Mit zunehmender Etablierung der Implantattherapie im zahnärztlichen Alltag stellt die Reduzierung der Einheilzeit durch Oberflächenoptimierung eine der Hauptbestrebungen der forschenden Industrie dar. Dazu treten ästhetische Patientenwünsche nach „weißen“ Materialien, die am ehesten durch das jedoch frakturgefährdete Zirkonmischoxid zu realisieren sind. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Osteokompatibilität verschiedener, metallener Probekörper mit „Zirkoniummischoxidbeschichtung“, in der humanen enoralen Knochenzellkultur. Unter Verwendung einer männlichen Knochenzellkultur über 10 Tage wurden die Expressionen der nonkollagenen Knochenmatrixproteine, Osteocalcin, Osteonectin und Bone Sialo Protein sowie des Wachstumsfaktors TGF-β auf 3 Standardoberflächen und 5 experimentell hergestellten Zirkoniummischoxidoberflächen bestimmt. Es galt zu ermitteln, ob die chemische Zusammensetzung und die Mikrostruktur der getesteten Probekörper Einfluss auf die Proteinexpression haben. Die gewonnenen Versuchsergebnisse lassen vermuten, dass vor allem die Oberflächenkonfigurationen der Experimentaloberflächen 3 (ZSG ½), 4 (ZS4-0,5) und 5 (ZS4-2) die Sekretion o.g. Knochenproteine im Vergleich zu den anderen Experimentaloberflächen sowie dem metallenen Positivstandard (PK7) und dem Negativstandard (PK8) begünstigen. Des Weiteren kann für den als keramischen Positivstandard verwendeten CERCON® Probekörper (PK6) auf Grund der Ergebnisse eine gute biologische Eignung in vitro angenommen werden. Von weiteren Versuchen, welche mit mind. 6 Probekörpern pro Standzeit und Marker durchgeführt werden sollten, lässt sich keine der verwendeten Experimentaloberflächen gerechtfertigt ausschließen.

Contexte: La néovascularisation pathologique oculaire entraîne plusieurs troubles de la cécité, y compris la dégénérescence maculaire néovasculaire liée à l'âge (nDMLA) et la rétinopathie de la prématurité (ROP). La nDMLA est la principale cause de cécité dans le monde industrialisé avec un impact socio-économique considérable (1-6). Les thérapies palliatives actuelles reposent sur la suppression du facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF), prouvé sûr et efficace (7-19). Cependant, certains patients résistent aux injections intravitréennes mensuelles répétées d'anti-VEGF, et les conséquences à long terme comprennent une perte de vision supplémentaire et une atrophie géographique (10, 14, 17, 18, 20-27). Cliniquement, il existe un besoin de nouvelles cibles combinatoires ou alternatives dans les cliniques, permettant de réduire les doses d'anti-VEGF, de traiter et d'étendre un intervalle approprié personnalisé à chaque patient non répondeur, et de minimiser la charge des injections répétées (24, 25, 28, 29). La famille TGF-β et sa sous-famille BMP sont cruciales dans l'angiogenèse oculaire physiologique dans un modèle de ROP, et pourraient être des cibles thérapeutiques potentielles chez les patients souffrant d’une nDMLA (30-66). Hypothèse: COCO, un membre de la famille DAN, un modulateur connu des voies BMP et TGF-β, agit comme un facteur neurotrophique sur les progéniteurs de photorécepteurs humains en culture. Nous émettons l'hypothèse que les effets neurotrophiques et anti-angiogéniques de COCO pourraient être des approches thérapeutiques bénéfiques pour empêcher la néovascularisation dans la nDMLA ou la ROP. Objectifs: Objectif 1: Pour évaluer le rôle du COCO sur les maladies oculaires néovasculaires, nous proposons d'étudier ses effets sur la néovascularisation rétinienne et choroïdienne dans le développement et des modèles pathologiques de la DMLA et de la ROP lors d'injections intravitréennes. Objectif 2: Pour comprendre le rôle physiologique et le mécanisme d'action du COCO, nous évaluerons les effets de COCO endogène au cours de l'angiogenèse et du développement vasculaire oculaire. Conclusions: Nous avons découvert un nouvel inhibiteur de l'angiogenèse, COCO, un membre de la famille des protéines DAN. COCO abroge la migration et la prolifération des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine, en partie grâce à sa régulation des voies TGF-β et BMP et à une modification du métabolisme cellulaire et des gènes mitochondriaux. Les injections intravitréennes de COCO suppriment la vascularisation rétinienne en cours du développement et dans un modèle expérimental de ROP. COCO inhibe de la même manière la néovascularisation choroïdienne dans un modèle de DMLA. De plus, COCO empêche l'angiogenèse rétinienne développementale sans affecter le système vasculaire mature. L'examen des souris Dand5 (COCO) KO a également montré un phénotype de développement rétinien léger à P12 ainsi qu'une exacerbation des touffes néovasculaires dans un modèle de rétinopathie induite par l'oxygène. Impact: Nos données montrent que COCO inhibe la néovascularisation rétinienne et choroïdienne et pourrait être une nouvelle thérapie possible pour des maladies oculaires. Nos études fournissent des données sur les impacts de COCO sur le développement vasculaire rétinien, établissent ses caractéristiques moléculaires et déterminent son importance biologique. / Background: Ocular pathological neovascularization leads to several blinding disorders, including neovascular age‐related macular degeneration (nAMD) and retinopathy of prematurity (ROP). nAMD, for instance, is the primary cause of blindness in the industrialized world with a tremendous socioeconomic impact (1-6). Current palliative therapies rely on suppressing vascular endothelial growth factor (VEGF), proven safe and effective (7-19). However, some patients are resistant to monthly repeated intravitreal injections of anti-VEGF, and long-term consequences comprise further vision loss and geographic atrophy (10, 14, 17, 18, 20-27). Clinically, there is a necessity for novel combinatory or synergistic therapeutic targets to reduce anti-VEGF treatment adherence. Novel personalized therapies to each non-responder patient may increase efficiency while minimizing the burden of repeated injections (24, 25, 28, 29). The TGF-β family, specifically the BMPs subfamily of proteins, is crucial in pathological ocular angiogenesis in a model of pre-retinal neovascularization. These alternative pathways could be potential therapeutic targets in nAMD patients as well (30-66). Hypothesis: COCO, a member of the DAN family, is a known modulator of BMP and TGF-β pathways and acts as a neurotrophic factor on cultured human photoreceptor progenitors. We hypothesize that COCO’s neurotrophic and anti-angiogenic effects could exert therapeutic benefits to preclude neovascularization in nAMD or ROP. Objectives: Aim 1: To assess the role of COCO on neovascular ocular diseases, we propose investigating its effects on retinal and choroidal neovascularization in the development and pathological models of AMD and ROP upon intravitreal injections. Aim 2: To understand COCO's physiological role and mechanism of action, we evaluate the exogenous and endogenous effects of COCO during angiogenesis and ocular vascular development. Conclusions: We discovered a novel inhibitor of angiogenesis, COCO, a DAN protein family member. COCO abrogated sprouting migration and cellular proliferation of human umbilical vein endothelial cells, partly through its regulation of TGF-β and BMP pathways and cellular metabolism. Intravitreal injections of COCO suppress retinal vascularization in development and an experimental model of ROP. COCO similarly inhibits choroidal neovascularization in an nAMD model. COCO prevents developmental retinal angiogenesis without affecting the mature vasculature. Examination of Dand5 (COCO) KO mice also shows a mild retinal developmental phenotype at P12 as well as an exacerbation of neovascular tufts in a model of oxygen-induced retinopathy. Impact: Our data show that COCO inhibits retinal and choroidal neovascularization and could be of potential therapeutic use in treating neovascular ocular diseases. Our studies set grounds for understanding the role of COCO during retinal vascular development, characterizing its molecular features, and determining its biologic significance.

