Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos. / Made available in DSpace on 2012-10-23T06:09:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 242797.pdf: 1641566 bytes, checksum: 344ca738db61988162a36eddd229ecba (MD5) / The aim of this study was to assess the optimal conditions for transglutaminase cross-linking of whey proteins from reconstituted Concentrated whey solutions, in regards to heat treatment effects on transglutaminase kinetics and protein polymerization effects on gel Temperature. The effects of this enzymatic assay on physical properties of yogurt were also determined. The polymerization of whey proteins by the effect of transglutaminase activities was determined by the consistency index obtained from rheological measurements in reconstituted concentrated whey solutions (50 %pv-1) at different temperature-time treatments and Enzyme concentrations. The effects of heat treatment on whey proteins flow behavior before the reaction were determined by using the Power Law Model. The gelation temperature and turbidity of whey solutions were Examined after treatment for 4#24 h at different pH values (6.0; 7.0; 8.0). Furthermore, the physical properties yogurt treated with transglutaminase (0.5 Ug-1 protein) were studied. It was determined that the reaction between â-lactoglobulin, á- lactalbumin and transglutaminase was improved when carried out at 36 °C for 4 hours, at the optimum enzyme concentration of 50 Ug-1. The samples submitted to this treatment showed a pseudoplastic behavior and had a higher consistency index. Heat treatment of solutions at 85, 90 e 95 °C prior to enzyme addiction seemed to improve the reaction; the consistency index was higher (p<0.05) on solutions submitted to this procedure. After the enzyme activity, the gelation temperatures of whey solutions were lower than in control samples. This reduction was intensified by increasing the time of reaction. The production of yogurt with previous enzymatic treatment of milk and whey conferred less syneresis and higher gel firmness in texture analysis. These results proof that transglutaminase could be applied in order to compensate for the changes on physical properties on yoghurt caused by the addition of milk whey.

Orientador: Hélia Harumi Sato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-23T16:00:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_PriscilaHoffmann_D.pdf: 4102242 bytes, checksum: 1496382da70a395d87d5c8536317d42d (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A isomaltulose e a trealulose são dissacarídeos isômeros estruturais, que podem ser obtidos a partir da sacarose utilizando-se glicosiltransferase bacteriana. Esses dissacarídeos são considerados açúcares alternativos de grande potencial para uso nas indústrias de alimentos e farmacêutica porque são hidrolisados e absorvidos mais lentamente e apresentam baixo potencial cariogênico comparado com a sacarose. Foi estudada a imobilização de células de Serratia plymuthica ATCC 15928, produtora de glicosiltransferase por gelificação iônica em gel alginato contendo transglutaminase (TG) e também a utilização de células livres para a conversão de sacarose em isomaltulose e trealulose. Utilizando-se células livres de Serratia plymuthica ATCC 15928 foi obtido 70% de conversão em isomaltulose e 8% de trealulose a 25°C por 10 bateladas de 15 minutos, a partir de solução de sacarose 30%. Entre as cinco amostras de alginato de sódio testadas, para a imobilização das células de S. plymuthica ATCC 15928 com e sem adição de TG, foram obtidos melhores resultados (médio de três bateladas) de conversão de sacarose (37,4% de isomaltulose) utilizando o alginato de sódio B, de alta viscosidade (14.000cP Sigma ¿ A 7128) em presença de TG. Nas condições estudadas (1,7% de alginato de sódio, 30% de massa celular úmida, solução de cloreto de sódio 0,2Mol/L, 2% de TG e 35% de sacarose) também houve maior facilidade de formação de grânulos uniformes. A presença de TG como agente de reticulação na matriz de imobilização melhorou a estabilidade de conversão por três bateladas onde observou-se resultado médio 27% maior com relação a matriz com o mesmo tipo de alginato (B) em ausência de TG. A composição da matriz de imobilização com adição de TG foi otimizada por metodologia de planejamento experimental, assim como a adição de gelatina como fonte de proteína adicional para promoção de ligações cruzadas catalisadas pela TG. Os melhores resultados de conversão de sacarose (solução 35%) em isomaltulose (72,66% de isomaltulose e 8% de trealulose em 4 bateladas de 24horas) foram obtidos utilizando-se matriz de polissacarídeo-proteína