Orientador: Claudia Regina Bonini Domingos / Banca: Antonio Fabron Junior / Banca: Luiz Carlos de Mattos / Banca: Sonia Maria Oliani / Banca: Wilson Araújo Silva Junior / Resumo: Na talassemia beta, o acúmulo das cadeias alfa livres, bem como a liberação do grupo heme e do ferro durante o processo hemolítico, ocasionam aumento de danos oxidativos que podem resultar em lipoperoxidação de membranas celulares, desnaturação de proteínas e oxidação da hemoglobina. Na deficiência de glicose- 6-fosfato desidrogenase (G6PD), esse aumento é decorrente da diminuição da produção de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido (NADPH) que pode resultar em hemólise intravascular. Diante da possibilidade de estresse oxidativo nos portadores de beta talassemia heterozigota e nos indivíduos com deficiência de G6PD, neste trabalho avaliou-se a expressão fenotípica das afecções genéticas por meio da identificação das mutações e análise de marcadores para estresse oxidativo. Para o estabelecimento dos grupos controle e com deficiência de G6PD foram avaliadas 544 amostras de sangue periférico de indivíduos da região Noroeste do Estado de São Paulo, sendo 426 doadores de sangue e 118 indivíduos de uma instituição de ensino superior. Para a composição do grupo com talassemia beta heterozigota foram avaliadas 46 amostras de sangue de indivíduos com diagnóstico clínico de talassemia beta da cidade de São Carlos/SP. Foram realizados métodos de triagem e confirmatórios para a identificação da talassemia beta heterozigota e da deficiência de G6PD, e dosagens bioquímicas para quantificação das espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), utilizado como marcador de estresse oxidativo, e para a determinação da capacidade antioxidante em equivalência ao Trolox (TEAC). Os polimorfismos da glutationa S-transferase (GST) GSTM1 e GSTT1 foram avaliados por PCR multiplex o de GSTP1 por PCR/RFLP. No grupo com talassemia beta heterozigota foram encontradas 18 (39%) amostras com a mutação CD39; 22 (48%) com a mutação... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In beta thalassemia, the excess of unpaired alpha chains, as well as the heme group and iron released during the hemolytic process increase the oxidative damage. In G6PD deficiency, this increase is caused by a reduced production of NADPH that results in an intravascular hemolysis. Thus, facing the oxidative stress possibility in beta thalassemia carriers and G6PD deficiency individuals, it was aimed to evaluate the fenotypic expression of this genetic disorders through the mutation identification, as well as the oxidative stress marker analysis. We used 544 peripheral blood samples of individuals from São Paulo's northwestern to control group and to G6PD deficiency group establishment. For beta thalassemia heterozygote group were evaluated 48 blood samples of São Carlos/SP city. Tests were carried out aiming the screening and confirmation of beta thalassemia and G6PD deficiency, as well as the analysis of lipid peroxidation products measured as thiobarbituric acid reactive species (TBARS) and Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC). Were determined the frequencies of GSTM1, GSTT1 and GSTP1 polymorphisms. The analysis with beta thalassemia carriers allowed to establish in the study group a frequency of 39% for CD39 