[ES] La presente tesis doctoral titulada "New advanced anti-tumor therapies based on hybrid mesoporous nanodevices" se centra en el diseño, síntesis, caracterización y evaluación de nuevos nanodispositivos híbridos orgánico-inorgánicos. En concreto, se han desarrollado nanopartículas de sílice mesoporosas (MSNs) y nanopartículas Janus combinando MSNs con platino y con oro con el objetivo de mejorar los tratamientos anti-tumorales. El primer capítulo es una introducción general que incluye una visión global del contexto en el que se enmarca la investigación realizada. En particular, se incluye información básica sobre los diferentes tipos de nanopartículas empleados en esta tesis doctoral, así como la descripción de la enfermedad del cáncer y la aplicación de los nanomateriales como terapia. A continuación, en el segundo capítulo, se presentan los objetivos generales y específicos de esta tesis doctoral. Los capítulos tercero y cuarto describen dos estrategias terapéuticas basadas en el desarrollo de nanopartículas con movimiento para mejorar la terapia antitumoral. Concretamente, en el primer capítulo experimental se presenta un nanodispositivo autopropulsado para la liberación controlada de fármacos en respuesta al glutatión (GSH) intracelular. Éste se basa en nanopartículas tipo Janus compuestas por sílice mesoporosa y oro, funcionalizadas en la parte del oro con la enzima catalasa, cargadas con doxorrubicina y con cadenas de oligo(etilenglicol) (S-S-PEG) unidas por puentes disulfuro en la cara de la sílice. Una vez sintetizado y caracterizado el dispositivo, se confirmó su movimiento y se demostró el funcionamiento de la puerta molecular. Finalmente, la internalización celular y la liberación de doxorrubicina se estudiaron en cultivos celulares. Motivados por los resultados anteriores, en el cuarto capítulo se describe un nuevo nanomotor diseñado como tratamiento antitumoral y similar al anterior. En este caso, la nanopartícula Janus desarrollada está compuesta por una nanopartícula de sílice mesoporosa junto con una de platino, cargada con doxorrubicina y cubierta con S-S-PEG. Al igual que en el trabajo anterior, se consigue la autopropulsión del dispositivo. Además, se obtuvo el perfil cinético de liberación del cargo en respuesta a estímulos y se confirmó su aplicación en cultivos celulares. Los capítulos cinco y seis se centran en una estrategia terapéutica nueva que consiste en potenciar la acción del sistema inmune sobre el tumor para conseguir su eliminación. En el primero de estos capítulos experimentales, se utilizaron nanopartículas MSNs cargadas con el fármaco JQ-1 y un siRNA frente al factor de crecimiento transformante ßeta (TGF-ß) como inmunoterapia. Una vez sintetizadas y caracterizadas, se confirmó la capacidad de estas nanopartículas para llevar a cabo la liberación de los cargos, junto con la disminución en la expresión de PD-L1 y en la producción de TGF-ß. Por último, se confirmó su aplicabilidad al ser capaces de inducir la eliminación de células de melanoma por el sistema inmune. De acuerdo con el último capítulo experimental, se describe un nuevo enfoque inmunoterapéutico basado en la comunicación química. En este caso, empleamos una nanopartícula Janus de oro y sílice funcionalizada con un péptido llamado pHLIP en la cara de sílice y el anticuerpo contra el receptor PD-1 unido a la cara de oro (J-pHLIP-PD1). La membrana de la célula tumoral es decorada por este nanodispositivo y gracias a la exposición del anticuerpo PD-1, se consiguió atrapar a los linfocitos T circulantes, desencadenando la eliminación de células tumorales por el sistema inmunitario. Además, estos resultados se confirmaron en un modelo metastásico B16-F10-Luc con una reducción de nódulos metastáticos. Finalmente, en el capítulo séptimo y octavo, se aborda la discusión general y las conclusiones derivadas de los estudios experimentales presentados en esta tesis doctoral. / [CA] Aquesta tesi doctoral titulada "New advanced anti-tumor therapies based on hybrid mesoporous nanodevices" se centra en el disseny, síntesi, caracterització i avaluació de nous nanodispositius híbrids orgànic-inorgànics. En concret, s'han desenvolupat nanopartícules de sílice mesoporoses (MSNs) i nanopartícules Janus combinant MSNs amb platí i amb or per al tractament antitumoral. El primer capítol és una introducció general que inclou una visió global del context on s'emmarca la recerca realitzada. En particular, es presenta informació bàsica sobre les nanopartícules emprades en aquesta tesi doctoral, així com la descripció de la malaltia del càncer i l'aplicació dels nanomaterials com a teràpia. A continuació, al segon capítol, es presenten els objectius generals i específics d'aquesta tesi doctoral. Els capítols tercer i quart descriuen dues estratègies terapèutiques basades en el desenvolupmanet de nanopartícules amb moviment per aconseguir una millora de la terapia antitumoral. Concretament, al primer capítol experimental es presenta un nanodispositiu autopropulsat per a l'alliberament controlat de fàrmacs en resposta al glutatió (GSH) intracel·lular. Aquest es basa en nanopartícules tipus Janus compostes per sílice mesoporosa i or, funcionalitzades a la part de l'or amb l'enzim catalasa, carregades amb doxorrubicina i amb cadenes d'oligo(etilenglicol) (SS-PEG) unides per ponts disulfur a la cara de la sílice. Una vegada sintetitzat i caracteritzat el dispositiu, es va confirmar la seua capacitat de moviment i es va demostrar el funcionament correcte de la porta molecular. Finalment, la internalització cel·lular i l'alliberament de doxorrubicina es van estudiar en cultius cel·lulars. Motivats pels resultats anteriors, al quart