composto de 1,7% de alginato de sódio 14.000cP (Sigma®-A7128), 0,25mol/L de CaCl2, 0,5% de gelatina, 3,5% de TG e concentração de massa celular úmida superior a 35% (m:v). Verificou-se que a adição de ALMP na matriz de alginato de cálcio-gelatina-TG para imobilização de S. plymuthica, testada por planejamentos experimentais seqüenciais, não aumentou a estabilidade da taxa de conversão de sacarose em isomaltulose quando comparada com as células imobilizadas em matriz de alginato de cálcio-gelatina-TG. Em processo contínuo utilizando-se coluna empacotada com células de S. plymuthica imobilizadas em matriz otimizada e descrita acima, foi obtida taxa de conversão média de 64% de sacarose em isomaltulose durante 200 horas de processo, equivalente a 0,27g de isomaltulose/g de células imobilizadas/hora em coluna a 25°C e fluxo de substrato (35% de sacarose) 0,2mL/min / Abstract: The isomaltulose and trehalulose are disaccharides and structural isomers, which can be obtained from sucrose using bacterial glycosyltransferase. These disaccharide are considered alternative sugars with great potential for use in the food and pharmaceutical industries because they are hydrolyzed and absorbed more slowly and have a low cariogenic potential compared with sucrose. The conversion of sucrose to isomaltulose and trehalulose was estudied using immobilized and free cells of Serratia plymuthica ATCC 15928. The cells were immobilized by ionic gelation in alginate gel containing transglutaminase. Using free cells of Serratia plymuthica ATCC 15928 was obtained 70% isomaltulose conversion and 8% trehalulose conversion at 25° C in 10 batches of 15 minutes from a 30% sucrose solution. Among the five samples of sodium alginate tested for S. plymuthica ATCC 15928 cells immobilization, with or without the addition of TG, the best results (average of three batches) were obtained using sodium alginate B, high viscosity (14.000cP Sigma - A 7128) in the presence of TG, leading to 37.4% isomaltulose conversion from sucrose. In the studied conditions (1.7% sodium alginate, 30% wet cell mass solution of sodium chloride 0.2 Mol/L, 2% TG, 35% sucrose) was also easier to form uniform granules. The presence of TG as a crosslinking agent in the immobilization matrix improved the stability during three batches, resulting in an 27% higher average conversion with respect to a same type of alginate (B) matrix in absence of TG. Immobilization matrix compositions with addition of TG was optimized by experimental design methodology, as well as the addition of gelatin as a protein source for promoting additional crosslinking catalyzed by TG. The best results conversion of sucrose (35% solution) into isomaltulose (72.66% of isomaltulose and 8% of trehalulose in 4 batches of 24 hours) were obtained using proteinpolysaccharide matrix composed of 1.7% alginate 14.000cP sodium (Sigma® A7128), 0.25 Mol/L CaCl2, 0.5% gelatin, 3.5% TG, and wet cell mass concentration of 35% (w:v). It has been found that the addition of ALMP (amidated low methoxyl pectin) into the calcium alginate-gelatin-TG matrix for immobilization of S. plymuthica, tested by sequential experimental design, do not increase the stability of sucrose to isomaltulose conversions rate when compared with cells immobilized in calcium alginate -gelatin-TG matrix. In continuous process using a packed column with S. plymuthica cell's immobilized in the optimized matrix described above, it was obtained an average conversion rate of 64% sucrose to isomaltulose during a 200 hours process, equivalent to 0.27g isomaltulose per gram of immobilized cell per hour, in a column at 25° C and using flow substrate (35% sucrose) of 0.2 mL / min / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutora em Ciência de Alimentos

Orientador: Hélia Harumi Sato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-24T06:55:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bagagli_MarcelaPavan_D.pdf: 5889679 bytes, checksum: 9bd456830fa35028a89bffb19885f07d (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A transglutaminase catalisa a formação de ligações cruzadas entre grupos ?-amino de resíduos de lisina e o grupo ?