Neste estudo, foram descritos os aspectos clínicos e resultados visuais em indivíduos com evidência sorológica e sinais clínicos de toxoplasmose ocular. Os sujeitos foram examinados com lâmpada de fenda, exame de oftalmoscopia indireta, tendo registros fotográficos com retinografia e tomografia de coerência óptica. Duzentos e sessenta e sete participantes foram incluídos no estudo (n = 350 olhos). A forma de toxoplasmose ocular foi considerada primária em 52 indivíduos (19,5%), recorrente ativa em 89 (33,3%) e inativa em 126 (47,2%). A maioria dos olhos apresentou uma lesão (n=169; 48,3%), enquanto que 149 olhos (42,6%) apresentaram duas a quatro lesões e 32, cinco ou mais lesões (9,1%). As lesões centrais estiveram presentes em 127 olhos (36,3%), periféricas em 178 (50,9%), enquanto que lesões centrais e periféricas em 45 (12,6%). A maioria dos indivíduos apresentou sorologia para toxoplasma gondii (T. gondii) IgG + IgM- (n=245; 91,8%), enquanto que apenas 22 (8,2%) foram T. gondii IgG + IgM +. Do total de olhos afetados em que a acuidade visual foi medida (n=314), a maioria (n=160; 50,9%) apresentou melhor acuidade visual corrigida final >20/40, e 25,8% (n=81) foram considerados cegos (<20/400). Lesões múltiplas, de localização central e com tamanho maior que um diâmetro de disco óptico foram consideradas fator de risco para pior prognóstico visual. A membrana epirretiniana (n=21; 7,1%) e opacidade vítrea (n=20; 6,8%) foram as principais causas de complicações observadas. A taxa de incidência de complicações foi de 0,41 complicações/ano, e foram verificadas 0,13 reativações/ano. O estudo demonstrou altas taxas de déficit visual, devendo ser realizados novos estudos para o desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas para diminuir o impacto da doença como causa de cegueira e deficiência visual. / In this study, we describe the clinical aspects clinical aspects and visual outcomes in individuals with serological evidence and clinical signs of ocular toxoplasmosis. The subjects were examined with a slit lamp, indirect ophthalmoscopy examination, having photographic records with retinography and optical coherence tomography. Two hundred and sixty -seven subjects were included in the study (n=350 eyes). The form of ocular toxoplasmosis was considered primary active in 52 subjects (19.5%), recurrent active in 89 subjects (33.3%) and inactive in 126 (47.2%). Most eyes presented only one lesion (n=169; 48.3%), whereas 149 individuals (42,6%) had 2-4 lesions, and 32 had five or more lesions (9.1%). Central lesions only were present in 127 eyes (36,3%), peripheral in 178 (50,9%%), while concomitant central and peripheral were present in 45 (12.6%). Most subjects had T. gondii IgG+ IgMserology (n=245; 91.8%), whereas only 22 (8,2%) were T. gondii IgG+ IgM+. From the total of affected eyes which visual acuity was measured (n=314), most (n=160; 50,9%) had better final corrected visual acuity> 20/40 and 25.8% (n = 81) were considered blind (<20/400). Multiple, centrally located lesions of greater size than an optic disc diameter were considered risk factor for a worse visual prognosis. The epiretinal membrane (n=21; 7.1%) and vitreous opacity (n=20; 6.8%) were the main causes of complications seen. The incidence rate of complications was 0,41 complications/year, and it was verified 0,13 reactivations/year. The study demonstrated a high rate of visual impairment, and studies for the development of novel therapeutic modalities should be performed to reduce the impact of the disease as a cause of blindness and visual impairment.