capítol es descriu un nanomotor nou dissenyat com a tractament antitumoral i similar a l'anterior. En aquest cas, la nanopartícula Janus desenvolupada està composta per una nanopartícula de sílice mesoporosa juntament amb una de platí, carregada amb doxorrubicina i coberta amb S-S-PEG. Igual que en el treball anterior, s'aconsegueix autopropulsió del dispositiu. A més, es va obtenir el perfil cinètic d'alliberament del càrrec en resposta a estímuls i se'n va confirmar l'aplicació en cultius cel·lulars. Els capítols cinc i sis se centren en una estratègia terapèutica nova que consisteix a potenciar l'acció del sistema immune sobre el tumor per aconseguir-ne l'eliminació. Al primer d'aquests capítols experimentals, es van utilitzar nanopartícules MSNs carregades amb el fàrmac JQ-1 i un siRNA davant del factor de creixement transformant ßeta (TGF-ß) com a immunoteràpia. Un cop sintetitzades i caracteritzades, es va confirmar la capacitat d'aquestes nanopartícules per dur a terme l'alliberament dels càrrecs, juntament amb la disminució de l'expressió de PD-L1 i de la producció de TGF-ß. Finalment, se'n va confirmar l'aplicabilitat en ser capaços d'induir l'eliminació de cèl·lules de melanoma pel sistema immune. D'acord amb el darrer capítol experimental, es descriu un nou enfocament immunoterapèutic basat en la comunicació química. En aquest cas, fem servir una nanopartícula Janus d'or i sílice funcionalitzada amb un pèptid anomenat pHLIP a la cara de sílice i l'anticòs contra el receptor PD-1 unit a la cara d'or (J-pHLIP-PD1). La membrana de la cèl·lula tumoral és decorada per aquest nanodispositiu i gràcies a l'exposició de l'anticòs PD-1, es va aconseguir atrapar els limfòcits T circulants, desencadenant l'eliminació de cèl·lules tumorals pel sistema immunitari. A més, aquests resultats es van confirmar en un model metastàtic B16-F10-Luc amb una reducció de nòduls metastàtics. Finalment, al capítol setè i vuitè, s'aborda la discussió general i les conclusions derivades dels estudis experimentals presentats en aquesta tesi doctoral. / [EN] The present PhD thesis entitled "New advanced anti-tumor therapies based on hybrid mesoporous nanodevices" focuses on the design, synthesis, characterization, and evaluation of new hybrid organic-inorganic nanodevices. We have developed mesoporous silica nanoparticles (MSNs) and Janus platinum-MSN and gold-MSN nanoparticles for tumor treatment. The first chapter is a general introduction that includes an overview of the context related to the research developed in this thesis. In particular, it includes basic information about different nanoparticles used in this doctoral thesis along with the description of cancer disease characteristics and the application of nanomaterials as therapy. Next, in the second chapter, the general and specific objectives of this Ph.D. thesis are presented. The third and fourth chapters describe two nanotechnology-based therapeutic strategies based on the development of nanomotors to improve cancer therapy. Specifically, the first experimental chapter presents a self-moving nanodevice for controlled drug release in response to intracellular glutathione (GSH). It is based on Janus gold-mesoporous silica nanoparticles functionalized with the enzyme catalase in the gold face, loaded with doxorubicin and capped with disulfide-linked oligo(ethylene glycol) (S-S-PEG) chains on the silica face. Once synthesized and characterized, the nanosystem motion was confirmed and the proper gating mechanism of the nanodevice was proven. Finally, the cellular uptake and doxorubicin release capacity have been demonstrated in cell cultures. Encouraged by the above results, chapter four describes a similar nanomotor design for antitumor therapy. In this case, the nanoparticle developed is composed of a Janus platinum-mesoporous silica nanoparticle, loaded with doxorubicin, and capped with S-S-PEG. As well as in the previous work, self-propulsion of the nanoparticles was achieved. Moreover, the stimuli-responsive cargo release kinetic profile was obtained and its application was confirmed in cell cultures. Chapters five and six focus on a new therapeutic strategy, empowering the immune system action on tumors to reach tumor cell death. In the first of these experimental chapters, JQ-1 and transforming growth factor-beta (TGF-ß) siRNA-loaded nanoparticles were used as efficient tumor immunotherapy. Once synthesized and characterized, the efficient cargo delivery was accomplished along with the programmed death-ligand 1 (PD-L1) downregulation and TGF-ß silencing. Lastly, its application was confirmed by triggering a specific immunogenic removal of tumor cells in melanoma cells. In chapter six, the development of a new communication-based immunotherapeutic approach is reported. In this case, we employ Janus gold-MSN functionalized with a peptide called pHLIP onto silica face and anti-PD-1 antibody bound to gold face (J-pHLIP-PD1). Tumor cell membrane is decorated by this nanodevice, leaving exposed on the surface PD-1 antibody which catches circulating T lymphocytes. It triggers immune system-induced-tumor leveling. Moreover, J-pHLIP-PD1 treatment-associated reduction of metastatic burden was also proven. Finally, in the seventh and eighth chapter, the general discussion and conclusions derived from the presented experimental studies of this Ph.D. thesis are exposed. / The authors thank the Spanish Government (Projects MAT2015-64139-C4-1, AGL2015-70235-C2-2-R, CTQ2014-58989-P, CTQ2015-71936-REDT and CTQ2017-87954-P) and the Generalitat Valencia (PROMETEO/2018/024) for support. The Comunidad de Madrid (IND2017/BMD-7642) is also gratefully acknowledged. The authors thank