-carboxiamida de resíduos de glutamina de proteínas. Esta enzima pode ser usada para unir diferentes proteínas e melhorar suas propriedades funcionais. A transglutaminase obtida de micro-organismos por processos fermentativos apresenta vantagens em relação à enzima obtida de plantas e tecidos animais para as aplicações industriais. Neste trabalho, foram estudados os efeitos de diferentes subprodutos ou resíduos agroindustriais no meio de cultivo para a fermentação submersa de Streptomyces sp. CBMAI-837, visando o aumento da atividade e da produtividade da enzima. Entre os substratos proteicos avaliados, o uso de 2,5% (m:v) de farelo de algodão ou de 2,5% (m:v) de farelo de soja no meio de cultivo resultou no aumento da atividade enzimática de 1,2 U.mL-1 (214%) e 1,0 U.mL-1 (182%), respectivamente, em relação ao valor obtido pela fermentação do micro-organismo em meio de cultivo contendo 2,5% de farinha de soja (0,57 U.mL-1). Em relação às fontes de carbono principais avaliadas, a adição de 2,0% de glicerol ou de 12% de melaço de cana de açúcar permitiu o aumento da atividade de transglutaminase em 0,94 U.mL-1 (167%) e 0,88 U.mL-1 (157%), respectivamente. Foi verificado que a adição de 1% de quitina nativa no meio de cultivo favoreceu a produção da enzima elevando a atividade de transglutaminase em 181% em relação ao meio de cultivo sem quitina. Os efeitos da aplicação da TGase de Streptomyces sp. CBMAI-837 em massa de farinha de trigo mole e na fabricação de pães foram avaliados e os resultados foram comparados com a atuação de uma TGase comercial (BioBond) formulada para aplicação em cereais. De forma geral, as duas enzimas avaliadas apresentaram o mesmo efeito sobre a massa quanto ao aumento da resistência à extensão, a redução da máxima extensão da massa e a redução da pegajosidade da massa. Efeito antagônico foi observado na hidrofobicidade de superfície das proteínas da massa sendo que este parâmetro foi reduzido pela adição da TGase de Streptomyces sp. CBMAI-837 e foi elevado pela enzima comercial. A adição de TGase na preparação da massa de farinha de trigo mole resultou em aumento da massa molecular das proteínas, indicantivo da formação de ligações cruzadas entre proteínas. A aplicação da transglutaminase de Streptomyces sp. CBMAI-837 em massa de pão de farinha de trigo mole promoveu a redução do volume do pão em 9% e o aumento da firmeza em 32%. O aumento da quantidade de solvente adicionado na massa de 53% para 56% permitiu o aumento do volume dos pães, no entanto, com pouca diferença dos parâmetros de textura em relação ao controle para a TGase comercial BioBond e para a TGase de Streptomyces sp. CBMAI-837 / Abstract: Transglutaminase catalyzes the cross-linking reaction between a ?-carboxyamide of a glutamine residue from a peptide bond and the ?-amino group of a lysine. TGase can bind different proteins and improve their functional properties. The microbial transglutaminase shows advantages over the enzyme extracted from plants and mammals. In the present study, the effect of different industrial wastes and byproducts in the culture medium during the submerged fermentation of Streptomyces sp. CBMAI-837 was studied aiming to increase the enzyme activity and yield. Amongst the substrates with high protein content, the use of 2,5% of cottonseed meal or 2,5% of soybean meal in the culture medium increased the transglutaminase activity to 1.2 U.mL-1 (214%) and 1.0 U.mL-1 (182%), respectively, as compared to the results obtained using 2,5% of soybean flour. With regard to the main carbon sources, both 2% glycerol and 12% sugar cane molasses increased the transglutaminase activity to 0.94 U.mL-1 (167%) and 0.88 U.mL-1 (157%), respectively. It was observed that the addition of 1% of chitin on culture medium increased the transglutaminase activity by 181% as compared to the results obtained without the addition of chitin. The effects of the TGase from Streptomyces sp. CBMAI - 837 on soft wheat flour dough and on the manufacture of bread were evaluated, and the results were compared with the performance of a commercial TGase (BioBond) formulated for specific applications in cereal products. In general, both enzymes had the same effect on the rheological properties of the doughs, increasing the resistance to extension, reducing the maximum extension and reducing stickiness of the dough. The surface hydrophobicity of the protein dough was reduced by the addition of TGase from Streptomyces sp. CBMAI 837 but increased by the addition of the commercial enzyme. In general the analysis of the protein structure indicated an agglomeration of the proteins causing an increase in molecular weight. The application of transglutaminase from Streptomyces sp. CBMAI-837 in the formulation of bread loaves decreased the bread volume by 9% and increased firmness by 32%. Increasing the amount of solvent added to the dough from 53% to 56% increased the volume of the loaves, but resulted in little difference in the texture profiles of the loaves made with the addition of the commercial BioBond and Streptomyces sp. CBMAI ¿ 837 TGases, in relation to the control / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutora em Ciência de Alimentos

