cells at the critical defect and bone repair. RESULTS: The presence and consequent access of mononuclear cells administered in the treated animals were shown by the PCR technique. Radiographic analysis showed closure of the lesion groups in MCs + TGF-β and MCs + PRP, however, we can not say whether the treatment was administered or by the bone regeneration, when analyzed at 6 and 10 weeks, there is seen not differ substantially between groups. CONCLUSIONS: a) Bone marrow mononuclear cells did not adhere at the critical defect created in the rat femur; b) It was not possible to assess the relative efficiency of the proposed treatments on bone healing, since no significant differences in the evaluation of groups. / INTRODUÇÂO: As células mononucleares (CMs) da medula óssea têm sido utilizadas em diversas patologias na tentativa de regeneração tecidual. O objetivo deste estudo foi avaliar a adesão de células mononucleares sobre um defeito crítico, com a adição do plasma rico em plaquetas (PRP) e/ou TGF-β1 (Fator de crescimento transformador Beta 1) e, por fim, verificar o reparo ósseo dos sítios defeituosos dos fêmures dos ratos. MÉTODOS: Foi criado um defeito crítico bilateral nos fêmures de 33 ratos Wistar-Kyoto. Células mononucleares da medula óssea, TGF-β e PRP foram adicionadas no lado tratado da lesão e soro fisiológico no lado contralateral. Avaliou-se a adesão de células mononucleares sobre o defeito crítico e o reparo ósseo. RESULTADOS: A presença e conseqüente adesão das células mononucleares administradas nos animais tratados não foram evidenciadas através de técnica de PCR. As análises radiográficas evidenciam fechamento da lesão nos grupos CMs +TGF-β e CMs + PRP, porém, não podemos afirmar se foi pelos tratamentos administrados ou pela própria regeneração óssea, quando analisadas em 6 e 10 semanas, haja visto não apresentarem diferenças significativas entre os grupos. CONCLUSÕES: a) as células mononucleares da medula óssea não aderiram ao defeito crítico criado no fêmur do rato; b) Não foi possível avaliar a eficiência relativa dos tratamentos propostos no reparo ósseo, uma vez que não houve diferenças significativas na avaliação dos grupos.

Made available in DSpace on 2011-12-27T14:14:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 000388585-0.pdf: 2402252 bytes, checksum: 61c5f710d7d456a08638eac157bdc111 (MD5) license.txt: 581 bytes, checksum: 44ea52f0b7567232681c6e3d72285adc (MD5) / The bone marrow besides having a high number of heterogenic cells, like connective, hematopoietics, and neuronal cells, also presents a great number of stem cells. These cells are pluripotent, so can differentiate in any connective cell when a stimulus is given. The aim of this study was to evaluate bone marrow stem cells adhesion, proliferation, and differentiation to osteoblast in vitro, over a collagen membrane and a poli-lactic (glycolic) acid scaffold (PLGA), using either recombinant human bone morphogenetic protein (rhBMP-4) and platelet rich plasma (PRP). Bone marrow cells were aspirated from iliac crest and purify using specifics techniques. These cells were separated in main big groups cultured over collagen membrane and PLGA scaffold. Each culture had 4 distinct treatments: (1) with rhBMP-4; (2) with rhBMP-4 and PRP; (3) with PRP; and (4) control (only standard medium). The groups were evaluated after 6, 9 14 and 21 days. Microscopic analysis of collagen membrane and PLGA scaffold were performed using either Propidium Iodide, and Eosin and Hematoxilin. Real time PCR was performed to identify the expression level of osteopontin and osteocalcin, and standard PCR to osteopontin. The results showed cellular adhesion in both biomaterials, and suggest a higher cell proliferation and differentiation in rhBMP-4 and PRP, and PRP groups. The groups with rhBMP-4 had more differentiate cells that control group. The data obtained here indicate that PRP and/ or rhBMP-4 induce adhesion, proliferation and differentiation of bone marrow stem cells into osteogenic lineage. / O estroma da medula óssea, além de conter uma população heterogênea de células conjuntivas, nervosas e hematopoiéticas, mantém uma quantidade de células com características de células tronco (células mesenquimais indiferenciadas). Estas possuem capacidade de se diferenciarem em qualquer célula de natureza conjuntiva quando estimuladas pelo organismo. Esta pesquisa teve como objetivo avaliar a adesão, a proliferação e a diferenciação de células mesenquimais da medula óssea cultivadas sobre membrana de colágeno bovino e sobre arcabouço de ácido poliglicólico polilático (PLGA) com a adição do gel de plasma rico em plaquetas (PRP) e/ ou da proteína morfogenética óssea recombinante humana (rhBMP-4). As