the Spanish Government (project PID2021-126304OB-C41, (MCUI/FEDER, EU)) and the Generalitat Valenciana (project PROMETEO CIPROM/2021/007). E.L-S is grateful for her FPU fellowship funded by MINECO (FPU18/06539). This work was supported by the European Research Council (ERC) via Advanced Grant (101052997, EDISON). This study forms part of the Advanced Materials program (MFA/2022/049) and was supported by MCIN with funding from European Union NextGenerationEU (PRTR-C17.I1) and by Generalitat Valenciana. This work was supported by the European Research Council (ERC) via Advanced Grant (101052997, EDISON) and by CIBER -Consorcio Centro de Investigación Biomédica en Red- (CB06/01/2012), Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Ciencia e Innovación. / Lucena Sánchez, E. (2024). New advanced anti-tumor therapies based on hybrid mesoporous nanodevices [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/205528

Hintergrund. Die gegensätzlichen Wirkungen des L-Arginin-NO-Stoffwechsels bei Nierenerkrankungen wurden nachgewiesen. Die vorliegende Studie untersucht die Haupt-Endstrecke dieses Stoffwechselweges, die NO-cGMP-Signaltransduktion, sowie die Wirkung des spezifischen sGC-Stimulators Bay 41-2272 auf Schädigungs-, Matrixexpansions- und Progressionsphase der Anti-Thy1-induzierten Nierenerkrankungen im Rattenmodell. Methoden. Die anti-Thy1-Antikörperinjektion in zwei Nieren- oder uninephrektomierten Ratten induzierte eine Sequenz der Schädigungs-, Matrixexpansions- und Progressionsphase. Die Effekte der Behandlung mit Bay 41-2272 (10 mg/kg Körpergewicht/Tag) wurden durch die Messungen von systolischem Blutdruck, Proteinurie, Nierenfunktion, glomerulärer und interstitieller Matrixakkumulation, TGF-beta1-, Fibronectin- und PAI-1-Expression, Makrophageninfiltration, alpha1sGC, beta1sGC, sowie basaler und NO-stimulierter renaler cGMP-Produktion ermittelt. Im chronischen Anti-Thy1 Modell wurden die Effekte von Bay 41-2272 mit dem reinen Vasodilator Hydralazin (15 mg/kg Körpergewicht/Tag) verglichen. Ergebnisse. Im Vergleich zu den Kontrollen sind die sGC mRNA Expression und Aktivität signifikant im Matrixexpansionsprotokoll erhört, während sie im Schädigungsprotokoll komplett vermindert sind; im Progressionsprotokoll ist die sGC-cGMP-Kaskade im Tubulointerstitium hochreguliert, während die Aktivität im Glomeruli erniedrigt ist. Im Gegensatz zur Hydralazin-therapie erhörte die Bay 41-2272-Behandlung die glomeruläre und die tubulointerstitielle NO-cGMP-Signaltransduktion. Dies führte zu deutlich verringerten Makrophageninfiltration, Matrixakkumulation sowie einer verbesserten Nierenfunktion. Schlussfolgerung. Die Expression und Aktivität der sGC sind auf Transkriptionsebene im Verlauf der Nierenfibrose hochreguliert und korrelieren eng mit den pathologischen Veränderungen in den einzelnen Krankheitsphasen. Pharmakologische sGC-Stimulation reduzierte die TGF-beta-Überexpression sowie die Matrixakkumulation und verlangsamte den fortschreitenden Verlauf zur tubulointerstitiellen Fibrose und eingeschränkten Nierenfunktion über teilweise blutdruckunabhängige Mechanismen, obwohl die Mesangialzelllyse infolge der verminderten sGC-Expression unbeeinflusst blieb. Die Ergebnisse zeigen, dass die NO-cGMP-Signaltransduktion ein wichtiger antifibrotischer Mechanismus bei Nierenfibrose ist. / Background Controversial effects of L-arginine-NO pathway have been shown on renal disease. The present study analyzes the main downstream of L-arginine-NO pathway, the NO-cGMP signaling in and the effect of the specific sGC stimulator Bay 41-2272 on the injury, matrix expansion and progression phases in the rat model of anti-thy1-induced renal disease. Methods The injection of anti-thy1 antibody into rats with two kidneys or nephrectomized rats caused a sequence of the injury, matrix expansion and progression phases. The effects of Bay 41-2272 (10 mg/kg body weight/d) treatment on systolic blood pressure, proteinuria, kidney function, glomerular and tubulointerstitial matrix protein accumulation, expression of TGF- beta1, fibronectin and PAI-1, macrophage infiltration, alpha1sGC and beta1sGC mRNA expression and basal and NO-stimulated renal cGMP production were determined. In the chronic anti-thy1 model, the effect of Bay 41-2272 was compared side-by-side to the sole vasodilator hydralazine (15 mg/kg body weight/d). Results Compared to controls, sGC mRNA expression and activity were markedly increased in the matrix expansion protocol, while they were almost completely disrupted in the injury protocol; in the progression protocol, sGC-cGMP cascade was up-regulated in the tubulointerstitium, while its activity was decreased in glomeruli. In contrast to hydralazine therapy, Bay 41-2272 treatment enhanced both glomerular and tubulointerstitial NO-cGMP signaling significantly, resulting in markedly reduced macrophage infiltration, matrix expression and accumulation as well as improved kidney function. Conclusion The expression and activity of sGC are highly regulated at the transcriptional level during the course of renal fibrosis, and correlate closely with the pathological changes from the injury over the matrix expansion toward the final progression phase. Further pharmacologic sGC stimulation reduced TGF-beta overexpression and extracellular matrix accumulation and limited the progressive course of this model towards tubulointerstitial fibrosis and impaired renal function at least in part in a blood pressure-independent manner, although it demonstrated no effects on mesangial cell lysis due to lack of the receptor sGC. The results suggest that NO-cGMP signaling represents an important anti-fibrotic pathway in renal fibrosis.