Os objetivos desse estudo foram: 1) Padronizar a pesquisa do anti-tTg, comparando-o com o anticorpo antiendomísio (AAE) e 2) Avaliar as interações da tTg com a fibronectina. 49 celíacos e 124 controles com AAE negativo foram avaliados. O AAE foi pesquisado por imunofluorescência indireta e a reatividade contra a tTg e a fibronectina por ELISA in house e com kits comerciais. O antitTg foi positivo em 46,9% e 100% dos celíacos com o ELISA in house e com kits comerciais, respectivamente. A adição de fibronectina não melhorou a sensibilidade do ELISA. Em conclusão: a detecção do antitTg por ELISA apresenta percentual elevado de falso-positivos, não podendo substituir a pesquisa do AAE / The aims of the current study were: to standardize the detection of anti-tTg antibodies, comparing them with antiendomysial antibodies (EMA) and to assess the interaction of tTg with fibronectin. 49 celiac patients and 124 controls were enrolled. EMA was detected by indirect immunofluorescence reaction and tTg and fibronectin reactivity by in house ELISA and with commercially available kits. Seropositivity to anti-tTG was found in 46.9% and 100% of patients by the in house technique and by commercial kits, respectively. Fibronectin addition did not improve the ELISA sensibility. In conclusion, ELISA for anti-tTG detection has a high rate of false positive results and does not replace EMA

Thesis (Ph.D.)--University of Alabama at Birmingham, 2009. / Title from PDF title page (viewed on Sept. 4, 2009). Includes bibliographical references.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos. / Made available in DSpace on 2012-10-24T02:53:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 257467.pdf: 3529841 bytes, checksum: b02ec64317beb4c8e60e372bd2d5cf51 (MD5) / Os objetivos deste trabalho foram: avaliar a influência de polissacarídeos, nas propriedades físicas e químicas de queijos cremosos elaborados com soro de leite líquido e diferentes processos de coagulação, durante 21 dias de armazenamento; avaliar as reações promovidas pela transglutaminase nas etapas de coagulação de leite por renina, e seu impacto nas propriedades físico-químicas e físicas de queijos cremosos. Foi analisada a influência de gomas: xantana (0,2% p/p) e xantana combinada com locusta (0,1 a 0,3% p/p) e guar (0,1 a 0,3%p/p) em queijos cremosos elaborados com gel ácido e gel enzimático. Como também a influência da transglutaminase (TG) em diferentes fases da coagulação do leite por renina, na formação de géis lácteos e queijos cremosos elaborados com estes géis. Os parâmetros analisados foram os físico-químicos, índices de sinerese e de separação de soro e o comportamento reológico. Além da análise microscópica de fluorescência que foi realizada para as amostras com xantana. A xantana se mostrou eficiente no aumento de viscosidade das amostras, resultando em uma matriz protéica mais uniforme e menos porosa, e conseqüentemente dificultando a separação de soro dos queijos cremosos elaborados com géis ácidos e enzimáticos. Em relação às amostras com polissacarídeos combinados as amostras apresentaram maior índice de consistência, com comportamento pseudoplástico com tixotropia, quando utilizou-se as proporções de 0,2% xantana / 0,2% locusta e géis enzimáticos. Para os géis ácidos, os maiores valores para o índice de consistência (K) foram obtidos para os polissacarídeos nas concentrações 0,2% xantana / 0,3% locusta, assim como para a viscosidade aparente, resultados observados a partir do 15º dia de armazenamento. Para as amostras elaboradas com diferentes processos de coagulação e polissacarídeos combinados, a amostra elaborada com gel enzimático apresentou maior consistência, menor índice de sinerese e de separação de soro. Em relação às amostras adicionadas de transglutaminase, observou-se que a transglutaminase adicionada 7 minutos após a adição de renina, apresentou forte correlação (94,83%) com o teor de proteína, sólidos totais e propriedades reológicas, preservando as propriedades coagulantes da renina. Os polissacarídeos (combinados ou não) e a transglutaminase se mostraram eficientes em reduzir índices de sinerese e separação de soro, e aumentar a viscosidade das amostras de queijos cremosos adicionados de soro lácteo. The aims of this study were: to evaluate the influence of the polysaccharides, on the physical and chemical properties of the cream cheeses manufactured with milk whey and different coagulations, during 21 days of storage; to evaluate the reactions led by transglutamise on stages of