células foram coletadas da medula óssea da crista do osso ilíaco humana e separadas por técnica específica. As células foram cultivadas em dois suportes: membrana de colágeno e arcabouço de PLGA, e receberam 4 tratamentos distintos: (1) com rhBMP-4, (2) com rhBMP-4 e PRP, (3) com PRP e (4) controle (somente meio de cultura). Os subgrupos foram avaliados em 6, 9, 14 e 21 dias. Foram realizadas análises microscópicas das membranas e arcabouços com as colorações de Iodeto de Propídio e de Hematoxilina e Eosina. Foi feito PCR em tempo real a fim de se avaliar a expressão de osteopontina e osteocalcina e PCR convencional para osteopontina. Os resultados mostraram adesão celular tanto na membrana de colágeno como no arcabouço de PLGA. Sugere-se haver uma maior proliferação e diferenciação celular nos grupos que foram adicionados PRP, e rhBMP-4 e PRP juntos. Nos grupos com rhBMP-4 parece haver uma maior diferenciação celular que o grupo controle. Os dados obtidos indicam que o PRP e/ ou a presença de rhBMP-4 induzem adesão, proliferação e diferenciação de células da medula óssea em células de linhagem osteogênica.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:04:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000407116-Texto+Completo-0.pdf: 4086224 bytes, checksum: 0d63db77cbcec70fa4573faaf2637eea (MD5) Previous issue date: 2008 / The stem cells have potential application to tissue regeneration or tissue engineering. Due to ethical and legal aspects alternative sources are being considered. Several researchers concentrate the studies on adult stem cells, mainly those derived of bone marrow stromal cells. Nevertheless, recent data proved that adult stem cells can also be isolated from adipose tissue (PLA) obtained by liposuction. These cells are able to differentiate into a diversity of mesodermal tissue and among them, bone tissue. The osteoinduction process depends on several factors and consists of mesenquimal stem cells differentiating into osteoprogenitor cells. Frequently, the osteoinduction culture media contains recombinant human bone morphogenetic protein (rhBMP-4) or DAG (dexamethasone, ascorbate acid and -glycerophosphate). This study aims to evaluate the adipose tissue derived stem cells adhesion, proliferation, differentiation into osteoblasts in vitro using either (rhBMP-4) or DAG. Adult stem cells derived from adipose tissue were obtained from three human subjects by liposuction realized by Plastic Surgery Service (Hospital São Lucas- PUCRS). After tissue dissociation by collagenase treatment, the cells were quantified, characterized with regard to cell membrane markers, and cultured in media containing rhBMP-4 or DAG, and control (only standard medium). The cultures were evaluated in 7, 14 and 21 days after induction. The expression of alkaline phosphate, osteopontin and osteocalcin were evaluated by PCR standard technique in cultured cells derived from adipose tissue obtained from two subjects. The expression of osteopontin and osteocalcin in one culture was determined by Real Time PCR technique. Moreover, alkaline phosphatase and von Kossa staining was performed to demonstrate the differentiation into mature osteoblasts by matrix mineralization. The average number of adult stem cells derived from adipose tissue was 1. 2x107/mL. The frequency of CD34 and CD117 markers were similar, 0. 73% and 0. 72% respectively. The frequency of CD105 was higher in the three samples. This study showed that the adult stem cells derived from adipose tissue cultivated or not in osteogenic media adheres and proliferates. Also, we demonstrate the presence of mature osteoblasts when cells were cultured in the presence of medium containing rhBMP-4 or DAG by the expression of osteogenic lineage markers such as alkaline phosphatase, osteopontin, and osteocalcin. Cells cultivated in media containing DAG have also shown deposition of bone matrix protein. / A aplicação de diferentes células-tronco na regeneração de tecidos lesionados ou na engenharia de tecidos tem recebido grande atenção. Devido às dificuldades práticas de obtenção de células-tronco embrionárias e considerando os aspectos éticos e legais, inúmeros pesquisadores têm realizado seus estudos com células-tronco adultas, principalmente aquelas derivadas do estroma da medula óssea. No entanto, estudos recentes comprovam que essa população celular também pode ser isolada do tecido adiposo (PLA) obtida através de lipoaspiração. Esse tipo de célula tem a característica de se diferenciar numa variedade de tecidos mesodérmicos, dentre eles o tecido ósseo. O processo de osteoindução é influenciado por vários fatores e consiste na indução de células-tronco mesenquimais indiferenciadas a formarem células osteoprogenitoras. Os