Hintergrund. L-Arginin spielt eine komplexe Rolle in der renalen Matrixexpansion, eingeschlossen der endogene Stoffwechsel der Aminosäure in Stickoxid (NO), Polyamine, L-Prolin und Agmatin. Bei Ratten mit einer induzierten Anti-Thy1-Glomerulonephritis (GN) ist gezeigt worden, dass die diätetische Gabe von L-Arginin die Überproduktion von transforming growth factor (TGF)-beta sowie die Matrixakkumulation limitieren konnte. Die vorliegende Studie testet die Hypothese, dass die günstigen Effekte auf die Überexpression von TGF-beta in vivo durch die Generierung von NO vermittelt wird. Methoden. Einen Tag nach Induktion einer Anti-Thy-1-Glomerulonephritis wurden männliche Wistar Ratten, die mit normal proteinhaltigen Futter ernährt worden sind, in die folgenden Gruppen zugeordnet worden: (1) normale Kontrollen; (2) GN; (3) GN-Arg [plus 500 mg L-Arginin/die]; (4) GN-Arg-NAME [plus 500 mg L-Arginin/die und 75 mg/die des NO-Synthase-Inhibitors Nitro-L-Arginin-Methyl-Ester (L-NAME) im Trinkwasser] und (5) GN-Molsi [plus 10 mg/die des NO-Donors Molsidomin]. In Versuchsprotokoll 1 wurde die Behandlung bis Tag 7, in Protokoll 2 bis Tag 12 nach Induktion der Glomerulonephritis durchgeführt. Analysiert wurden die Daten des systolischen Blutdrucks, die histologische glomeruläre Matrixexpansion, die Proteinurie sowie die glomeruläre mRNA- und Protein-Expression des Schlüsselfibrogens TGF-beta, des Matrixproteins Fibronektin und des Protease-Inhibitors Plasminogen-Aktivator-Inhibitor Typ 1(PAI-1). Ergebnisse. Die Blutdruckwerte zeigten sich normal in unbehandelten Anti-Thy-1-Tieren und nicht signifikant beeinflusst durch eine der Behandlungen. Verglichen mit unbehandelten, nephritischen Ratten, reduzierten die Gabe von L-Arginin sowie von Molsidomin signifikant die glomeruläre TGF-beta Überexpression und auch in ähnlichem Mass in beiden Studienprotokollen. Die günstigen Effekte von L-Arginin wurden durch gleichzeitige Blockade der NOS-Synthese mit L-NAME aufgehoben. Die glomeruläre Matrixakkumulation, Fibronektin und PAI-1 mRNA- und Protein-Expression folgten eng der TGF-beta-Expression. Die Proteinurie wurde durch keine der Behandlungen signifikant beeinflusst.Schlussfolgerung. Die vorliegende Studie zeigt, dass die antifibrotischen Effekte der Aminosäure L-Arginin in der normotensiven Anti-Thy-1-Glomerulonephritis der Ratte hauptsächlich über die endogene Produktion von NO vermittelt werden. Diese Daten lassen vermuten, dass NO in vivo die TGF-beta-Überexpression auf einem blutdruck-unabhängigen Weg limitiert und dass NO-Donoren sich günstig in der Behandlung von menschlichen fibrotischen Nierenerkrankungen auswirken könnten. / Background. L-arginine olays a complex role in renal matrix expansion, involving endogenous metabolism into nitric oxide (NO), polyamines, L-prolin and agmatine. Supplementing dietary L-arginine intake has been shown to limit transforming growth factor (TGF)-beta1 overproduction and matrix accumulation in rats with induced anti-thy1 glomerulonephritis (GN). The present study tests the hypothesis that this beneficial effect on in vivo TGF-beta overproduction is mediated via the generation of NO. Methods. One day after inducion of anti-thy1 GN, male wistar rats fed a normal protein diet were assigned to the following groups: (1) normal controls; (2) GN; (3) GN-Arg [plus 500 mg L-arginine/day]; (4) GN-Arg-NAME [plus 500 mg L-arginine/day and 75 mg/day of the NO synthase inhibitor nitro-L-arginine-methyl ester (L-NAME) in the drinking water] and (5) GN-Molsi [plus 10 mg/day of the NO donor molsidomine]. In protocol 1, treatment lasted until day 7 and in protocol 2 until day 12 after disease induction, respectively. Analysis included systolic blood pressure, proteinuria, a glomerular histologic matrix score and the glomerular mRNA and protein expression of the key fibrogen TGF-beta1, the matrix protein fibronectin and the protease inhibitor plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1). Results. Blood pressure was normal in untreated anti-thy1 animals and not significantly affected by any of the treatments. Compared to nephritic rats, administration of both L-arginine and molsidomine reduced glomerular TGF-beta1 overexpression significantly and to a similar degree in both protocols, while the beneficial effect of L-arginine was abolished by concomitant NO synthesis inhibition. Glomerular matrix accumulation, fibronectin and PAI-1 mRNA and protein expression cloxely followed the expression of TGF-beta1. Proteinuria was not significantly affected by any treatment. Conclusion. The present study shows that L-arginine´s antifibrotic action in normothensive anti-thy1 GN is mainly mediated by endogenous production of NO. The data suggest that NO limits in vivo TGF-beta overexpression in a pressur-independent manner and that NO donors may be of benefit in the treatment of human fibrotic renal disease.