Toxoplasma gondii vs radiação ionizante: Imunidade humoral e celular em baço e intestino de camundongos isogênicos imunizados com taquizoítos irradiados por Cobalto 60 Andrés Jimenez Galisteo Jr. Estudamos o desenvolvimento de uma vacina para toxoplasmose utilizando a radiação ionizante como ferramenta. Aqui avaliamos o desenvolvimento da imunidade sistêmica e intestinal e a resistência à infecção, em diferentes camundongos imunizados, por via oral e parenteral, com taquizoítos irradiados a 255 Gy e desafiados com cistos da cepa ME49. Camundongos C57Bl/6j, BALB/c e C57Bl/6j IFN--/- foram imunizados com 107 taquizoitos de T. gondii irradiados a 255Gy por diferentes vias. As preparações de taquizoítos irradiados, por via oral e parenteral, induziram produção de imunoglobulinas IgG e IgA no soro de camundongos, sendo predominante a subclasse de IgG2b, determinadas por ELISA. A produção de IgM foi mínima. Os animais imunizados pela via parenteral, apresentaram uma maturação mais rápida da avidez de anticorpos IgG que os animais imunizados por via oral. Houve excreção de IgG, IgA e IgM nas fezes dos animais imunizados, mais intensa nos animais imunizados por via oral. No estudo da imunidade celular induzida por antígeno e detectada for real-time PCR, houve uma grande produção de IFN- por células esplênicas, menor por células das placas de Peyer intestinais, onde houve maior produção de IL-2. Houve proteção em todos os nossos esquemas avaliados, maior nos animais BALB/c. Os animais deficientes de IFN-, não foram afetados pelo processo de imunização e apresentaram produção de IgG e IgA sérico e excreção de S-IgA e S-IgM nas fezes, com menor numero de cistos cerebrais em animais imunizados por via parenteral. Todos nossos dados apontam para a possibilidade do desenvolvimento de uma vacina oral para toxoplasmose, utilizando taquizoítos irradiados, com aplicação prática na imunização de felinos domésticos e selvagens. / We are developing a vaccine for toxoplasmosis, using ionizing radiation as a tool. Here we analyzed the production of sytemic and intestinal immunity, with protection studies, in several strains of inbred mice, by oral or parenteral route, using 255 Gy irradiated tachyzoites of T. gondii RH strain, with challenge with cysts of ME- 49 strain. C57Bl/6j, BALB/c and C57Bl/6j IFN--/- mice were immunized with 107 irradiated tachyzoites, be parenteral or oral route. Those preparations, both by parenteral or oral routes, induced the production of specific IgG, mainly of the IgG2b subclass, and IgA immunoglobulins in serum, , as determined by ELISA. IgM production was negligible. Parenteral immunized mice showed higher IgG avidity maturation, as compared to oral immunized mice. Fecal excretion of IgG, IgA and IgM was detected in stools of immunized animals, more intense in oral immunized mice. In cellular immunity studies, induced by antigen, with detection of cytokine production by quantitative real-time PCR, there are a great production of IFN- by spleen cells, with lower levels in Peyer patches cells, where there are a greater IL-2 production. Challenge studies in immunized mice demonstrated protection to infection in all used schedules, greater in BALB/c mice. C57Bl/6j IFN--/- mice, when immunized, showed no signs of disease and produced similar or greater levels of antibodies than wild type mice. They also excreted S-IgA and S-IgM in stools, but with low numbers of brain cysts in parenteral immunized mice, despite similar mortality. Our data points to a fair possibility of use of those irradiated parasites as an oral vaccine, devised to use for veterinary or wild felines vaccination, reducing the production of oocysts by those hosts and interrupting the chain transmission of human toxoplasmosis.

Plasmodium falciparum e Toxoplasma gondii são protozoários parasitas pertencentes ao filo Apicomplexa. Apirases são enzimas metabolizadoras de nucleotídeos extracelulares. Nesta tese mostramos pela primeira vez a presença de um membro desta família de enzimas em P. falciparum, o qual foi capaz de degradar ATP extracelular. Análises por RT-qPCR revelaram a expressão da apirase durante todo o ciclo intraeritrocítico. A adição de inibidores desta classe de enzimas foi capaz de prejudicar o desenvolvimento dos parasitas e a invasão de novas hemácias pelos merozoitos, sugerindo assim um papel da apirase nestes processos. A via de sinalização por Ca2+ é universal e vital para todas as células. Para melhor entender a fisiologia celular de P. falciparum construímos uma nova linhagem de parasitas transgênicos, PfGCaMP3, que nos tornam capazes de monitorar a dinâmica de Ca2+ sem o uso de protocolos invasivos de marcação. De modo semelhante utilizamos uma nova linhagem de T. gondii expressando de forma estável o indicador de Ca2+ GCaMP3 para estudar o papel deste íon na saída da célula. T. gondii possui o Ca2+ necessário para promover este processo, entretanto Ca2+ extracelular age como um fator intensificador neste passo essencial do ciclo lítico. / Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii are protozoan parasites that belong to phylum Apicomplexa. Apirases are metabolizing enzymes of extracellular nucleotides. In this work we show for the first time the presence of an apyrase in P. falciparum, which was able to degrade extracellular ATP. RTqPCR analysis revealed the expression of apyrase throughout the intraerythrocytic cycle. Addition of apyrase inhibitors was able to impair the development of the parasites and the invasion of new erythrocytes by merozoites, thus suggesting a role of apyrase in these processes. Calcium signaling is universal and vital to all cells. To better understand the cellular physiology of P. falciparum we construct a new strain of transgenic parasites, PfGCaMP3, which enable us to monitor the Ca2+ dynamics without using invasive protocols. Similarly we use a new strain of T. gondii that stably express the Ca2+ indicator GCaMP3 to study the role Ca2+ in parasite egress. T. gondii has the Ca2+ required to promote this process, however extracellular Ca2+ acts as an enhancer factor in this crucial step of the lytic cycle.