fatores osteoindutores utilizados mais freqüentemente são a rhBMP-4 ou DAG (Dexametasona/ácido ascórbico/b-glicerolfosfato). Este estudo teve como objetivo avaliar a adesão, proliferação e diferenciação de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo quando cultivadas em meio indutor específico, contendo rhBMP-4 ou DAG. Células-tronco adultas foram obtidas do tecido adiposo de três pacientes pela técnica de lipossucção, realizada pelo Serviço de Cirurgia Plástica do Hospital São Lucas da PUCRS. Após tratamento com colagenase para dissociação do tecido, as células foram quantificadas, caracterizadas com relação aos marcadores de membrana celular e cultivadas em meio contendo rhBMP-4, DAG ou convencional (controle). As culturas foram avaliadas no 7º, 14º e 21º dia após indução em meio específico.A expressão da fosfatase alcalina, osteopontina e osteocalcina foram avaliadas pela técnica de RT-PCR nas culturas de células derivadas do tecido adiposo de dois pacientes. A expressão das proteínas osteopontina e osteocalcina foi determinada pela técnica do PCR em tempo real em uma cultura de células derivada de um paciente. Igualmente, nesta mesma cultura foram realizada colorações para fosfatase alcalina e von Kossa para demonstrar a diferenciação das células-tronco mesenquimais (MSC) em células osteoblásticas pela detecção da transformação osteoblástica e mineralização da matriz. O número médio de células tronco adultas derivadas de tecido adiposo foi de 1,2 x 107/mL. A média da freqüência de expressão dos marcadores CD34 e CD117 foram semelhantes, 0,73% e 0,72%, respectivamente, embora tenha ocorrido uma grande variação entre as amostras. Para os marcadores CD45 e CD105 a média das freqüências foram de 1,17% e 1,57%, respectivamente. A freqüência do CD105 foi mais elevada nas três amostras. Este estudo mostrou que as células-tronco adultas derivadas de tecido adiposo cultivadas, ou não em meio osteogênico aderem e proliferam em cultura, sofrem osteoindução e expressam proteínas marcadoras da linhagem osteogênica como a fosfatase alcalina, osteocalcina e osteopontina. Células-tronco adultas derivadas de tecido adiposo são capazes de realizar a deposição de matriz mineralizada somente quando cultivadas em meio contendo DAG.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:05:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000413196-Texto+Parcial-0.pdf: 80871 bytes, checksum: c1dd2f33f2e72ef3b3458fdd98226248 (MD5) Previous issue date: 2009 / OBJECTIVE: To evaluate the in vitro cytotoxicity of poly (L-lactic acid), poly(urethanecaprolactone), poly (glycolic acid), poly (L-lactic acid-co-glycolic), nanofibers of poly (lactide) and in vivo biocompatibility of poly(urethane-caprolactone), as a possible biomaterial for bone and nervous regeneration. METHODS: In this study, was tested in vitro in cell culture of osteoblastic human alveolar bone to poly (L-lactic acid) and poly(urethane-caprolactone). The poly (glycolic acid) and the poly (L-lactic acid - co-glycolic) were tested in cell culture of odontoblastic line of mice (MDPC-23). The poly (lactide) nanofibers were tested in cell culture of fibroblasts of mice, NIH-3T3. The in vivo tests of poly(urethane-caprolactone) were performed in rats, which were separated into 5 groups, based in the time of observation, 7, 14, 30, 60 and 120 days of postoperative, in order to observe the reactions between the biomaterial and bone, nerve and dorsal tissues of the animal. Were performed analyses in light microscopy and scanning electron. RESULTS: The polymer PLLA, PGA, PLGA, and PCL-PU nanofibers of poly (lactide) showed cell viability above 85% in tests in vitro. In vivo tests showed that the PU-PCL is biocompatible and were partially absorbed in 60 days and with no undesirable reactions that could be attributed to the implant. CONCLUSIONS: The poly (L-lactic acid), poly (glycolic acid), poly (L-lactic acid-coglycolic), nanofibers of poly (lactide) and poly(urethane-caprolactone) polymers evaluated in this study showed very favorable results for its use as a biomaterial for applications in tissue replacement. / OBJETIVO: Avaliar a citotoxicidade in vitro do poli(ácido L-láctico), poli(uretanocaprolactona), poli(ácido glicólico),poli(L- ácido láctico-co-glicólico), nanofibras de poli(lactide) e a biocompatibilidade in vivo do poli(uretano-caprolactona), como possível biomaterial para regeneração óssea e nervosa. MÉTODOS: No presente trabalho, foi testado in vitro em cultura de células osteoblásticas de osso alveolar humano o poli(ácido L-láctico) e poli(uretanocaprolactona). O poli(ácido glicólico) e o poli(L- ácido láctico – co- glicólico) foram testados em cultura de células-tronco de linhagem odontoblástica