renneting, and the results on physicalchemical and physical properties of the cream cheeses. It was analyzed the influence of the xanthan gum (0,2% w/w) and blend xanthan and locust (0,1 to 0,3 % w/w) and guar (0,1 to 0,3 % w/w) in cream cheeses manufactured with acid and rennet gel. As well as o the influence of the transglutaminase on different stage of renneting, on the milk gel and cream cheese manufactured with these gels. The parameters analyzed were the physicalchemicals, syneresis index and the wheying-off and rheological properties. The fluorescence microscopy analysis was done in the samples with xanthan. The xanthan was efficient on the increase of the viscosity of the samples, resulting more uniform and less porous protein matrix, and consequently decreasing the wheying-off the cream cheese elaborated wit acid and rennet gel. In relation the samples with polysaccharides blend, the samples showed higher consistency index, showing behavior pseudoplastic with tixotropy, and, when it was used 0.2 % (w/w) xanthan / 0.2 % (w/w) locust blend and rennet gel. For the acid gels samples with polysaccharides with 0.2 % (w/w) xanthan / 0.3 % (w/w) locust blend, showed higher values for the consistency index (K) and the apparent viscosity, tyhese were results observed in samples with 15 days of storage. In order to evaluate the samples with different coagulations process and polysaccharides blends, the samples manufactured with rennet showed the higher consistency, shorter syneresis index and wheying-off. With regard to samples with transglutaminase, it was observed that, the samples with transglutaminase was added 7 min after the rennet, had high correlation (94,83%) with the protein, total solids and rheological properties, maintaining renneting properties. The polysaccharides (blend or not) and the transglutaminase were efficient to decrease syneresis index and wheyingoff, and to enhance viscosity of the cream cheeses samples with milk whey.

Os objetivos desse estudo foram: 1) Padronizar a pesquisa do anti-tTg, comparando-o com o anticorpo antiendomísio (AAE) e 2) Avaliar as interações da tTg com a fibronectina. 49 celíacos e 124 controles com AAE negativo foram avaliados. O AAE foi pesquisado por imunofluorescência indireta e a reatividade contra a tTg e a fibronectina por ELISA in house e com kits comerciais. O antitTg foi positivo em 46,9% e 100% dos celíacos com o ELISA in house e com kits comerciais, respectivamente. A adição de fibronectina não melhorou a sensibilidade do ELISA. Em conclusão: a detecção do antitTg por ELISA apresenta percentual elevado de falso-positivos, não podendo substituir a pesquisa do AAE / The aims of the current study were: to standardize the detection of anti-tTg antibodies, comparing them with antiendomysial antibodies (EMA) and to assess the interaction of tTg with fibronectin. 49 celiac patients and 124 controls were enrolled. EMA was detected by indirect immunofluorescence reaction and tTg and fibronectin reactivity by in house ELISA and with commercially available kits. Seropositivity to anti-tTG was found in 46.9% and 100% of patients by the in house technique and by commercial kits, respectively. Fibronectin addition did not improve the ELISA sensibility. In conclusion, ELISA for anti-tTG detection has a high rate of false positive results and does not replace EMA

Orientador: Flavia Maria Neto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-21T08:25:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franca_CeliadeJesus_M.pdf: 1711635 bytes, checksum: 8b68d7bd0f495d93e2c2949a9229045c (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Estudos indicam que cerca de 2,5% dos recém-nascidos sofrem reações de hipersensibilidade ao leite bovino. Os principais componentes alergênicos do soro do leite bovino são as proteínas ß-Lactoglobulina (ß-Lg) e a-Lactoalbumina (a-La). A enzima transglutaminase (TG) tem sido utilizada para modificar as proteínas do soro do leite, podendo reduzir o seu potencial antigênico. O objetivo desse trabalho foi estudar o efeito do pH e relação enzima substrato (E:S) na polimerização do Isolado proteico do soro do leite (IPS) com a TG em diferentes condições utilizando a Metodologia de Superfície de Resposta, e avaliar a redução do potencial antigênico das proteínas pela suscetibilidade dos produtos obtidos à digestão com pepsina. O estudo da polimerização do IPS foi realizado por meio de experimentos fatoriais 22, nos quais as variáveis independentes foram a relação enzima:substrato (E:S) (15,7 ¿ 56,9 U TG /g de proteína) e pH (5,0 ¿ 8,4). A variável dependente foi a polimerização das amostras