Introdução: A água tem sido considerada um importante veículo para a disseminação de surtos de toxoplasmose em vários países. Os oocistos de Toxoplasma gondii podem persistir no ambiente durante longos períodos, sendo altamente resistentes aos vários processos químicos de inativação, inclusive aos processos comuns de desinfecção utilizados pelos sistemas produtores de água. Pouco se tem registrado no país sobre a real extensão da contaminação dos recursos hídricos por Toxoplasma gondii, sendo que a sua detecção em amostras de águas é muito importante na implantação de ações preventivas. As metodologias existentes no momento para identificação e quantificação deste parasita nestes tipos de amostras não estão universalmente padronizadas e apresentam limitações. Objetivo: O presente estudo teve como objetivo verificar a possível presença do protozoário em águas superficiais de abastecimento público no Estado de São Paulo mediante a implantação de uma metodologia específica para a quantificação de oocistos de Toxoplasma gondii por reação quantitativa de PCR em tempo real nessas amostras. Método: Um total de 39 amostras de águas superficiais provenientes de 10 mananciais do Estado de São Paulo foram analisadas durante o período de maio a dezembro de 2015. Volumes de 20L da amostra foram concentrados por meio de filtração em cápsulas Envirocheck® HV (Pall Gelman Laboratory), sendo a cápsula filtrante tratada com uma solução dispersante, eluída e o eluato concentrado por centrifugação. O sedimento obtido após a centrifugação da amostra foi submetido à extração de DNA, sendo utilizado o kit de extração PowerSoil DNA isolation® (MO BIO Laboratories). A sequência alvo selecionada para detecção e quantificação de oocistos de Toxoplasma gondii através da reação quantitativa de PCR em tempo real foi um fragmento de 62 pares de bases do gene B1, sendo utilizado o seguinte conjunto de iniciadores: 5 CTAGTATCGTGCGGCAATGTG 3 (531-551) e 5GGCAGCGTCTCTTCCTCTTTT 3 (571-592). A sonda utilizada foi: 5 (6-FAM) CCACCTCGCCTCTTGG-(NFQ-MGB) 3. Resultados: Do total das amostras analisadas, 7,7 por cento (3/39) foram positivas para oocistos de Toxoplasma gondii e dentre os 10 mananciais estudados, detectou-se a ocorrência do protozoário em 30 por cento (3/10) dos mesmos. Conclusão: Os dados obtidos no presente estudo demonstram que o protozoário Toxoplasma gondii está circulando em águas superficiais de abastecimento público no Estado de São Paulo. / Introduction: Water is an important vehicle for the spread of toxoplasmosis outbreaks in several countries. Toxoplasma gondii oocysts may remain for a long period in the environment and are highly resistant to chemical inactivation, including the routine classical disinfection procedures in water treatment facilities. Few reports have been published in Brazil about the real extent of the contamination of water resources by Toxoplasma gondii, which is of major importance to implement preventive actions. Methods for the identification and quantification of the parasite in water bodies are not standardized and have limitations. Objective: This study aimed to verify the presence of these protozoa in surface waters used as source for drinking water production in the State of São Paulo by implementing a specific methodology to quantify Toxoplasma gondii oocysts with quantitative real-time PCR. Method: Thirty nine samples of surface waters from 10 different sites in the State of São Paulo were analized from May to December 2015. Volumes of 20L of each sample were concentrated by filtration with capsule Envirocheck® HV (Pall Gelman Laboratory).The filter capsule was treated with a dispersant solution, eluted, and the eluate concentrated by centrifugation. DNA was extracted from the resulting pellet with PowerSoil DNA isolation® (MO BIO Laboratories) extraction kit. A fragment of 62 base pairs of the B1 gene was selected as target sequence for detection and quantitation the Toxoplasma gondii oocysts by the quantitative real-time PCR reaction, and the following primers: 5\' TAGTATCGTGCGGCAATGTG 3\' (531-551) and 5\'GGCAGCGTCTCTTCCTCTTTT 3\' (571-592) were used. The probe employed was 5 \'(6-FAM) CCACCTCGCCTCTTGG- (NFQ-MGB) 3\'. Results: Toxoplasma gondii oocysts were detected in 30 per cent (3/10) of the sites evaluated and 7.7 per cent (3/39) of all samples analyzed were positive. Conclusion: The results of the present study show that the protozoan Toxoplasma gondii is circulating in surface waters used as drinking water supply in the State of São Paulo.

