O estudo de metodologias que possibilitem o acesso de moléculas terapêuticas ao cérebro evitando a barreira hematoencefálica (blood-brain barrier, BBB), é extremamente importante para o tratamento das doenças que afetam o sistema nervoso central. Os estudos se concentram na busca por vias seguras e pouco invasivas. Recentemente a via nasal tem mostrado resultados positivos na administração de fármacos ao sistema nervoso central de maneira segura, sugerindo a utilização desta via para a terapia gênica. Neste trabalho, foi estudada a administração intranasal de um vetor não viral, que codifica o gene da proteína verde fluorescente otimizada (enhanced green fluorescent proten, EGFP), diluído em água ou em solução de sulfato de zinco em camundongos adultos da linhagem BALB/c. Os resultados de RT-PCR mostraram que o vetor atingiu o cérebro em ambos tratamentos, e sua expressão foi mantida até 8 semanas após o tratamento. A expressão da EGPF em diferentes regiões cerebrais foi analisada 1, 2, 4 e 8 semanas após o tratamento, através de imunohistoquímica. Nossos resultados mostraram que um número muito pequeno de células foi transfectado em ambos tratamentos e que a freqüência destas células nas regiões cerebrais estudadas varia muito mesmo entre animais do mesmo grupo. O tratamento com sulfato de zinco não aumentou a eficiência do vetor. Os maiores números de células transfectadas encontradas foram no bulbo olfatório e hipocampos uma semana após o tratamento. Nossos resultados mostram pela primeira vez a expressão prolongada de um gene administrados pela via nasal no cérebro. / The investigation of methods that allow the access of therapeutic molecules to the brain, overcoming the blood-brain barrier (BBB), is of great importance for the treatment of diseases reaching the central nervous system. Studies concentrate mainly on the search for safer and less aggressive routes. Recent studies have suggested that pharmaceutical agents can reach the brain by the nasal route, that may thus be also appropriate for gene therapy. Here, we investigated brain targeting by intranasal administration of a plasmid vector (pREGFP) with the reporter gene EGFP, diluted in water or in a zinc sulfate/water solution, to adult BALB/c mice. Brain regions were examined by RT-PCR or immunohistochemistry 1, 2, 4 or 8 weeks after the treatment. RT-PCR results showed that the plasmid DNA reached the brain similarly with the two types of treatment. Expression of egfp was observed in all groups, and maintained even 8 weeks after treatment. Brain sections submitted to immunohistochemistry (IHC) were analyzed for the detection of EGFP-positive cells, that could be observed in brain samples from mice treated by intranasal administration of pREGFP. The frequency of EGFP-positive cells was very low, and presented great variation even among mice from the same experimental group. The supplementation of the transfection medium with zinc sulfate did not induce higher numbers of EGFP-positive cells. A higher frequency of these cells was observed in the olfactory bulb one week after treatment, and in the hippocampus as compared to other brain regions. Our results show for the first time the long-term expression of a gene carried by a nonviral vector to the central nervous system.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal, 2011. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-06-13T18:51:41Z No. of bitstreams: 1 2011_LinusQueirozPereira.pdf: 2001961 bytes, checksum: 8c777bf26af4a287663fdc2c8e5aa829 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-07-03T21:36:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_LinusQueirozPereira.pdf: 2001961 bytes, checksum: 8c777bf26af4a287663fdc2c8e5aa829 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-03T21:36:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_LinusQueirozPereira.pdf: 2001961 bytes, checksum: 8c777bf26af4a287663fdc2c8e5aa829 (MD5) / O óxido nítrico (NO) é formado pelas enzimas NO sintases