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1 Abstract Liver fibrosis is a condition described by extensive accumulation of scar tissue in the liver. With further progression, it leads to cirrhosis or even to hepatocellular carcinoma. Liver fibrosis accompanies every chronic liver disease and its prevalence in adult European population is estimated to be around 4%. During my dissertation work, I studied the function of three members of Metzincin family of metalloproteinases - ADAM17, ADAM10 and MMP-19, in liver fibrosis and liver regeneration using mouse genetic models. ADAM17 and ADAM10 are important regulators of signalling pathways which are involved in immune response as well as differentiation. Both proteases are able to cleave ectodomains of their substrates from cell membrane, affecting bioavailability of ligands and functionality of receptors. Several of their substrates are involved in liver pathologies. MMP-19 on the other hand, is a metalloprotease mainly involved in extracellular matrix cleavage, important process in fibrosis development, as well as resolution of fibrosis. Our results demonstrate that ablation of ADAM10 results in increased susceptibility to liver fibrosis in mice, both spontaneous and toxin induced. ADAM10 deficiency affected biliary epithelium, as we detected higher markers of biliary damage in serum of ADAM10 deficient...

Eine Defizienz des LTBP4-Gens ruft schwerwiegende Erkrankungen wie das human autosomal-rezessive Cutis laxa Syndrom Typ 1C (ARCL1C) hervor. Die Interaktion zwischen LTBP4 und TGF-β ist hierbei von pathogenetisch relevanter Bedeutung. Durch fehlende Synthese bzw. Sekretion des TGF β (bedingt durch die LTBP4-Defizienz) kann es zu einer verminderten TGF-β-Aktivität im Lungenparenchym kommen, woraus insgesamt eine fehlerhafte Produktion elastischer Fasern resultiert. Phänotypisch zeigen Patienten Multimorbidität und besonders schwere Defekte in der Lungenentwicklung. Emphyseme infolge fehlerhafter Alveolarisierung und Septierung führen zu früher Mortalität der Patienten innerhalb der ersten Wochen bis Monate. Als Tiermodell wurde die Ltbp4-/- Mauslinie generiert, die nahezu den gleichen Phänotyp aufweist, den auch Patienten mit ARCL1C zeigen. Ziel der Untersuchungen war es, den Einfluss der Pneumozyten Typ I und II auf die gestörte Alveolarisierung, Septierung sowie Angiogenese der Lunge von Ltbp4-/- Mäusen im Vergleich zu WT Mäusen zu überprüfen. Zusätzlich sollte erforscht werden, ob das Sekretom von murinen Ltbp4-/- Lungenfibroblasten (MLF) in vitro die Homöostase der Pneumozyten im Vergleich zu WT MLF hemmt bzw. deren Expression und Sekretion pro- und anti-angiogenetischer Faktoren beeinflusst. In dieser Studie konnte nachgewiesen werden, dass die Defizienz des Ltbp4-Gens postnatal zu schwerwiegenden Lungenmissbildungen und gestörter Alveologenese der Maus führt, wobei sowohl die Pneumozyten Typ I als auch die Pneumozyten Typ II nachweislich in reduzierter Anzahl in Ltbp4-/- Mäusen vorhanden waren. Weiter wurde bestätigt, dass die Pneumozyten Typ II verantwortlich für eine erhöhte Tgf-β-Aktivität sind und somit präfibrotische Prozesse im Lungenparenchym von Ltbp4-/- Mäusen begünstigt werden. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass die Defizienz des Ltbp4 Gens erheblichen Einfluss auf das Sekretom der MLF hat. Da das humane ARCL1C Syndrom ebenfalls ein dysfunktionales LTBP4-Gen aufweist, konnten durch dieses Projekt weitere Erkenntnisse der Pathogenese einer fehlerhaften Alveolarisierung in der Lungenentwicklung gewonnen werden. Von großer Bedeutung ist auch, dass dieses Mausmodell den Phänotyp pädiatrischer Lungenerkrankungen aufweist, sodass diese Erkenntnisse zum Verständnis der Pathogenese der prä- und neonatalen Entwicklung pädiatrischer Lungenerkankungen beitragen.:Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1 2. Literaturübersicht 3 2.1 Die Lunge 3 2.2 Morphologie der Lunge 4 2.3 Alveolarepithel 4 2.4 Die Blut-Gas-Schranke 6 2.5 Embryologie der Lunge 6 2.6 Anatomie der Lunge von Maus und Mensch im Vergleich 9 2.7 LTBP – latent TGF-β bindende Proteine 10 2.8 Isoformen des LTBPs 13 2.9 Ltbp4 in der Lunge 15 2.10 Angiogenese 15 2.11 Autosomal-rezessives Cutis laxa Syndrom Typ 1C 17 3. Tiere, Material und Methoden 19 3.1 Tiere 19 3.2 Material 20 3.2.1 Geräte 20 3.2.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien 22 3.2.3 Kits und Assays 25 3.2.4 Puffer und Lösungen 26 3.2.5 Gele 28 3.2.6 Antikörper 28 3.2.7 Primer 29 3.3 Zelllinien 30 3.4 Methoden 31 3.5 Organentnahme der Versuchstiere 31 3.6 Histologie 33 3.7 Zellkultur 34 3.7.1 Isolierung primärer muriner Lungenfibroblasten 35 3.7.2 MLE 12-Zellkultivierung 36 3.7.3 Tube Formation Assay 36 3.7.4 TGF-β Minc Lung Assay 37 3.7.5 Proliferations Assay 39 3.7.6 Viabilitäts Assay 40 3.7.7 Caspase-3 Assay 40 3.7.8 Fluoreszenz Activating Cell Sorting (FACS) 41 3.8 Molekularbiologische Methoden 44 3.8.1 Genotypisierung 44 3.8.2 Polymerase-Ketten-Reaktion 45 3.8.3 Western Blot 47 3.8.4 RNA-Isolierung mit konditioniertem Medium MLF stimulierter MLE 12-Zellen 50 3.8.5 cDNA-Synthese und Aktin-Kontroll-PCR 51 3.8.6 Real time quantitative PCR 53 3.9 Statistische Auswertung 55 4. Ergebnisse 56 4.1 Lungen von Ltbp4-/- Mäusen weisen eine reduzierte Anzahl von Pneumozyten Typ II auf 56 4.2 Lungen von Ltbp4-/- Mäusen weisen eine reduzierte Anzahl von Pneumozyten Typ I auf 59 4.3 Aktivierung von Tgf-β nach Stimulation mit konditioniertem Medium von Ltbp4-/- MLF in MLE 12-Zellen 61 4.4 Konditioniertes Medium von Ltbp4-/- MLF vermindert die Proliferation von MLE 12-Zellen und erhöht die Viabilität 63 4.5 Die Apoptoserate (Casp3/7) der MLE 12-Zellen nach Stimulation mit konditio-niertem Medium von Ltbp4-/- MLF wird nicht beeinflusst 64 4.6 mRNA Expression von Sp-C und Sp-B in MLE 12-Zellen nach Stimulation mit konditioniertem Medium von Ltbp4-/- MLF 64 4.7 MLE 12-Zellen weisen eine erhöhte mRNA Expression von Ltbp1 und eine unveränderte mRNA Expression von Ltbp4 nach Stimulation mit konditioniertem Medium von Ltbp4-/- MLF auf 65 4.8 Die angiogene Stimulation von Endothelzellen und die mRNA Expression angiogener Faktoren von MLE 12-Zellen, die mit konditioniertem Medium von Ltbp4-/- MLF vergleichend zum WT MLF stimuliert wurden, wird stark beeinflusst 66 5. Diskussion 69 6. Zusammenfassung 80 7. Summary 82 8. Literaturverzeichnis 84 9. Anhang 91