avaliada pela concentração relativa das proteínas ß-Lg ([ß-Lg]) e a-La ([a-La]) após a reação de polimerização, medida por densitometria do gel. Para o estudo da polimerização, foram realizados dois DCCR(Delineamento Composto Central Rotacional): DCCR 1 no qual foi utilizado o IPS sem qualquer tratamento e DCCR 2 no qual foi utilizado o IPS tratado termicamente. Para condição do DCCR 2, foi realizado um experimento preliminar afim de obter as melhores condições de tempo e temperatura de polimerização pela TG. A caracterização das amostras de IPS polimerizado foi realizada por eletroforese (SDS-PAGE). As amostras que apresentaram a menor [ß-Lg] foram empregadas para o estudo de resistência à pepsina, foram utilizados dois modelos de simulação da digestão gástrica: o adulto (182 U de pepsina/g de proteína, pH 2,0) e o infantil (23 U de pepsina/g de proteína, pH 4,0) seguida por caracterização por eletroforese (SDS-PAGE). A avaliação in vitro da antigenicidade dos digeridos gástricos foi realizada por ELISA, utilizando soro de camundongos BALB/c sensibilizados com ß-Lg na forma nativa. A polimerização do IPS pela TG foi mais eficiente quando a proteína foi previamente desnaturada por tratamento térmico. No DCCR 1 ocorreu maior polimerização da a-La do que da ß-Lg, indicando que esta proteína reage facilmente com a TG, mesmo sem tratamento térmico prévio. A digestão in vitro do IPS foi mais eficiente nas condições fisiológicas simulando o modelo adulto do que o infantil. Em ambos os modelos, a amostra tratada termicamente e polimerizada com TG (IPS/TT-TG) foi mais susceptível à pepsina e também foi a que apresentou a menor resposta frente IgE anti- ß-Lg. A diminuição moderada do potencial alergênico após os tratamentos realizados sugerem que houve modificação e ou ocultação de epítopos da estrutura da proteína / Abstract: Studies indicate that about 2.5% of newborns suffer from hypersensitivity reactions to cow¿s milk. The main allergenic components of bovine whey proteins are ß-lactoglobulin (ß-Lg) and a-lactalbumin (a-La). The enzyme transglutaminase (TG) has been used for modifying whey proteins, and may reduce their antigenic potential. The present work aimed at studying the effect of pH and enzyme substrate (E:S) on the polymerization of the IPS with TG under different conditions using Response Surface Methodology, and evaluate the reduction of potential of the antigenic proteins using the susceptibility of products to pepsin digestion. The study of the IPS polymerization was performed by factorial experiments 22, in which the independent variables were enzyme: substrate ratio (E: S) (15.7 to 56.9 U TG / g of protein (U g-1) ) and pH (5.0 - 8.4). The dependent variable was polymerization of the samples evaluated by the relative concentration of the ß-Lg ([ß-Lg]) and a-La ([La-a]) after the polymerization reaction, evaluated by densitometry of the gel. To study the polymerization, two CRCD (Central Rotatable Composite Design) were performed: CRCD 1 in which untreated WPI was used and CRCD 2 in which WPI denatured by heat treatment was used. The characterization of the samples was performed by SDS-PAGE. The evaluation of the polymerization was achieved by the relative concentration of the proteins ß-Lg ([ß-Lg]) and a-La (([a-La]) after polymerization, determined by densitometry. The samples with the lowest [ß-Lg] were chosen for the study of resistance to pepsin using two simulation models of gastric digestion, the adult (182 U pepsin / g of protein and pH 2.0) and infant (23 U pepsin / g of protein, pH 4.0). The resistance of the proteins to the action of pepsin was evaluated by SDS-PAGE. Evaluation of the antigenicity of the samples before and after gastric digestion was performed by ELISA using sera from BALB/c mice sensitized with ß-Lg in its native form. Between the two designs carried out for the polymerization of WPI by TG, the one in which the WPI has previously been denatured by heat treatment was more effective. The in vitro digestion of WPI was more efficient under conditions simulating the physiological adult model than the infant model. In both models the sample which was heat treated and subsequently polymerized by TG was more susceptible to pepsin, and showed the lowest anti-IgE response against ß-Lg, indicating that the allergenic potential was decreased after treatment. These results suggested that there was a modified and/or hidden of the epitopes / Mestrado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Mestra em Alimentos e Nutrição