Foi realizada a pesquisa de anticorpos anti-Toxoplasma gondii, através do teste de aglutinação modificado (MAT), em 68 amostras de soros de capivaras de seis municípios no estado de São Paulo. Anticorpos (MAT?25) foram encontrados em 51 (75%) capivaras examinadas. Dentre estas realizou-se o bioensaio em camundongos, com tecidos do cérebro, coração e língua, de 40 capivaras, sendo obtidos 36 isolados (90%). Não houve associação entre o número de isolados e idade das capivaras (p=0,21), sexo (p=0,58) ou tipo de criação (p=0,62), isto é, criadouros e vida livre, bem como a freqüência de isolamentos e os títulos de anticorpos (p=0,99). A análise de polimorfismo de comprimento dos fragmentos de DNA gerados por enzimas de restrição (RFLP) sobre produtos do locus SAG2 amplificados pela reação em cadeia pela polimerase (PCR) revelou que 20 isolados (55,5%) pertenciam ao genótipo I, 14 (38,9%) ao genótipo III e dois (5,6%) que apresentaram genótipo misto (tipos I e III). Não foi encontrado isolado tipo II. A proporção de isolados tipo I entre as capivaras de vida livre foi maior (p=0,049) do que entre as capivaras provenientes de criadouros. Por outro lado, entre as capivaras de criadouros, a proporção de isolados tipo III foi maior (p=0,041). A maioria dos isolados tipo I (12/20) causou óbito em todos os camundongos infectados e, em nenhum grupo com este isolado, 100% dos camundongos sobreviveram. A maioria dos isolados tipo III (8/14) não matou nenhum camundongo infectado. A freqüência de óbitos em camundongos com genótipo I (86%) foi maior do que o tipo III (44,9%) (p<0,001), enquanto a sobrevida dos camundongos com genótipo III foi significativamente maior que a dos camundongos com genótipo I (p<0,001). Foram encontrados cistos nos cérebros dos camundongos infectados em todos os 36 isolados. A análise genotípica também foi realizada diretamente dos tecidos de 35 das 36 capivaras (homogeneizados de tecidos) das quais houve isolamento pelo bioensaio, usando nestedPCR-RFLP no locus SAG2. Foram caracterizadas 22 amostras (62,8%), 21 delas idênticas aos dos isolados correspondentes. Em uma amostra genótipo misto foi obtido dos tecidos primários e tipo I no isolado. Os genótipos mistos foram confirmados pelo seqüenciamento de DNA dos produtos da nestedPCR obtidos das amostras primárias das capivaras. / Antibodies to Toxoplasma gondii were assayed by the modified agglutination test (MAT) in serum samples of 68 capybaras from six counties in São Paulo state, Brazil. Antibodies (MAT?25) were found in 51 (75%) capybaras examined. Tissues (brain, heart and tongue) of 40 of the seropositive capybaras were bioassayed in mice and 36 (90%) isolates were obtained. There was no statistical association between number of isolates and age (p=0.21), gender (p=0.58) and type of rearing (p=0.62), as well as no association with frequency of isolations and antibody titer distribution (p=0.99). Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis in PCR-amplified SAG2 locus products revealed that 20 isolates (55.5%) were genotype I, 14 (38.9%) were genotype III and two (5.6%) were mixed genotypes (types I and III). Type II isolate was not found. The proportion of type I isolates in the group of wildlife capybaras was higher (p=0.049) than in the captive rearing group. On the other hand, the proportion of type III isolates was significantly higher in the captive rearing group (p=0.041). Most of the type I isolates (12/20) killed all infected mice and none of those groups had 100% of surviving mice. Most of the mice infected with genotype III isolate survived. The mortality rate in mice infected with genotype I (86%) was higher than the type III (44.9%) (p<0.001) and mice infected with type III isolates survived for longer periods than type I isolates (p<0.001). Tissue cysts were found in mice infected with all 36 isolates. Genotyping was also done directly from the tissue homogenates from the 35 of 36 capybaras using nested-PCR-RFLP analysis on the SAG2 locus. Twenty?two samples (62.8%) were characterized and in 21 the genotypes found were the same as those from the corresponding isolates. In one sample, mixed genotype was detected directly from the primary sample and type I from the mice isolate. The mixed genotype was confirmed by direct DNA sequencing of the nestedPCR products from the capybaras primary samples.