Wir untersuchten Liquor- und Serumproben von 40 an einem shuntversorgten Hydrocephalus erkrankten Kindern auf die Konzentration der Zytokine bFGF, TGF-β1, VEGF, IL-6, IGF-1 und Leptin sowie deren Korrelation mit dem Risiko von Shuntinsuffizienzen. Dabei konnten wir die Hypothese bestätigen, dass erhöhte Konzentration der fibrogenen Zytokine bFGF und TGF-β1 im Serum bzw. Liquor mit einem erhöhten Risiko für operationspflichtige Shuntinsuffizienzen durch Obstruktion des Schlauchsystems einhergehen, und dass diese Komplikationen mit steigenden Zytokinkonzentrationen umso eher eintreten. Außerdem war bFGF im Liquor von Kindern, die zum Abnahmezeitpunkt an einer Shuntdysfunktion durch Obstruktion oder Einwachsen des Shunts litten, signifikant höher als bei Kindern, die zum Zeitpunkt der Abnahme keine Shuntdysfunktion aus eben genannten Gründen hatten. Des Weiteren fanden wir Konzentrationsunterschiede für IL-6 im Liquor zwischen den einzelnen Ursachen der Erkrankung, wobei das Zytokin am höchsten bei Tumorpatienten war, gefolgt von posthämorrhagischem und postmeningitischem Hydrocephalus, und am niedrigsten bei Kindern mit kongenitaler ZNS-Fehlbildung.