Transglutaminases (TGases) are a group of enzymes that catalyze the formation of an amide bond between the γ-carboxamide group of a glutamine residue and an amine donor, usually an ε-amino group of the lysine residue, leading to the formation of ε-(γ-glutamyl)lysine crosslinks. Owing to the roles that transglutaminases such as tissue transglutaminase (TG2) and Factor XIIIa (FXIIIa) have been found to play in a wide range of disease states, efforts have been directed towards the study of these proteins. The study of enzymes to better understand their function and mode of action is facilitated through the use of tools such as protein labelling, enzyme inhibition, and substrate analogue kinetic studies among others. Transition state analogues have been effective inhibitors in the study of enzyme activity. Sulfoxide inhibitors can efficiently mimic transition states leading to the tetrahedral intermediate of an acyl transfer reaction and we discuss the synthesis towards sulfoxide transition state analogue inhibitors of TG2 in chapter 2. Novel sulfoxide compounds were synthesized, though the desired target compounds proved difficult to isolate due to their instability. Fluorescent probes are effective in protein labelling as a means of discerning activity. This technique was applied in order to elucidate intracellular TG2 activity, which is a topic of controversy. To that end, the synthesis of a fluorescent, TG2-specific, cell permeable probe is discussed in chapter 3. However, preliminary in vivo results show that while the probe is cell permeable and fluorescent, it was not TG2-specific. Molecular modelling suggests that the hexa-arginine tag, designed to improve cell permeability, decreases the affinity of the probe for its intended target. Finally, FXIIIa has become a new addition to the study of transglutaminases in the Keillor group. Given our interest in this enzyme, we had three goals for this work as explained in chapter 4. Firstly, owing to the anticipated high demand for FXIIIa required for later experiments, our primary aim was the development of an optimized method for the expression and purification of recombinant FXIIIA. After evaluating different conditions for FXIIIA expression, the Studier auto-induction ZYP media1 at 20 °C for 24 h was found to provide the optimal conditions for the expression of recombinant GST-tagged FXIIIA, typically giving a total of 1.5 mg of protein/L of culture. Secondly, a variety of different peptides were synthesized and tested using a glutamate dehydrogenase (GDH)-based assay to identify a high affinity sequence for a substrate of FXIIIa. The two peptides with the highest affinity for FXIIIa were Ac-DQMMMAF-OH and Ac-DQMML-OH. Testing with TG2 displayed negligible reactivity, confirming their use as orthogonal peptides, results reinforced by modelling studies of the peptides with both FXIIIa and TG2. This discovery represents the first time peptides orthogonal to TG2 with affinity for FXIIIa have been kinetically characterized with both transglutaminase enzymes. Lastly, our work towards a fluorogenic activity assay by incorporating a coumarin ester through attachment to a glutamic acid residue into a peptide sequence recognized by FXIIIa, will be discussed.

Orientador: Flavia Maria Netto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-14T13:49:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernandes_MicheleAugusto_M.pdf: 2050778 bytes, checksum: aedc46d9b78bf413f7e34cfbe46a36a6 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A ß-Lactoglubulina (ß-Lg) é uma das proteínas mais antigênicas presente no leite bovino. Tratamentos físicos, químicos ou enzimáticos podem alterar a antigenicidade desta proteína. Em trabalho anterior, verificou-se que o potencial antigênico da ß-Lg é reduzido quando polimerizada pela enzima transglutaminase (TG) na presença de cisteína (Cys). No entanto, o efeito da polimerização sobre o valor nutricional da ß-Lg ainda não é conhecido. O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito da reação de polimerização catalisada pela TG na digestibilidade in vitro e atividade antigênica da ß-Lg antes e após a ação das enzimas gastrintestinais. A ß-Lg polimerizada pela TG (0, 10 ou 25 U g-1), após tratamento térmico ou na presença de agentes redutores Cys (0, 0,1 e 0,25 mol L- 1) ou ditiotreitol (DTT 0,02 mol -1), foi avaliada quanto à digestibilidade in vitro, utilizando as enzimas pepsina e pancreatina. As amostras, antes e após a digestão in vitro, foram caracterizadas pelos métodos SDS-PAGE, SDSPAGE/ tricina e cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (CLAE-FR). Posteriormente, as amostras foram avaliadas quanto à antigenicidade, exceto aquelas na presença de DTT, por meio do método