mutation, 48% for IVS-I-110 mutation and 2% for IVS-I-6 mutation. For G6PD deficiency was founded a frequency of 3.86%. The beta thalassemic group evaluation showed an increase of TBARS and TEAC values, when compared to the control group. There was a tendency to increase lipid peroxidation in beta0 CD39 mutants compared to beta+ IVS-I-110 mutants, because there is more free chains amount in beta0 thalassemia than beta+ thalassemia. In the G6PD deficiency analysis was found a lower G6PD activity in men than in women, but there was no interference of gender in the TBARS and TEAC assays results. The comparison between the control group and the G6PD deficiency group... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Problem: Die Hyperlipidämie der Ponys ist eine schwerwiegende Erkrankung, die nicht selten letal endet. Eckpunkt der Pathogenese ist die Insulinresistenz in Verbindung mit proinflammatorischen Zytokinen sowie Antioxidantien. Wenn einerseits die grundlegenden pathophysiologischen Abläufe bekannt sind, gelingt nicht immer eine erfolgreiche Therapie. Es ist auch nicht bekannt, inwieweit der Übergang von der Trächtigkeit zur Laktation ätiologische Risiken birgt. Zielstellung: Ziel dieser Studie war es zu prüfen, inwieweit bei Shetlandponystuten der Übergang von der Hochträchtigkeit über das Abfohlen zur Säugeperiode Risiken für die Hyperlipidämie birgt. Neben den Parametern des Energie-Fett-Leberstoffwechsels wurde auch analysiert, ob bei Endotoxinen und Antioxidantien (TEAC) belastende Veränderungen in diesem Zeitraum auftreten, die eine gesteigerte Fettmobilisation begünstigen. Versuchsanordnung: Es wurden 15 gesunde, gut genährte Shetlandpony-Stuten ohne Fohlen bei Fuß ca. vier bis acht Wochen nach der erfolgreichen Bedeckung, maximal 24 Stunden (h) ante partum (a. p.), maximal vier Stunden, 12-16 Stunden und drei Wochen post partum (p. p.) klinisch untersucht und Blutproben (Vena jugularis externa) entnommen. Im Blutserum wurden die Parameter Triacylglycerole (TG), Freie Fettsäuren (FFS), Cholesterol, β-Hydroxy-Butyrat (BHB), Glucose, Gesamtbilirubin, Aspartat-Amino-Transferase (ASAT), Glutamat-Dehydrogenase (GLDH), γ-Glutaminsäure-Transaminase (GGT), Alkalische Phosphatase (AP), Totalprotein (TP), Albumin, Harnstoff, Creatinin, Creatinkinase (CK), Endotoxin sowie der antioxidative Summenparameter TEAC untersucht. Ergebnisse: Trächtigkeit, Abfohlen sowie Säugeperiode verliefen bei den Stuten physiologisch. Unter den Blutbefunden waren die Hauptveränderungen bei den TG und FFS sowie bei den Endotoxinen und bei der CK 24 h a. p. zu beobachten. Die TG waren mit \"x\" ̅ = 0,18 mmol/l (0,15-0,38 mmol/l I. bis III. Quartil) 4–8 Wochen (Wo) post conceptionem (p. c.) bereits erhöht und stiegen bis 24 h a. p. auf \"x\" ̅ = 0,27 mmol/l (0,16–0,44 mmol/l) (p ≤ 0,05); ab 4 h p. p. bis 3 Wo p. p. bewegten sie sich zwischen \"x\" ̅ = 0,14 und \"x\" ̅ = 0,19 mmol/l auf gleichem Niveau. Die TG korrelierten am engsten und häufigsten mit Cholesterol (0,66), Albumin (0,58), Creatinin (0,81) und Harnstoff (-0,61), was vor allem aus deren Zusammensetzung resultiert. Die TG-Konzentrationssteigerung direkt vor dem Abfohlen ist durch den Cortisolanstieg zum Partus erklärbar. Die Mediane der FFS-Konzentrationen lagen 4-8 Wo p. c. sowie 4 h p. p. bei \"x\" ̅ = 128 µmol/l (95-197 µmol/l), sanken 