Com o objetivo de identificar Toxoplasma gondii e Neospora caninum em roedores urbanos da Grande São Paulo (SP) 217 roedores (quatro camundongos -Mus musculus, 20 ratazanas - Rattus norvegicus e 193 ratos de telhado - Rattus rattus) foram capturados entre abril de 2005 e fevereiro de 2008, para realização do diagnóstico biológico e molecular. Das 20 ratazanas (Rattus norvegicus) capturadas apenas uma foi positiva para T. gondii pelo bioensaio, correspondendo a 5% de positividade entre as ratazanas e 0,46% entre todos os roedores capturados. O isolado obtido dessa ratazana foi caracterizado como genótipo recombinante I, III e u-1 por PCR-RFLP, similar ao isolado previamente descrito e obtido de duas ovelhas e um gato, todos do Estado de São Paulo. Quatro amostras de roedores negativos ao bioensaio resultaram como positivas ao T. gondii pela nested PCR B1. Entretanto, quando submetidas à nested PCR ITS1 e à restrição enzimática (RFLP) não houve confirmação desse resultado em três delas. Em relação ao N. caninum, amostras de tecido cerebral e cardíaco de 121 roedores foram examinadas por nested PCR Nc5, tendo sido encontradas 12 amostras positivas, provenientes de 10 roedores. Quando submetidas à nested PCR ITS1 e à restrição enzimática (RFLP) N. caninum não foi confirmado em nenhuma das amostras. Este estudo conclui que a ocorrência de T. gondii e N. caninum em roedores urbanos da Grande São Paulo (SP) é baixa, sugerindo que estes animais não possuem papel importante na cadeia epidemiológica como reservatórios desses agentes para predadores como os cães e gatos urbanos. / In order to identify Toxoplasma gondii and Neospora caninum in urban rodents from the Great São Paulo (SP) 217 rodents (four Mus musculus, 20 Rattus norvegicus and 193 Rattus rattus) were captured between April 2005 and February 2008 to biological and molecular diagnosis. One out of the 20 Rattus norvegicus was considered positive by bioassay in mice, corresponding to a 5% positivity among Rattus norvegicus and a 0.46% positivity considering all captured rodents. The isolate from this rat was characterized as a recombinant I, III and u-1 genotype by RFLP-PCR. This characterization had been previously described from isolates obtained from two sheep and one cat also from São Paulo state. Four samples from rodents with negative results by bioassay were positive to T. gondii by nested PCR B1. However, when tested with nested PCR ITS1 and RFLP these results were not confirmed in three of these samples. Regarding N. caninum, brain and heart samples of 121 rodents were examined by nested PCR Nc5 and 12 samples from 10 rodents were positive. When tested with nested PCR ITS1 and RFLP all of these samples turned out to be negative. This study concludes that T. gondii and N. caninum have low occurrence in urban rodents in the Great São Paulo area, and they are not important as T. gondii and/or N. caninum reservoirs to predators like urban cats and dogs.

O objetivo deste estudo foi o isolamento de Toxoplasma gondii de ovinos e caprinos e posterior caracterização genotípica desses isolados. Amostras de soros ovinos (495) de 36 Municípios do Estado de São Paulo e de caprinos (143) de seis Municípios dos Estados da Bahia (10), Paraíba (12), Rio Grande do Norte (7) e São Paulo (114) foram testadas, através do Teste de Aglutinação Modificado (MAT&ge;25) à presença de anticorpos anti-T. gondii. Dos animais amostrados, 24,2% e 32,2% dos ovinos e caprinos respectivamente, apresentaram-se positivos com títulos que variaram de 25 a 3200 em ambas espécies. Dentre os ovinos houve associação (p<0,001) entre sexo, idade e sistema de produção com a presença de anticorpos anti-T. gondii. Os caprinos apresentaram associação entre idade, sistema de produção, e raça com a soropositividade. Para o isolamento do agente o bioensaio em camundongos foi realizado utilizando-se pool de tecidos de ovinos (cérebro, coração e diafragma) e caprinos soropositivos (cérebro, coração e diafragma e masseter). Dos 82 bioensaios realizados com amostras de ovinos, 16 isolados (19,5%) foram obtidos. Houve associação entre o título de anticorpos anti-T. gondii e o isolamento do agente (p<0,001) com maior quantidade de isolados obtidos de animais com títulos mais altos. Para a caracterização genotípica das amostras utilizou-se a análise de polimorfismo de comportamento dos fragmentos de DNA gerados por enzimas de restrição (RFLP) sobre produtos do locus SAG2 amplificados pela PCR, que as identifica em genótipos I, II e III. Amostras do tipo I (87,5% dos ovinos e 100 % dos caprinos) e do tipo III (12,5% dos isolados de ovinos) foram obtidas e não houve o encontro de isolados tipo II ou mistas. Nos tecidos dos animais com títulos de anticorpos superiores a 400, e dos quais não se obteve o isolamento do agente pelo bioensaio (21 amostras de ovinos), foi realizada a nested-PCR das amostras primárias (homogeneizado de tecidos), não sendo obtida nenhuma amplificação. Amostras do tipo III não causaram óbitos nos camundongos e as tipo I causaram óbitos em 51,0% e 83,4% dos isolados de ovinos e caprinos, respectivamente. Houve associação entre a sobrevida dos camundongos infectados com o genótipo I de caprinos e ovinos (p<0,001). / The aim of this study was to analyze the SAG2 locus of Toxoplasma gondii isolated