e desempenha papel na patogênese da neurodegeneração. NO sintase neuronais são expressas em áreas cerebrais lesionadas e sua inibição reduz efeitos de agentes neurotóxicos. O atual estudo desenvolveu siRNAs (small interfering RNAs) direcionados a duas sequências do RNAm de nNOS, presentes nos exons 2 e 28. Primeiramente, foi utilizado o algoritmo Biopredsi para identificar alvos de RNAi. Foi realizada síntese química dos siRNA duplos com 21 nucleotídeos - exon2_hnNOS e exon28hnNOS (Qiagen). Células de neuroblastomas SH-SY5Y receberam 150 pmol ou 300 pmol de cada siRNA estruturado em lipossomas (Lipofectamine 2000®, Invitrogen). Utilizou-se o controle negativo scramble All-Stars® (Qiagen). Os meios de cultivo celular utilizados foram Optimen® e DMEM® (Gibco), pelas primeiras 6h e para as 24h de incubação restantes, respectivamente. O conteúdo de RNAm de nNOS foi quantificado por PCR em tempo real via SYBR Green®; os efeitos de silenciamento foram apresentados pela expressão relativa (2-ΔΔCT). O nível de RNAm foi reduzido para até 60% do controle; os efeitos de silenciamento variaram de acordo com os alvos e doses. Os efeitos dos siRNA sobre a apoptose por neomicina foram determinados pelo ensaio de MTT. As células foram lesionadas por neomicina e tratadas com um dos siRNAs (exon2_hnNOS, exon28hnNOS ou scramble) por dois tempos distintos: imediatamente após ou 24h após a lesão. Ambas estruturas de siRNA mostraram efeitos antiapoptóticos, que alcançaram o máximo de 28,7%. Os efeitos variaram de acordo com o siRNA e o tempo de tratamento. Exon2_hnNOS produziu o maior efeito quando o tratamento foi realizado logo após lesão; exon28_hnNOS foi mais efetivo 24h após a lesão. Os resultados do atual estudo mostram a utilidade de siRNAs no entendimento da patogenia de doenças neurológicas e abrem novos caminhos para a terapia gênica de doenças neurodegenerativas. / Nitric oxide (NO) is formed by the NO synthase enzymes and play pivotal roles in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neuronal NO synthase enzyme (nNOS) is expressed in brain areas submitted to injury, and its pharmacological blocking can decrease the effects of neurotoxic agents. In our study, we developed and tested two siRNAs targeted to two different nNOS mRNA sequences, located in the exons 2 and 28. Firstly, we used the Biopredsi algorithm to identify the RNAi targets. The synthetic siRNA duplexes with 21 nucleotides (exon2_hnNOS and exon28_hnNOS) were synthetized by Qiagen. Neuroblastoma cells SH-SY5Y received 150 pmol or 300 pmol of each siRNA mixed with Lipofectamine 2000® (Invitrogen). The negative control was the commercial scramble All-Stars® (Qiagen). The cell culture media used in this study were Optimen® and DMEM® (Gibco), for the first 6h and for the remaining 24h of incubation, respectively. The mRNA content was quantified by reverse transcription real-time PCR with SYBR Green® and the silencing effects on nNOS expressed by the relative expression (2-ΔΔCT). The nNOS mRNA content was reduced to 60% to the control level; the silencing effects varied according to the targets and doses used. To determine the effects of siRNA on the apoptotic phenotype, we used the MTT assay. Cells were lesioned by neomycin and treated with each of the siRNAs (exon2_hnNOS, exon28_hnNOS, or scramble) at two time-points: immediately after – or 24h after lesion. Both siRNA structures showed anti-apoptotic effects that reached 28.7%. The effects varied according to the siRNA used and the treatment time-point. Exon2_hnNOS produced the highest effect when the treatment began immediately after lesion; exon28_hnNOS was more effective 24h after lesion. Our results encourage the use of siRNAs to study the role of nNOS in the pathogenesis of brain diseases and highlighted a new therapeutic aproach for neurodegenerative diseases.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal, 2011. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-06-13T18:20:27Z No. of bitstreams: 1 2011_FernandoFranciscoBorgesResende.pdf: 2375537 bytes, checksum: b22c99aafd57bdf0961c5245927ef0dc (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-07-03T21:39:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_FernandoFranciscoBorgesResende.pdf: 2375537 bytes, checksum: b22c99aafd57bdf0961c5245927ef0dc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-03T21:39:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_FernandoFranciscoBorgesResende.pdf: 2375537 bytes, checksum: b22c99aafd57bdf0961c5245927ef0dc (MD5) / O objetivo do atual estudo foi avaliar os efeitos do small-interfering RNA (siRNA) e28_hnNOS sobre a expressão gênica da enzima NO sintase neuronal (nNOS) e sobre a viabilidade celular de gliomas. O glioma apresenta alta ocorrência entre os tumores cerebrais e tem o pior prognóstico. Entre os vários mediadores da tumorigênese, situa-se o óxido nítrico (NO), formado pelas enzimas NO sintases. A isoforma nNOS é expressa em tumores cerebrais, e está associada ao seu grau de malignidade. No presente estudo foi desenvolvido o siRNA e28_hnNOS para interferência de RNA sobre sequência-alvo do RNAm de nNOS, codificada pelo exon 28. Células de glioma U-251MG, cultivadas em triplicatas, foram transfectadas com este siRNA de 21 nucleotídeos (37,5nM) estruturado em lipossomas catiônicos, para análise nos tempos de 4, 24 e 48 horas pós-transfecção, havendo o controle negativo scramble. O conteúdo de RNAm de nNOS foi quantificado por RT-qPCR e os resultados expressos pelo método de 2-ΔΔCT. O siRNA e28_hnNOS alterou o conteúdo de nNOS, com expressão de 0,61 vezes em relação ao controle negativo scramble no tempo 24hs e, surpreendentemente, aumento de 1,4 vezes no tempo 48hs. O efeito do siRNA e28_hnNOS sobre a viabilidade celular foi determinado pelo ensaio de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina). Células foram lesadas com neomicina (300 μg/ml) por 24 horas e transfectadas com o siRNA (37,5nM) por 4 horas, havendo grupo controle não lesado. O uso do siRNA e28_hnNOS combinado com a neomicina reduziu a viabilidade celular para 96,36%. Os resultados do presente estudo mostram que a interferência de RNA via siRNAs pode controlar a expressão gênica de nNOS em gliomas e revelam o potencial uso deste método, em associação com a neomicina, para obtenção de efeitos antiproliferativos. _________________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The aim of the present study was to test effects of the siRNA e28_hnNOS on neuronal nitric oxide synthase enzyme (nNOS) content and cell viability of glioma cells in culture. Glioma is an aggressive cerebral tumor that holds a very poor prognosis. Nitric oxide synthase enzymes and their respective product - nitric oxide (NO) have a role in cancer development and metastasis. In our study, we tested the siRNA e28_hnNOS, which targets to nNOS mRNA sequence coded by exon 28. For that, glioma cells U-251MG in culture were transfected with e28_hnNOS (37,5 nM) mixed with cationic liposomes. They were tested at the time-points 4, 24, and 48 hours. The negative control was the commercial scramble All-Stars™ (Qiagen™). The nNOS mRNA content was quantified by RT-qPCR and the results were expressed by the method 2-ΔΔCT. The nNOS content was reduced to 0.61 fold to the scramble negative control value at 24 h. Surprisingly, we found a 1.4 fold increase at 48 h post-transfection. The siRNA effects on cell viability were determined by MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina) assay. Cells were previously lesioned with neomycin (300 μg/ml) for 24 h and then treated with e28_hnNOS for 4 hour. Non-lesioned and scrambled control groups were included. The use of siRNA e28_hnNOS in combination with neomycin reduced the cell viability to 96.36%. In conclusion, our results show the ability of siRNAs to change the nNOS mRNA content in glioma cells in culture and reveal the potential use of RNA interference in combination with neomycin for antiproliferative effects.