Wachstumsfaktoren sind wichtige Steuerelemente des Knochenzellmetabolismus. Im Verlauf der Frakturheilung kommt es zur Ausschüttung von zahlreichen Wachstumsfaktoren, Zytokinen und Botenstoffen im und um den Bereich des Frakturspalts, die systemisch oder lokal, endokrin, parakrin oder autokrin wirksam werden können. Für verschiedene Wachstumsfaktoren konnten in zahlreichen Studien osteoinduktive und die Frakturheilung positiv beeinflussende Wirkungen nachgewiesen werden. In vitro und in vivo Studien belegen, dass einige dieser Faktoren wie Insulin-like growth factor-I (IGF-I), Transforming growth factor-beta1 (TGF-beta1) und Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) einen stimulierenden Effekt auf osteo- und chondrogene Zellen aufweisen und somit die Knochenheilung stimulieren. Der genaue Wirkmechanismus dieses positiven Effektes der Wachstumsfaktoren und ihre Interaktion im Verlauf der Frakturheilung ist nicht bekannt. Die lokale Applikation der Faktoren für einen therapeutischen Einsatz bei der Frakturheilung stellte bisher jedoch ein Problem dar. Mit der entwickelten biodegradierbaren Poly(D,L-Laktid)-Beschichtung von Implantaten können eingearbeitete Wachstumsfaktoren kontrolliert und lokal direkt an der Fraktur freigesetzt werden. Das beschichtete Implantat dient dabei der Stabilisation der Fraktur und gleichzeitig als Wirkstoffträger. Die Beschichtung weist eine hohe mechanische Stabilität auf. Die eingearbeiteten Wachstumsfaktoren behalten ihre biologische Aktivität in der Beschichtung und werden kontrolliert lokal freigesetzt. Um den Effekt lokal applizierter Wachstumsfaktoren auf die Frakturheilung zu untersuchen, wurde ein standardisiertes geschlossenes Frakturmodell entwickelt, das der klinischen Situation möglichst nahe ist und reproduzierbar durchgeführt werden kann. Untersucht wurde der Effekt der Wachstumsfaktoren IGF-I, TGF-beta1 und BMP-2 und des Trägermaterials PDLLA sowie lokale und systemische unerwünschte Wirkungen. Die Ergebnisse zeigten einen signifikant grösseren stimulierenden Effekt von IGF-I auf die Frakturheilung im Vergleich zur TGF-beta1 Applikation. Die kombinierte Gabe beider Faktoren ergab einen signifikant grösseren Effekt auf die torsionale Stabilität und die Kallusreifung im Vergleich zur Einzelapplikation. Beide Faktoren scheinen einen synergistischen Effekt auf die Frakturheilung zu haben. Die lokale Applikation von BMP-2 beschleunigte ebenso, wie die lokale Freisetzung von IGF-I und TGF-beta1 die Frakturheilung signifikant. Deutliche Unterschiede zwischen IGF-I / TGF-beta1 und BMP-2 konnten nicht festgestellt werden.Allerdings zeigte sich bei der Verwendung von BMP-2 auch ausserhalb der Frakturzone eine grössere Mineralisation der Kortikalis, die bei IGF-I / TGF-beta1 nicht zu beobachten ist. Auch im Grosstiermodell bestätigte sich die Wirksamkeit dieser bioaktiven Oberflächen-beschichtung auf die Osteotomieheilung. Die PDLLA-Beschichtung alleine, ohne eingearbeitete Wachstumsfaktoren, zeigte bereits einen positiven Effekt auf die Frakturheilung. Die Untersuchungen belegen, dass die lokale Freisetzung von Wachstumsfaktoren aus einer biodegradierbaren PDLLA-Beschichtung von Implantaten die Frakturheilung signifikant beschleunigt, wobei keine unerwünschten lokalen oder systemischen Wirkungen beobachtet werden konnten. Bei dem Vergleich lokaler (durch Wachstumsfaktoren) mit systemischer Stimulationsmöglichkeit (durch Wachstumshormon) der Frakturheilung lässt sich zusammenfassend feststellen, dass die kombinierte Anwendung beider Stimulationsmöglichkeiten zu keiner weiteren Steigerung der Heilungsvorgänge führte. Weitere Untersuchungen wurden hinsichtlich der genauen Rolle und Interaktion der Wachstumsfaktoren durchgeführt. Vor allem die Frühphase scheint hierbei eine entscheidende Rolle bei der Frakturheilung einzunehmen. Es zeigte sich hierbei eine deutliche Stimulation der Osteoblastendifferenzierung mit einer Erhöhung der Kollagen-1 Produktion in vitro sowie eine Steigerung der Proliferationsrate und Angiogenese mit einem schnelleren Ablauf der Phasen der Frakturheilung in vivo durch lokal appliziertes IGF-I und TGF-beta1. Weitere Anwendungen der entwickelten Beschichtungstechnologie stellen die lokale Applikation von Wachstumsfaktoren von beschichteten PDLLA-Cages bei der intervertebralen Spondylodese sowie die lokale Applikation von Antibiotika aus einer PDLLA-Beschichtung von Implantaten zur Prophylaxe der Implantat-assoziierten Osteomyelitis dar.Basierend auf diesen Ergebnissen steht der Einsatz PDLLA-Gentamicin beschichteter intramedullärer Tibianägel kurz vor der klinischen Anwendung.Eine Zulassung durch die entsprechenden Behörden ist erfolgt.Die klinische Anwendung Wachstumsfaktoren-beschichteter Implantate ist bereits in der Vorbereitung. / Growth factors are important regulators of bone metabolism. During fracture healing many growth factors or cytokines were locally released at the facture site. In several studies, different growth factors demonstrated osteoinductive and fracture stimulating properties. In vitro and in vivo studies showed a stimulating effect of Insulin-like growth factor-I (IGF-I), Transforming growth factor-beta1 (TGF-beta1) and Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) on osteo- and chondrogenetic cells. The exact effectiveness and the interaction of these growth factors during fracture healing is not known so far. Further, the local application of these factors for therapeutically use in fracture treatment is still a problem. The developed biodegradable poly(D,L-lactide)-coating of implants allows the local and controlled release of incorporated growth factors directly at the fracture site. The coated implant serves on the one hand for fracture stabilization and on the other hand as a drug delivery system. The coating has a high mechanical stability. The incorporated growths factors remain biologically active in the coating and were released in a sustained and controlled manner. To investigate the effect of locally released growth factors IGF-I, TGF-beta1 and BMP-2 and the carrier PDLLA on fracture healing, standardised closed fracture models were developed with a close relationship to clinical situation. Further, possible local and systemic side effects were analysed. The results demonstrated a significantly higher stimulating effect of IGF-I on fracture healing compared to TGF-beta1. The combined application of both growth factors showed a synergistic effect on the mechanical stability and callus remodeling compared to single