24 h a. p. auf \"x\" ̅ = 75 µmol/l (64–198 µmol/l) und pegelten sich von 12–16 h bis 3 Wo p. p. bei \"x\" ̅ = 80 µmol/l (70–100 µmol/l) ein. Die FFS-Korrelationen mit Bilirubin (0,35) und Creatinin (0,35) basieren auf den pathophysiologischen Beziehungen, ohne dass damit ätiologische Bezüge ausgewiesen werden. Die Glucose-Konzentrationen waren immer im Referenzbereich. Die höchsten Konzentrationen bestanden partusbedingt 4 h (5,24 ± 1,39 mmol/l) bis 12-16 h p. p. (4,92 ± 1,67 mmol/l). Die Beziehungen der Glucose zum Energiestoffwechsel werden durch gesicherte Korrelationen zu BHB (-0,41) und der AP (-0,29) sichtbar. Beziehungen zu den FFS oder Endotoxinen sind statisitisch nicht gesichert. Die CK-Aktivitäten schwankten im Kontrollzeitraum zwischen \"x\" ̅ = 330 bis 420 U/l (300-500 U/l); 24 h a. p. lagen sie mit \"x\" ̅ = 277 U/l (197–334 U/l) als potentielle Folge der partusbedingten Cortisolsteigerung signifikant niedriger. Das Abfohlen an sich führt zu moderater CK-Aktivitätssteigerung. Die Harnstoff-Konzentrationen zeigten einen signifikanten Anstieg von 4-8 Wo p. c. mit \"x\" ̅ = 5,75 ± 1,01 mmol/l bis auf \"x\" ̅ = 6,42 ± 1,10 mmol/l 3 Wo p. p. Gesicherte Korrelationen des Harnstoffs zum BHB machen die Stoffwechselsteigerung p. p. für den Konzentrationsanstieg wahrscheinlich. Die Bilirubin-Konzentration nimmt von 12 auf 8 µmol/l im Kontrollverlauf ab, ebenso die AP-Aktivitäten von 780 auf 580 U/l und ASAT-Aktivitäten von 395 auf ca. 300 U/l. Die GGT- sowie GLDH-Aktivitäten sind zu Beginn der Untersuchungen mit 17 bzw. 6 U/l niedrig und steigen bei der letzten Kontrolle 3 Wo p. p. um ca. 50% signifikant, aber immer noch im physiologischen Bereich, an. Eine stärkere Leberbelastung lässt sich aus diesen Parametern nicht ableiten. Die Endotoxin-Konzentrationen sind p. p. am niedrigsten und an der Nachweisgrenze. Die signifikante Konzentrationssteigerung 24 h a. p. lässt an Beziehungen zu den gesteigerten TG und den erniedrigten FFS sowie der CK als Folge der ansteigenden Cortisol-Konzentration vor dem Partus denken. Gesicherte Korrelationen bestehen vor allem zu den Antioxidantien (TEAC), d. h., dass die Endotoxine den antioxidativen Status belasten. Die Cholesterol-, TP-, Albumin-, Creatinin- sowie TEAC-Konzentrationen blieben im gesamten Untersuchungszeitraum praktisch physiologisch konstant. Schlussfolgerungen: Gesunde, gut genährte Shetlandponystuten zeigen während der Trächtigkeit, dem Abfohlen und in der Säugeperiode einen stabilen Stoffwechsel. Eine stärkere Belastung wird 24 h vor dem Partus anhand der TG und Endotoxine erkennbar, die offensichtlich Folge der steigenden partusinduzierenden Cortisol-Konzentration sind.:Abkürzungen 1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT 3 2.1 Das Shetlandpony 3 2.1.1 Rassebeschreibung 3 2.1.2 Lipidstoffwechsel 4 2.1.3 Leberverfettungen 5 2.1.3.1 Hyperlipidämie der Shetlandponys 5 2.1.3.2 Mit der Hyperlipidämie vergesellschaftete Erkrankungen 8 2.1.3.3 Equines Metabolisches Syndrom/ Equines Cushing Syndrom 8 2.2 Geburtsauslösende Hormone 10 2.3 Stoffwechselparameter 11 2.3.1 Lipidstoffwechsel 11 2.3.1.1 Triacylglycerole (TG) 11 2.3.1.2 Cholesterol 12 2.3.1.3 Freie Fettsäuren (FFS) 12 2.3.1.4 β-Hydroxy-Butyrat (BHB) 13 2.3.2 Leberstoffwechsel 13 2.3.2.1 Gesamtbilirubin 13 2.3.2.2 Aspartat-Amino-Transferase (ASAT) 14 2.3.2.3 