Orientador: Marcio José Tiera / Banca: Sergio Paulo Campana Filho / Banca: Sang Won Han / Banca: Eloi da Silva Feitosa / Banca: Marinônio Lopes Cornélio / Resumo: Uma possível estratégia para aumentar a eficiência de transfecção gênica da quitosana como vetor não viral é a modificação desse policátion com adição de grupos hidrofílicos, sensíveis ao pH e seletivos quanto às células alvo, sem interferir nas propriedades biológicas da quitosana, como biodegradabilidade e baixa toxicidade. Nesse tema, a presente tese teve como objetivo a modificação da estrutura da quitosana com grupos fosforilcolina (PC), dietilaminoetila (DEAE) e o ligante folato (FA). Derivados de quitosana com diferentes proporções de grupos PC e DEAE foram sintetizados e caracterizados utilizando-se RMN de 1H, titulação condutimétrica, Cromatografia de permeação em gel e espectroscopia UV-vis. Os derivados foram utilizados para a preparação de poliplexos com o plasmídeo VR1412 e com o RNA de interferência siRNA-SSB. Esses poliplexos preparados foram caracterizados por espalhamento de luz dinâmico, obtendo-se nanopartículas (NPs) cujos diâmetros variaram de 100 nm a 700 nm, e com valores de potencial zeta de -25 mV a +22 mV, dependentes dos graus de substituição de PC e DEAE. A estabilidade das partículas e a integridade do plasmídeo foram verificadas a partir de eletroforese em gel de agarose, observando-se maior estabilidade para maiores razões N/P (N = grupos amina do policátion; P = grupos fosfato do pDNA ou siRNA), e para os polímeros de maior massa molecular e substituídos com o grupo DEAE. Células HeLa foram utilizadas para analisar a citotoxicidade dos poliplexos e polímeros, bem como a eficiência de transfeção. Os resultados mostraram que a citotoxicidade dos derivados aumenta com o grau de substituição por DEAE. Entretanto, a composição pode ser controlada e todos os derivados foram menos tóxicos que o lipídeo comercial lipofetamina, lipídeo geralmente utilizado para transferência gênica. A eficiência de transfecção foi altamente intensificada com as modificações ... / Abstract: One possible strategy to improve the efficiency of chitosan as a non viral vector is the modification on the polycation with the additions of hydrophilic, pH-sensitive and selective groups for the target cells, without interfering with the biological properties of chitosan, such as biodegradability and low toxicity. On this matter, the present thesis aimed the modification on the structure of chitosan, with phosphorylcholine (PC), diethylaminoethyl (DEAE) and the ligand folate (FA). Chitosan derivatives with different proportions of PC and DEAE groups were synthesized and characterized using 1H-NMR, conductimetric titration, gel permeation chromatography and UV-vis spectroscopy. The derivatives were used to prepare polyplexes with plasmid VR1412 and small interference RNA, siRNA-SSB. The particles were characterized by dynamic light scattering, resulting in nanoparticles with diameters ranging from 100 nm to 700 nm, and the zeta potential values from -25 mV to +22 mV dependent on the degree of substitution of PC and DEAE. The colloidal stability of these particles and integrity of the plasmid were verified with agarose gel electrophoresis, observing improved stability with higher N/P ratio (N = amine groups from polycation / P = phosphate groups from pDNA or siRNA), molecular weight of polymers and substitution of DEAE group. HeLa cells were used to analyze the cytotoxicity of polyplexes and polymers, as well as the transfection efficiency. The results showed that the cytotoxicity of the derivatives increases with the degree of substitution of DEAE. However, the composition can be controlled, and all the derivatives were less toxic than lipofectamine, a general commercial lipid used for gene transfer. Transfection efficiency was highly enhanced with the modifications, arrising to eight times more efficient than unmodified deacetylated chitosan and very close to the results observed for lipofectamine. The results evidenced that changes on ... / Doutor

Orientador: Marcio José Tiera / Banca: Mário Sergio Galhiane / Banca: Elói da Silva Feitosa / Resumo: O presente estudo teve como objetivo principal a síntese e caracterização de derivados hemocompatíveis de quitosana e sua utilização na preparação de nanopartículas para terapia gênica não-viral. O trabalho foi realizado em duas etapas, sendo a primeira a obtenção dos derivados, seguido de estudos da interação com o plasmídeo VR 1412 (pDNA) que expressa a β-galactosidase. A primeira etapa de síntese envolve a modificação de quitosana pela introdução de grupos amino, seguido pela ligação de cadeias de polietilenoglicol (PEG). Os derivados foram caracterizados por espectrometria de ressonância magnética nuclear de hidrogênio, potenciometria e viscosidade. Os estudos da interação foram