treatment. The local release of BMP-2 also enhanced fracture healing significantly - comparable to combination of IGF-I and TGF-beta1. However, a higher rate of mineralisation was measurable outside the fracture region using BMP-2 in a rat fracture model. Using a large animal model on pigs with a 1 mm osteotomy gap, the effectiveness of locally released growths factors could be confirmed. Further, the PDLLA-coating without any incorporated growth factors demonstrated a significantly effect on healing processes in both models. These investigations showed, that the local release of growth factors from PDLLA coated implants significantly stimulate fracture healing without any local or systemic side effects. Comparing systemic with local stimulation techniques, we found an improvement of fracture healing by systemic administration of growth hormone and local application of IGF-I and TGF-beta1. However, the combined use of both simulation techniques did not lead to a further increase of healing processes. Investigations on the effectiveness and the interaction of growth factors during fracture healing demonstrated an dramatic effect in the early phases of healing processes. The growth factors stimulate the differentiation of osteoblasts with a higher production of collagen I in vitro and increase osteogenesis and vascularisation of the fracture callus in vivo. Further applications of the coating technology are the use of PDLLA and growth factor coated cages for the stimulation of intervertebral fusion and the use of PDLLA and Gentamicin coated implants in order to prevent implant associated infections. The clinical use of antibiotic and growth factor coated implants are in preparation.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le microenvironnement tumoral et les cellules et molécules signal (cytokines et chimiokines) qu’ils contiennent sont reconnus comme jouant un rôle prépondérant dans la progression des tumeurs. Il devient donc nécessaire d’étudier la relation entre les molécules signal, les cellules infiltrantes et les cellules tumorales. Le TGF-β est une puissante cytokine immunosuppressive et suppressive de la croissance cellulaire, dont le rôle dans la formation du microenvironnement tumoral leucémique est mal connu. Dans cette étude, nous avons étudié le modèle injectable de leucémie lymphoïde T EL4 (cellules tumorales produisant du TGF-β) de souche C57BL/6. Nous avons caractérisé l’infiltration de cellules myéloïdes et lymphoïdes au niveau des tumeurs par cytométrie en flux et par microscopie à fluorescence. L’analyse des cellules infiltrant les tumeurs EL4 nous a permis de montrer la forte présence de lymphocytes T et de cellules myéloïdes CD11b+. Nous avons donc poursuivi l’étude afin de mieux caractériser ces cellules. Nous avons montré que ces cellules se retrouvent en périphérie de la tumeur et en périphérie des vaisseaux sanguins de la tumeur. Ces cellules ont des phénotypes nous laissant croire qu’elles appartiennent à la famille des cellules dite myéloïdes suppressives. Ces cellules ont de forts niveaux de transcrits de VEGF et de MMP9 au niveau de la tumeur ainsi qu’au niveau systémique, mais ne semblent pas avoir une forte capacité inhibitrice in vitro. Afin de déterminer si la production tumorale de TGF-β influe le recrutement de ces cellules, nous avons transformé des cellules EL4 à l’aide d’un shRNA afin de diminuer la production de TGF-β (shRNA-TGF-β) et, comparé l’infiltration myéloïde et lymphoïde de tumeurs formées avec des cellules EL4 contrôles (shRNA-Luc). Une diminution de 50% dans les niveaux de transcrits de TGF-β n’affecte pas la croissance tumorale mais semble diminuer l’infiltration par des cellules myéloïdes. La présente étude nous a permis de mieux comprendre le modèle de leucémie EL4 et le rôle des populations cellulaires myéloïdes dans le microenvironnement tumoral leucémique. La diminution du TGF-β produit par les cellules tumorales réduit l’infiltration de ces populations myéloïdes dans la tumeur EL4. Le rôle précis de ces cellules est encore à déterminer. Ces résultats sont en accord avec le fait qu’une thérapie anti-TGF-β n’est pas suffisante pour contrer la progression tumorale, mais pourrait influer sur le résultat post-chimiothérapie et l’immunothérapie en altérant la composition du microenvironnement. / The cells and signal molecules (cytokines and chemokines) making up the tumoral microenvironnement are known to play an essential role in tumor progression. It seems to be necessary to study the relationship between infiltrating cells, tumor cells and signal molecules. TGF-β is a potent immunosuppressive and growth suppressive cytokine whose role in the formation of the leukemia microenvironnement remains unclear. In this study, we investigated the injectable T lymphocyte leukemia EL4 model (tumor cells producing TGF-β) of C57BL/6 strain. We characterised the myeloid and lymphoid infiltration in EL4 tumors using flow cytometry and fluorescence microscopy. Our analysis of EL4 tumor infiltrating cells showed a high concentration of T lymphocytes and myeloid cells CD11b+. We have undertaken our study to better characterize these cells. We showed that these cells are present at the periphery of the tumor and are surrounding blood vessels in the tumor. These cells have phenotypes leading us to believe that they belong to the family of so-called myeloid suppressor cells. They have high levels of transcripts of VEGF and MMP9 in the tumor and the systemic level, but do not seem to have a strong inhibitory capacity in vitro. To determine whether the tumor production of TGF-β affects the recruitment of these cells, we transformed EL4 cells using a shRNA to reduce the production of TGF-β (TGF-β shRNA ) and compared the myeloid and lymphoid infiltration of tumors formed with EL4 cell controls ( shRNA-Luc ) . A 50% decrease in transcript levels of TGF-β does not affect tumor growth but appears to decrease infiltration by myeloid cells. This study allowed us to better understand the pattern of EL4 leukemia and the role of myeloid leukemia cell populations in the tumor microenvironment. The decrease of TGF-β produced by tumor cells reduces the infiltration of these myeloid populations within the EL4 tumor. The precise role of these cells still needs to be determined. These results are in agreement with the fact that anti-TGF-β therapy is not sufficient to counteract tumor progression, but may affect the post-chemotherapy and immunotherapy results by altering the composition of the microenvironment.