Glutamat-Dehydrogenase (GLDH) 15 2.3.2.4 γ-Glutaminsäure-Transaminase (GGT) 15 2.3.2.5 Glucose 16 2.3.2.6 Alkalische Phosphatase (AP) 17 2.3.3 Protein- und Muskelstoffwechsel 17 2.3.3.1 Totalprotein (TP) 17 2.3.3.2 Albumin 18 2.3.3.3 Harnstoff 18 2.3.3.4 Creatinin 19 2.3.3.5 Creatinkinase (CK) 19 2.4 Leukozyten 20 2.5 Endotoxine 21 2.5.1 Definition der Endotoxine 21 2.5.2 Endotoxinwirkungen 22 2.5.3 Endotoxinämie 23 2.5.4 Endotoxinschock 23 2.5.5 Neutralisation und Inaktivierung der Endotoxine 24 2.5.6 Endotoxin-bedingte Erkrankungen beim Pferd 25 2.5.6.1 Hufrehe 26 2.5.6.2 Kolik 28 2.5.6.3 Typhlocolitis 29 2.5.6.4 Fohlen-Sepsis 30 2.5.6.5 COPD 31 2.5.6.6 Kreislauf und DIC 31 2.5.7 Endotoxinbestimmung 31 2.6 Antioxidativer Status 32 2.6.1 Freie Radikale – oxidativer Stress 32 2.6.2 Antioxidantien 35 2.6.3 Antioxidative Kapazität 38 2.6.4 Bestimmung des antioxidativen Status mittels TEAC 40 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 41 3.1 Tiere 41 3.2 Probenentnahme und Aufbereitung 42 3.3 Untersuchung der Blutproben 43 3.3.1 Stoffwechselparameter 43 3.3.2 Leukozyten 43 3.3.3 Endotoxine 45 3.3.4 TEAC 46 3.4 Statistische Auswertung 49 4 ERGEBNISSE 51 4.1 Lipidstoffwechsel 51 4.1.1 Triacylglycerole (TG) 51 4.1.2 Cholesterol 53 4.1.3 Freie Fettsäuren (FFS) 54 4.1.4 β-Hydroxy-Butyrat (BHB) 55   4.2 Leberstoffwechsel 57 4.2.1 Gesamtbilirubin 57 4.2.2 Aspartat-Amino-Transferase (ASAT) 58 4.2.3 Glutamat-Dehydrogenase (GLDH) 60 4.2.4 γ-Glutaminsäure-Transaminase (GGT) 61 4.2.5 Glucose 62 4.2.6 Alkalische Phosphatase (AP) 64 4.3 Protein- und Muskelstoffwechsel 65 4.3.1 Totalprotein (TP) 65 4.3.2 Albumin 67 4.3.3 Harnstoff 68 4.3.4 Creatinin 70 4.3.5 Creatinkinase (CK) 71 4.4 Leukozyten 73 4.5 Endotoxine 74 4.6 TEAC 75 5 DISKUSSION 76 5.1 Lipidstoffwechsel 77 5.1.1 Triacylglycerole (TG) 78 5.1.2 Cholesterol 80 5.1.3 Freie Fettsäuren (FFS) 81 5.1.4 β-Hydroxy-Butyrat (BHB) 83 5.2 Leberstoffwechsel 84 5.2.1 Gesamtbilirubin 85 5.2.2 Aspartat-Amino-Transferase (ASAT) 86 5.2.3 Glutamat-Dehydrogenase (GLDH) 87 5.2.4 γ-Glutaminsäure-Transaminase (GGT) 87 5.2.5 Glucose 88 5.2.6 Alkalische Phosphatase (AP) 89 5.3 Protein- und Muskelstoffwechsel 90 5.3.1 Totalprotein (TP) 91 5.3.2 Albumin 91 5.3.3 Harnstoff 92 5.3.4 Creatinin 93 5.3.5 Creatinkinase (CK) 93   5.4 Leukozyten 94 5.5 Endotoxine 95 5.6 TEAC 96 6 ZUSAMMENFASSUNG 98 7 SUMMARY 100 8 LITERATURVERZEICHNIS 102 9 ANHANG 124 9.1 Abbildungsverzeichnis 124 9.2 Tabellenverzeichnis 126 DANKSAGUNG 127

Ce travail de thèse s'attache à identifier des plantes et/ou molécules à activités cytotoxique, antioxydante, anti-inflammatoire et antivirale ciblant le virus du chikungunya (CHIKV) dans le but de trouver des alternatives thérapeutiques vis-à-vis du stress oxydatif et de l'inflammation, mécanismes impliqués dans les maladies chroniques non transmissibles (diabète, obésité…), et de la maladie du chikungunya, maladie vectorielle réémergente. La première partie de ces travaux présente les résultats obtenus lors d'un criblage d'activités biologiques réalisé sur une sélection de dix-huit plantes endémiques et indigènes de La Réunion. Les activités ciblées ont été les activités cytotoxiques sur une lignée cellulaire humaine (cellules THP-1), les activités antioxydantes évaluées par un test in cellulo d'hémolyse et par quatre tests chimiques (TEAC/DPPH/FRAP/ORAC) ainsi qu'une évaluation de la teneur en composés phénoliques (test FOLIN) et les activités anti-inflammatoires testées sur des macrophages murins (cellules RAW-BlueTM). Les résultats obtenus ont permis de mettre, plus particulièrement, en évidence les activités de différents extraits : cytotoxique pour Carissa spinarum, antioxydantes pour Agarista buxifolia et Dryopteris wallichiana et anti-inflammatoire pour Stillingia lineata et Indigofera ammoxylum. La deuxième partie du travail est consacrée à l'étude phytochimique d'une espèce indigène de La Réunion, Stillingia lineata, choisie en raison des résultats obtenus lors de ce criblage biologique préliminaire et de ceux du programme Phytochik. Un fractionnement bioguidé par un test antiviral, réalisé sur des cellules Vero (cellules rénales de singe vert Cercopithecus aethiops) contaminées par le CHIKV, a conduit à l'isolement de trois macrocycles diterpéniques rares de type tonantzitlolone dont l'un présente une structure non caractérisée jusque-là, et d'un pimarane de structure nouvelle. La 4'-acétoxytonantzitlolone a été identifiée comme molécule candidate contre le CHIKV (CE50 = 7 μM). Des relations structure-activité ont pu être définies ; la présence d'un groupement oxygéné sur la chaîne latérale des tonantzitlolones semble jouer un rôle important sur la réponse antivirale de ces squelettes diterpéniques. / The aims of this PhD work were to identify plants and/or molecules with cytotoxic, antioxidant, anti-inflammatory or antiviral (chikungunya virus , CHIKV) activities in order to find therapeutic alternatives towards oxidative stress and inflammation, mechanisms involved in chronic noncommunicable diseases (diabetes, obesity ...), and chikungunya disease, reemerging vector-borne disease. The first part of this work presents the results obtained from a biological screening carried out on a selection of eighteen endemic and indigenous plants of La Réunion. The targeted activities were cytotoxicity on a human cell line (THP-1), antioxidant activities evaluated using an in cellulo hemolysis assay and four chemical tests (TEAC / DPPH / FRAP / ORAC) together with an evaluation of the content of phenolic compounds (FOLIN test) and anti-inflammatory activity tested in murine macrophages (RAW cells-BlueTM). The results allowed to highlight activities of different extracts in particular : cytotoxic for Carissa spinarum, antioxidant for Dryopteris wallichiana and Agarista buxifolia and anti-inflammatory for Stillingia lineata and Indigofera ammoxylum.The second part of this work is devoted to the phytochemical study of Stillingia lineata, an indigenous species of La Réunion chosen because of the results obtained in this preliminary biological screening and those carried out in Phytochik programme. Bioassay-guided fractionation performed on Vero cells (green monkey kidney cells Cercopithecus aethiops) infected with CHIKV led to the isolation of three rare macrocycle-type diterpenes called tonantzitlolone and a new pimarane. The 4'-acetoxytonantzitlolone was identified as a candidate molecule against CHIKV (EC50 = 7 μM). Structure-activity relationships have been defined, the presence of an oxygenated group on the side chain of tonantzitlolones seems to play an important role in the antiviral response of the diterpene skeleton.