de Imunoblote, utilizando soro de camundongos BALB/c sensibilizados com a ß-Lg na forma nativa (ß-Lg N) ou com ß-Lg polimerizada com 25 U de TG g-1, na presença de 0,25 mol L-1 de Cys (ß-Lg 0,25Cys 25TG). A adição de TG resultou na formação de polímeros com massa molar igual ou acima de 97,4 kDa, principalmente na presença de agentes redutores alcançando aproximadamente 96% de polimerização na presença de DTT e 91% na presença de Cys. A digestibilidade in vitro da ß-Lg N foi 53,6% e todos os tratamentos realizados aumentaram a digestibilidade da proteína em até 79%. Os maiores valores de digestibilidade foram obtidos quando a ß-Lg foi tratada com agentes redutores. O processo de polimerização também teve efeito positivo na digestibilidade, principalmente para as amostras polimerizadas na presença de Cys ou DTT, atingindo valores acima de 75%. A análise por Imunoblote mostrou que a polimerização da ß-Lg na presença de agente redutor Cys, na concentração de 0,25 mol L-1, reduziu o reconhecimento da ß-Lg pelas IgE específicas presente nos soros dos animais sensibilizados com ß-Lg N ou com ß- Lg 0,25Cys 25TG. Após a digestão com pepsina e pancreatina, as amostras polimerizadas pós-tratamento térmico ou na presença de Cys apresentaram redução da antigenicidade, como também os digeridos da ß-Lg tratada com Cys (não polimerizada com TG). A desnaturação pelo agente redutor Cys e a polimerização por TG em ambas as condições estudadas mostraram ser métodos efetivos no aumento da digestibilidade da ß-Lg. Por sua vez, a combinação destes métodos com a digestão por enzimas gastrintestinais levou à redução da antigenicidade da proteína, já que os peptídeos gerados apresentaram potencial antigênico baixo / Abstract: The ß-Lactoglubulin (ß-Lg) is one of the most antigenic proteins present in the bovine milk. Physical, chemical or enzymatic treatments can alter the antigenicity of this protein. In previous study, it was shown that the antigenic potential of ß-Lg is reduced when polymerized by transglutaminase (TG) in the presence of cysteine (Cys). However, the effect of polymerization on the nutritional properties of ß-Lg is still unknown. The present study aimed to evaluate the effect of the polymerization reaction catalyzed by TG on the in vitro digestibility and the antigenic activity of ß- Lg, before and after simulate digestion with gastrointestinal enzymes. The in vitro digestibility of the ß-Lg treated with TG (0, 10 or 25 U g-1), after heat treatment or in the presence of reducing agents Cys (0, 0.1 and 0.25 mol L-1) or dithiothreitol (DTT 0.02 mol L-1), was evaluated using the gastrointestinal enzymes, pepsin and pancreatin. The samples, before and after in vitro digestion, were characterized by SDS-PAGE, SDS-PAGE/tricine and reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). Subsequently, the samples were evaluated for antigenicity, except those prepared in the presence of DTT, by immunochemical methods (Immnoblotting), using sera from BALB/c mice sensitized with native ß-Lg (ß-Lg N) or ß-Lg polymerized with 25 U of TG g-1 in the presence of 0.25 mol L-1 of Cys (ß-Lg 0.25Cys 25TG). The formation of polymers with molar mass equal to or above 97.4 kDa was observed with the addition of TG, especially in the presence of reducing agents, reaching approximately 96% of polymerization in the presence of DTT and 91% in the presence of Cys. The in vitro digestibility of native ß-Lg was 53.6% and the all treatments performed increased the digestibility of protein up to 79%. The highest values of digestibility were obtained in the presence of reducing agents. The polymerization also had a positive effect on the digestibility, especially for those samples polymerized in the presence of Cys or DTT, with values above 75%. Analysis by immunoblotting showed that the polymerization of ß-Lg in the presence of 0.25 mol L-1 Cys, reduced the recognition of ß-Lg specific IgE present in the sera of animals sensitized with ß-Lg N or ß-Lg 0.25 Cys 25TG. After digestion with pepsin and pancreatin, the samples polymerized after heat treatment or in the presence of Cys showed reduced antigenicity. The digest of the samples treated with Cys (not treated with TG) was not recognized as antigens. The denaturation by Cys and polymerization by TG in both conditions were effective in increasing the digestibility of ß-Lg. In turn, the combination of these methods with digestion by gastrointestinal enzymes led to reduction of antigenicity of the protein and that peptides generated showed low antigenic potential / Mestrado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Mestre em Alimentos e Nutrição