de camundongos (MDPC-23). As nanofibras de poli(lactide) foram testadas em cultura de células de fibroblastos de camundongos, NIH-3T3. Os testes em vivo do poli(uretanocaprolactona) foram em ratos Wistar, separados em 5 grupos, referentes aos tempos de observação de 7, 14, 30, 60 e 120 dias pós-operatórias, a fim de se observar as reações entre este biomaterial e o tecido ósseo, nervoso e dorsal do animal. Foram feitas análises de microscopia óptica e eletrônica de varredura. RESULTADOS: Os polímeros PLLA, PGA, PLGA, PU-PCL e as nanofibras de poli(lactide) mostraram viabilidade celular superior a 85% nos testes in vitro. Nos testes in vivo, o PU-PCL foi biocompatível, parcialmente absorvido em 60 dias e com ausência de reações indesejáveis que pudessem ser atribuídas ao implante. CONCLUSÕES: Os polímeros poli(ácido L-láctico), poli(ácido glicólico), poli(ácido Lláctico- co-glicólico), nanofibras de poli(lactide) e o poli(uretano-caprolactona) avaliados neste estudo, apresentaram resultados bastante favoráveis para seu uso como biomaterial nas aplicações de substituição tecidual.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:04:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000422372-Texto+Completo-0.pdf: 14448387 bytes, checksum: fdc8fa6c2b5c86975a8032bed0f8c5a8 (MD5) Previous issue date: 2010 / Objective: This study evaluates the effect of alpha-tricalcium phosphate cement (U- TCP) and platelet-rich plasma (PRP) on osteogenesis, when used alone or together, comparing to the gold-standard (autologous graft). Material and Methods: Thirty-four Wistar-Kyoto rats were used in this study. A bilateral femur defect was created, and each hole was filled with one of the four types of treatments (autologous bone graft, U-TCP cement, PRP and U-TCP cement+PRP) and evaluated in 4 and 8 weeks. In the control group no filling was applied. The X-ray images provided values of area and longitudinal length of the defect, and the histological images, indicated the new bone formation area. Results: Regarding the effect of the treatments on the bone defect, independently of the time, the X-ray results did not provide sufficient data to confirm important differences in both variables analyzed – area and length (p=0,08). In the histomorphometry, it was observed a better performance of the treatment with autologous bone graft, and it presented significant differences regarding the new bone formation area, independently of the time, compared to the PRP (p=0,05) and control (p=0,041). On the other hand, there were no important differences between autologous graft and the groups U-TCP cement+PRP and U-TCP cement (p>0,05). The treatments PRP, U-TCP cement and U-TCP cement+PRP did not differ significantly from the control group, as well as when they were compared to each other. Conclusion: The data of this study suggest that the treatments with U-TCP cement and PRP, when applied alone or together, do not present positive effect on bone healing. / Objetivo: Avaliar o efeito de cimento de alfa-fosfato tricálcico (U-TCP) e plasma rico em plaquetas (PRP) sobre a osteogênese, quando utilizados isoladamente ou em conjunto, comparando os resultados com o padrão-ouro (enxerto autólogo). Material e Métodos: Trinta e quatro ratos Wistar-Kyoto foram utilizados no estudo. Foi criado um defeito cavitário bilateral no fêmur e cada cavidade foi preenchida com um dos 4 tipos de tratamentos (enxerto autólogo; cimento U-TCP; PRP; cimento U-TCP+PRP), sendo avaliados em 4 e 8 semanas. No grupo controle não foi aplicado nenhum preenchimento. As imagens radiográficas forneceram valores da área e do comprimento longitudinal da lesão, e as imagens histológicas indicaram a área de neoformação óssea. Resultados: Quanto ao efeito dos tratamentos sobre a lesão óssea independentemente do tempo, os resultados radiográficos encontrados não forneceram dados suficientes para comprovar diferenças significativas nas duas variáveis analisadas, área e comprimento (p=0,08). Na histomorfometria, foi observado um melhor desempenho do tratamento com enxerto autólogo, apresentando diferenças significativas quanto à área de neoformação óssea, independente do tempo, em relação aos grupos PRP (p=0,05) e controle (p=0,041). Em contrapartida, não foram verificadas diferenças com significância entre enxerto autólogo e os grupos cimento U-TCP+PRP e cimento U-TCP (p>0,05). Os tratamentos PRP, cimento U-TCP e cimento U-TCP+PRP não diferiram significativamente do grupo controle, assim como não foram evidenciadas diferenças quando comparados entre si. Conclusão: Os dados do presente estudo sugerem que os tratamentos com cimento U-TCP e PRP, aplicados isoladamente ou em conjunto, não demonstram efeito positivo sobre o reparo ósseo.