Clic proteins influence ethanol-related behavior in flies and other species and also mediate TGF-β signaling. These findings suggest that Clics and the TGF-β signaling pathway might work together to modulate behavioral responses to ethanol. I used the Drosophila model to address the hypothesis that TGF-β signaling is important for ethanol sensitivity. Ethanol sensitivity was blunted by multiple transposon insertions in the TGF-β receptor gene thickveins. Collectively, however, I found no consistent correlation between expression of thickveins and altered ethanol sensitivity in flies harboring transposons. I therefore also assessed ethanol sensitivity in flies with loss of function point mutations in thickveins. Ethanol sensitivity was not altered in these additional thickveins genotypes, contrary to my major hypothesis. My analysis of thickveins suggests that TGF-β signaling might influence ethanol sensitivity, but if so there must be a complex relationship between the function of this pathway and sensitivity to alcohol.

Au sein des tumeurs, y compris pour le carcinome hépatocellulaire (CHC), des sous-populations de cellules néoplasiques ont révélé une grande capacité à initier de nouvelles tumeurs et à induire des métastases. Les premières études sur ces cellules ont rapidement montré que la présence de ces cellules était déterminante dans le développement tumoral et elles ont donc été renommées « cellules souches cancéreuses » (CSCs). Malheureusement les mécanismes impliqués dans la maintenance de ces CSCs ne sont que partiellement compris. Par ailleurs dans le CHC un lien a été établi entre les signaux du facteur de croissance de transformation (Transforming Growth Factor, TGF-ß) provenant du microenvironnement tumoral et certaines populations de cellules cancéreuses dont la présence est corrélée à un faible pronostic. La façon dont TGF-ß peut ainsi établir et modifier un phénotype cellulaire dans le CHC reste néanmoins obscure. La méthylation de l’ADN étant un acteur majeur dans la mise en place des programmes cellulaires, notre but a été de caractériser le méthylome de CSCs hépatiques et son lien avec la capacité de TGF-ß à induire des CSCs. Nous nous sommes appuyés sur l’expression du marqueur CD133 pour définir la population de CSCs hépatiques. Afin comprendre l’importance des marques de méthylation de l’ADN dans les CSCs hépatiques, nous avons dans un premier temps déterminé quelle était la signature des cellules CD133+ au niveau de la méthylation de l’ADN en utilisant des puces de méthylation à grande échelle. Les sites CpG différentiellement méthylés ont montré un enrichissement pour d’une part des voies de signalisation déjà identifiées dans les CSCs et, d’autre part, pour des voies de signalisation associées au processus inflammatoire dont la voie TGF-ß/SMAD. Par la suite, nous avons montré que TGF-ß pouvait induire de façon permanente les cellules CD133+ contrairement à une autre cytokine influente dans le cancer du foie, l’interleukine 6. Cette augmentation de cellules CD133+ induite par TGF-ß est associée à des changements de méthylation de l’ADN sur l’ensemble du génome et qui sont, de plus, maintenus au cours des divisions cellulaires. La comparaison entre les deux méthylomes (liés aux cellules CD133+ et à l’action de TGF-ß) a exposé une signature commune significative indiquant que TGF-ß pourrait promouvoir le phénotype de CSC via le processus de méthylation de l’ADN. Mais nous avons également déterminé qu’une grande partie des effets sur la méthylation induits par TGF-ß était totalement indépendante de l’induction de cellules CD133+. Enfin, nous avons observé que les sites de méthylation sensibles au signal de TGF-ß étaient regroupés de façon significative au niveau de régions « enhancer » qui régulent la transcription des gènes. Par ailleurs, ces sites incluaient également des gènes précédemment identifiés comme cibles de TGF-ß mais aussi des gènes codant pour des acteurs épigénétiques de premier ordre comme les méthyltransférases de l’ADN. Ces résultats constituent la première description d’une signature de méthylation de l’ADN induite par TGF-ß permettant une reprogrammation stable vers un profil épigénétique de CSC hépatiques. / Distinct subpopulations of neoplastic cells within tumors, including hepatocellular carcinoma (HCC), display a pronounced ability to initiate new tumors and induce metastasis. Investigations on theses cells rapidly described them as essential for tumor growth and based on theses observations they have been named “cancer stem cells” (CSCs). Unfortunately, the mechanisms involved in sustaining their programs are only partially known. In HCC, there is an established link between microenvironmental signals from Transforming Growth Factor beta (TGF-ß) and survival of certain cell subpopulations which is results in a bad prognosis. However, how TGF-ß establishes and modifies cell behavior in HCC is not fully understood. As DNA methylation is involved in establishing cellular programs, our aim was to characterize the methylome of putative liver CSCs, and its link to the ability of TGF-ß to induce liver CSCs. We used CD133 expression as a positive marker for liver CSC. To understand the relevance of DNA methylation programs in liver CSCs, we first defined the methylome signature of CD133+ cells in liver cancer cells using methylation bead arrays. Differentially methylated CpG sites were enriched in known pathways related to CSC survival and to inflammation, including the TGF-ß/SMAD pathway. Next, we showed that TGF-ß persistently induces CD133+ cells in opposition to another cytokine related to HCC, interleukin 6. We observed that this increase is associated with genome-wide changes in the methylome induced by TGF-ß and that are perpetuated through cell division. We observed a significant overlap between the CD133+ methylome and the methylome induced by TGF-β, indicating that TGF-ß may induce CSC phenotype through DNA methylation reprogramming. Additionally, we observed genome-wide effects of TGF-ß that are independent of the induction of CD133. Finally, TGF-ß methyl-sensitive sites were significantly concentrated in enhancer regions of the genome, and include well-known targets of TGF-ß, and epigenetic players, such as de novo DNA methyl-transferases. In conclusion our results are the first indication of the ability of TGF-ß to induce genome-wide changes of DNA methylation, leading to a stable switch to a liver cancer stem cell epigenetic program.