京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第13031号 / 論医博第2113号 / 新制||医||1016(附属図書館) / 32989 / (主査)教授 妻木 範行, 教授 安達 泰治, 教授 開 祐司 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20080号 / 医博第4173号 / 新制||医||1018(附属図書館) / 33196 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 長船 健二, 教授 川口 義弥, 教授 小川 修 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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Myostatin (GDF-8) is the chief chalone in skeletal muscle and negatively controls adult skeletal muscle growth. The role of myostatin during overload-induced hypertrophy of adult muscle is unclear. We tested the hypothesis that overloaded adult rodent skeletal muscle would result in reduced myostatin protein levels. Overload-induced hypertrophy was accomplished by unilateral tenotomy of the gastrocnemius tendon in male adult Sprague-Dawley rats followed by a two-week period of compensatory overload of the plantaris and soleus muscles. Western blot analysis was performed to evaluate changes in active, latent and precursor myostatin protein levels. Significant hypertrophy was noted in the plantaris (494 ± 29 vs. 405 ± 15 mg, p < 0.05) and soleus (289 ± 12 vs. 179 ± 37 mg, p < 0.05) muscles following overload. Overloaded soleus muscle decreased the concentration of active myostatin protein by 32.7 ± 9.4% (p < 0.01) while the myostatin precursor protein was unchanged. Overloaded plantaris muscle decreased the concentration of active myostatin protein by 28.5 ± 8.5% (p < 0.01) while myostatin precursor levels were reduced by 17.5 ± 5.9% (p < 0.05). Myostatin latent complex concentration decreased in the overloaded soleus and plantaris muscle by 15.0 ± 5.9% and 70.0 ± 2.3% (p < 0.05), respectively. These data support the hypothesis that the myostatin signaling pathway in overloaded muscles is generally downregulated and contributes to muscle hypertrophy. Plasma concentrations of total and active myostatin proteins were similar in overloaded and control animals and averaged 8865 ± 526 pg/ml and 569 ± 28 pg/ml, respectively. Tissue levels of BMP-1, an extracellular proteinase that converts myostatin to its active form, also decreased in overloaded soleus and plantaris muscles by 40.4 ± 12.9% and 32.9 ± 6.9% (p < 0.01), respectively. These data support the hypothesis that local, rather than systemic, regulation of myostatin contributes to the growth of individual muscles, and that an association exists between the extracellular matrix proteinase BMP-1 and the amount of active myostatin in overloaded muscles.

Patients with classical vitiligo lose partially their protecting inherited pigment. The cause of the disease is still unknown. Despite massive epidermal oxidative / nitrative stress and signs for DNA-damage in the skin and in the plasma, these patients have no higher prevalence for sun induced non-melanoma skin cancer and increased photo-damage. Protection and DNA-repair have been attributed to a functioning up-regulated wild type p53 / p21 cascade in association with up-regulated p76 MDM2. As some patients with cutaneous melanoma develop depigmentations away from their primary tumour site post surgical excision, it became of our interest, whether this melanoma associated leucoderma (MAL) is the same as classical vitiligo. The purpose of this thesis was two-fold. In part I, we wanted to further substantiate the reasons behind the constantly up-regulated wild-type functioning p53 / p21 cascade in classical vitiligo utilising a panel of proteins with direct and / or indirect action on p53 regulation, including p21, p76MDM2, MDM4/MDM4phospho, SPARC, VEGF-A and TGF-β1. In part II, we wanted to characterize MAL and compare this peculiar leucoderma with classical vitiligo using the same protein panel and methodologies. To achieve our goals, we used in vivo FT-Raman spectroscopy, in vitro cell cultures, in vitro and in situ immuno-fluorescence labelling, Western blot, dot blot and computer modelling techniques. Our data showed distinct differences between classical vitiligo and MAL. Our results in MAL exhibited a concentration dependent protein expression gradient between the basal / suprabasl layers and the upper layers of the epidermal compartment using catalase, ONOO-, p53, p21, MDM4, p76MDM2, TGF-β1 and VEGF-A expression gradient. Moreover, we document for the first time the presence of a nitrated non-fuctional SPARC protein in classical vitiligo which is absent in MAL. Although we show in vivo considerable ROS / RNS- mediated stress in MAL and classical vitiligo documented by FT-Raman spectroscopy, Western blot and in situ immuno-fluorescence, our results prove that MAL and classical vitiligo are two distinct entities.

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