from sheep and goats in order to determine the frequency of occurrence of the three different lineages (types I, II and III). Serum samples of sheep (495) from 36 counties in São Paulo State and goat (143) from six counties in States of Bahia (10), Paraíba (12), Rio Grande do Norte (7) and São Paulo (114) were analyzed by the modified agglutination test (MAT&ge;25) for the detection of antibodies anti-T. gondii. Occurrence of antibodies anti-T. gondii was 24.2% and 32.2% in sheep and goats, respectively. The titers varied from 25 to 3200 in both species. Among sheeps, association of seropositivity (p<0,001) with sex, age, production system and presence of antibodies anti-T. gondii was observed. Association was also observed between the frequency of seropositive goats and age, production system and breed. For T. gondii isolation, pool of tissues of each seropositive sheep (brain, heart and diaphragm) and goat (brain, heart, diaphragm and masseter) were bioassayed in mice. From a total of 82 bioassay performed with sheep samples, 16 isolates (19.5%) were obtained. Association between antibodies anti-T. gondii titers and isolation was observed (p<0.001). Considering the goats, 12 isolates (42.6%) were obtained from 26 bioassays. For the genotypic characterization (genotype I, II and III), the restriction fragment length polymorphism (RFLP) was performed on fragments of the locus SAG2 amplified by PCR. Samples of type I (87.5% from sheep and 100% from goats) and type III (12.5% from sheep) was observed. Neither type II nor mixed samples were observed. In tissues samples from animals with antibodies titers above 400 in which T. gondii was not isolated (21 sheep sample), nested-PCR was performed and no amplification was observed. Mortality was not observed in the mice infected by the isolates type III. The isolates of type I from sheep and goats, respectively, killed 51.0% and 83.4% of the infected mouse. Association was also observed between mortality rate in infected mice and genotype I of sheep and goat (p<0.001).

A toxoplasmose, protozoose disseminada de baixa morbidade, apresenta número significativo de doença ocular, congênita ou do sistema nervoso central. O diagnóstico é sorológico por diferentes testes, mas limiares baixos e variação individual levam a frequentes problemas. Novos imunoensaios fluorescentes de fase sólida (FLISA) usam a quantificação direta de anticorpos. Aqui, desenvolvemos um FLISA multiplex (FLISAm) para a detecção simultânea de anticorpos IgG e IgM contra Toxoplasma gondii. Após padronização, a eficiência do FLISAm com conjugados comerciais foi feita inicialmente de forma isolada para cada imunoglobulina em 140 amostras de soro de universitários previamente analisadas pelo ELISA IgG/IgM. FLISA IgG mostrou boa concordância (Kappa=0,7088), com sensibilidade de 83,3% e especificidade de 94,2%, enquanto FLISA IgM apresentou boa concordância (K=0,6026), menor sensibilidade de 55,5% e igual especificidade de 98,4%. Foram produzidos novos conjugados fluorescentes de maior especificidade e seu desempenho no FLISAm foi validado em 24 amostras e sua eficiência foi avaliada em 120 amostras conhecidas de soro de gestantes. FLISAm mostrou excelente concordância, tanto para a detecção de anticorpos IgG (K=0.8837, sensibilidade=100,0%, especificidade=87,5%), quanto para a detecção de anticorpos IgM (K=0,9187, sensibilidade=100%, especificidade=99,1%) com excelente reprodutibilidade. O teste desenvolvido é rápido, econômico, de fácil execução, alto rendimento e que pode ser utilizado como método de triagem de soroconversão em mulheres grávidas, útil em aplicações de grande número de amostras como o cuidado pré-natal. / Toxoplasmosis, a disseminated low morbidity protozoan disease, presented significant numbers of affected people, mainly ocular disease, fetal infections or encephalitis in immune deficient patients. Serology is the main diagnosis with commercial antibody assays, but individual variation or low thresholds cause many inconsistencies. New solid phase immunofluorescence assays (FLISA) allows direct antibody quantification in microplates. Here, we developed a multiplex FLISA (FLISAm) for simultaneous detection of IgG and IgM anti-Toxoplasma gondii antibodies. After standardization, the efficiency of this method was initially analyzed in isolated FLISA for each immunoglobulin with commercial conjugates in 140 serum samples of the students previously screened by IgG/IgM ELISA. IgG FLISA showed good concordance (Kappa=0.7088), 83,3% sensitivity and 94,2% specificity, while IgM FLISA also showed good concordance (Kappa=0,6026), lower 55,5% sensitivity and similar 98,4% specificity. New higher efficiency conjugated were prepared and tested in 120 serum samples of the pregnant woman in a same well conjunct IgG/IgM FLISAm. We also validate the FLISAm in 24 serum samples. Compared to isolated ELISA IgG/IgM, FLISAm demonstrated excellent concordance for IgG (Kappa=0.8837; sensitivity=100%; specificity=87,5%,) and IgM (Kappa=0,9187; sensitivity=100%; specificity=99,1%), with excellent reproducibility. The standardized FLISAm is quick, inexpensive, easily performed and high throughput and the assay can be used for screening serum conversion in pregnant women, useful in large numbers applications as antenatal care.

Introdução: A água tem sido considerada um importante veículo para a disseminação de surtos de toxoplasmose em vários países. Os oocistos de Toxoplasma gondii podem persistir no ambiente durante longos períodos, sendo altamente resistentes aos vários processos químicos de inativação, inclusive aos processos comuns de desinfecção utilizados pelos sistemas produtores de água. Pouco se tem registrado no país sobre a real extensão da contaminação dos recursos hídricos por Toxoplasma gondii, sendo que a sua detecção em amostras de águas é muito importante na implantação de ações preventivas. As metodologias existentes no momento para identificação e quantificação deste parasita nestes tipos de amostras não estão universalmente padronizadas e apresentam limitações. Objetivo: O presente estudo teve como objetivo verificar a possível presença do protozoário em águas superficiais de abastecimento público no Estado de São Paulo mediante a implantação de uma metodologia específica para a quantificação de oocistos de Toxoplasma gondii por reação quantitativa de PCR em tempo real nessas amostras. Método: Um total de 39 amostras de águas superficiais provenientes de 10 mananciais do Estado de São Paulo foram analisadas durante o período de maio a dezembro de 2015. Volumes de 20L da amostra foram concentrados por meio de filtração em cápsulas Envirocheck® HV (Pall Gelman Laboratory), sendo a cápsula filtrante tratada com uma solução dispersante, eluída e o eluato concentrado por centrifugação. O sedimento obtido após a centrifugação da amostra foi submetido à extração de DNA, sendo utilizado o kit de extração PowerSoil DNA isolation® (MO BIO Laboratories). A sequência alvo selecionada para detecção e quantificação de oocistos de Toxoplasma gondii através da reação quantitativa de PCR em tempo real foi um fragmento de 62 pares de bases do gene B1, sendo utilizado o seguinte conjunto de iniciadores: 5 CTAGTATCGTGCGGCAATGTG 3 (531-551) e 5GGCAGCGTCTCTTCCTCTTTT 3 (571-592). A sonda utilizada foi: 5 (6-FAM) CCACCTCGCCTCTTGG-(NFQ-MGB) 3. Resultados: Do total das amostras analisadas, 7,7 por cento (3/39) foram positivas para oocistos de Toxoplasma gondii e dentre os 10 mananciais estudados, detectou-se a ocorrência do protozoário em 30 por cento (3/10) dos mesmos. Conclusão: Os dados obtidos no presente estudo demonstram que o protozoário Toxoplasma gondii está circulando em águas superficiais de abastecimento público no Estado de São Paulo. / Introduction: Water is an important vehicle for the spread of toxoplasmosis outbreaks in several countries. Toxoplasma gondii oocysts may remain for a long period in the environment and are highly resistant to chemical inactivation, including the routine classical disinfection procedures in water treatment facilities. Few reports have been published in Brazil about the real extent of the contamination of water resources by Toxoplasma gondii, which is of major importance to implement preventive actions. Methods for the identification and quantification of the parasite in water bodies are not standardized and have limitations. Objective: This study aimed to verify the presence of these protozoa in surface waters used as source for drinking water production in the State of São Paulo by implementing a specific methodology to quantify Toxoplasma gondii oocysts with quantitative real-time PCR. Method: Thirty nine samples of surface waters from 10 different sites in the State of São Paulo were analized from May to December 2015. Volumes of 20L of each sample were concentrated by filtration with capsule Envirocheck® HV (Pall Gelman Laboratory).The filter capsule was treated with a dispersant solution, eluted, and the eluate concentrated by centrifugation. DNA was extracted from the resulting pellet with PowerSoil DNA isolation® (MO BIO Laboratories) extraction kit. A fragment of 62 base pairs of the B1 gene was selected as target sequence for detection and quantitation the Toxoplasma gondii oocysts by the quantitative real-time PCR reaction, and the following primers: 5\' TAGTATCGTGCGGCAATGTG 3\' (531-551) and 5\'GGCAGCGTCTCTTCCTCTTTT 3\' (571-592) were used. The probe employed was 5 \'(6-FAM) CCACCTCGCCTCTTGG- (NFQ-MGB) 3\'. Results: Toxoplasma gondii oocysts were detected in 30 per cent (3/10) of the sites evaluated and 7.7 per cent (3/39) of all samples analyzed were positive. Conclusion: The results of the present study show that the protozoan Toxoplasma gondii is circulating in surface waters used as drinking water supply in the State of São Paulo.

Toxoplasma gondii vs radiação ionizante: Imunidade humoral e celular em baço e intestino de camundongos isogênicos imunizados com taquizoítos irradiados por Cobalto 60 Andrés Jimenez Galisteo Jr. Estudamos o desenvolvimento de uma vacina para toxoplasmose utilizando a radiação ionizante como ferramenta. Aqui avaliamos o desenvolvimento da imunidade sistêmica e intestinal e a resistência à infecção, em diferentes camundongos imunizados, por via oral e parenteral, com taquizoítos irradiados a 255 Gy e desafiados com cistos da cepa ME49. Camundongos C57Bl/6j, BALB/c e C57Bl/6j IFN--/- foram imunizados com 107 taquizoitos de T. gondii irradiados a 255Gy por diferentes vias. As preparações de taquizoítos irradiados, por via oral e parenteral, induziram produção de imunoglobulinas IgG e IgA no soro de camundongos, sendo predominante a subclasse de IgG2b, determinadas por ELISA. A produção de IgM foi mínima. Os animais imunizados pela via parenteral, apresentaram uma maturação mais rápida da avidez de anticorpos IgG que os animais imunizados por via oral. Houve excreção de IgG, IgA e IgM nas fezes dos animais imunizados, mais intensa nos animais imunizados por via oral. No estudo da imunidade celular induzida por antígeno e detectada for real-time PCR, houve uma grande produção de IFN- por células esplênicas, menor por células das placas de Peyer intestinais, onde houve maior produção de IL-2. Houve proteção em todos os nossos esquemas avaliados, maior nos animais BALB/c. Os animais deficientes de IFN-, não foram afetados pelo processo de imunização e apresentaram produção de IgG e IgA sérico e excreção de S-IgA e S-IgM nas fezes, com menor numero de cistos cerebrais em animais imunizados por via parenteral. Todos nossos dados apontam para a possibilidade do desenvolvimento de uma vacina oral para toxoplasmose, utilizando taquizoítos irradiados, com aplicação prática na imunização de felinos domésticos e selvagens. / We are developing a vaccine for toxoplasmosis, using ionizing radiation as a tool. Here we analyzed the production of sytemic and intestinal immunity, with protection studies, in several strains of inbred mice, by oral or parenteral route, using 255 Gy irradiated tachyzoites of T. gondii RH strain, with challenge with cysts of ME- 49 strain. C57Bl/6j, BALB/c and C57Bl/6j IFN--/- mice were immunized with 107 irradiated tachyzoites, be parenteral or oral route. Those preparations, both by parenteral or oral routes, induced the production of specific IgG, mainly of the IgG2b subclass, and IgA immunoglobulins in serum, , as determined by ELISA. IgM production was negligible. Parenteral immunized mice showed higher IgG avidity maturation, as compared to oral immunized mice. Fecal excretion of IgG, IgA and IgM was detected in stools of immunized animals, more intense in oral immunized mice. In cellular immunity studies, induced by antigen, with detection of cytokine production by quantitative real-time PCR, there are a great production of IFN- by spleen cells, with lower levels in Peyer patches cells, where there are a greater IL-2 production. Challenge studies in immunized mice demonstrated protection to infection in all used schedules, greater in BALB/c mice. C57Bl/6j IFN--/- mice, when immunized, showed no signs of disease and produced similar or greater levels of antibodies than wild type mice. They also excreted S-IgA and S-IgM in stools, but with low numbers of brain cysts in parenteral immunized mice, despite similar mortality. Our data points to a fair possibility of use of those irradiated parasites as an oral vaccine, devised to use for veterinary or wild felines vaccination, reducing the production of oocysts by those hosts and interrupting the chain transmission of human toxoplasmosis.