realizados utilizando as técnicas de fluorescência, eletroforese em gel de agarose, espalhamento de luz dinâmica e citotoxicidade. O trabalho foi conduzido de forma comparativa, avaliando as mudanças estruturais e seus efeitos na força de interação e estabilidade das nanopartículas / Abstract: The current study aimed at the synthesis and characterization of hemocompatible chitosan derivatives and their use in the preparation of nanoparticles for non-viral gene therapy. The project was carried out in two steps, first the synthesis and characterization of the derivatives, followed by studies of the interaction between the chitosan derivatives and the VR1412 plasmid (pDNA), that expresses the β-galactosidase protein. The first step of synthesis was the modification of chitosan by introducing tertiary amino groups, followed by attaching the polyethyleneglycol (PEG) to the chitosan backbone. The study of the interaction between the chitosan derivatives and the pDNA was carried out using the fluorescence, electrophoresis in agarose gel, and light scattering techniques. The study was performed in order to evaluate the effect of structural changes of the chitosan backbone on the strength of interaction and stability of the nanoparticles / Mestre

Os laboratórios de pesquisa científica acadêmica na área da saúde são ambientes nos quais os estudantes vivenciam processos educacionais. A sistematização em estudos científicos dos conhecimentos relacionados a estes processos requer pesquisas que enfoquem os alunos, o que não é comum neste tipo de ambiente, onde o estudo dos objetos é predominante. Em conseqüência, as publicações científicas dos laboratórios de pesquisa científica acadêmica na área da saúde limitam-se majoritariamente aos experimentos, indicando que os conhecimentos produzidos pelos processos educacionais que ocorrem nestes laboratórios não estão sendo cientificamente sistematizados e compartilhados com os pares. A presente tese parte da pesquisa científica em terapia gênica para Gangliosidose GM1 em busca do enfoque no aluno para estudar os processos educacionais que ocorrem em um laboratório de pesquisa científica acadêmica na área da saúde. Seu objetivo é articular a relação entre sujeito que pesquisa e objeto pesquisado, problematizando, com base no referencial teórico de complexidade de Edgar Morin, a pesquisa qualitativa com enfoque em educação em ciências no Centro de Terapia Gênica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Duas histórias em quadrinhos seqüenciais foram elaboradas para retratar protocolos de procedimentos científicos e implementadas em associação aos respectivos protocolos no processo de aprendizado destes procedimentos. A análise das entrevistas com os estudantes que participaram deste processo demonstram que as histórias em quadrinhos estimulam a memória e promovem a compreensão das relações entre os passos dos protocolos. As reflexões espontâneas destes estudantes sobre o aprender a fazer ciência e o método científico durante as entrevistas resultaram em um estudo subseqüente, no qual os estudantes foram entrevistados sobre a sua compreensão do método científico. As respostas refletem o fazer ciência dos entrevistados no laboratório, que se dá pela realização de projetos, constituindo uma compreensão reduzida sobre o método científico ao excluir o pensamento científico. O desconhecimento de autores relacionados à ciência em geral, que indica o desconhecimento das suas obras, as dificuldades em compreender atividades e questões que têm enfoque no sujeito e seus processos e o emprego estrito da objetividade para tratar de questões subjetivas refletem a não articulação entre objeto e sujeito e a separação das ciências. Atividades educativas de retorno foram realizadas para trabalhar os resultados com os entrevistados. / Health field academic science research laboratories are environments in which students experience educational processes. Scientific systematization of knowledge related to such processes requires research focusing the students, which are not common in this type of environment, where the study of objects major. Consequently, scientific publications from health field academic science research laboratories are mainly limited to objective bench experiments, indicating that the knowledge related to the educational processes that take place in these labs is not being scientifically systemized and shared with peers. The present thesis uses scientific research on gene therapy for GM1 Gangliosidosis in order to focus subjects and study the educational processes in a health field academic science research lab. The aim is to articulate the relationship between research subjects and objects, thereby developing, in regard to Edgar Morin’s complexity theoretical reference, qualitative research focusing science education at Centro de Terapia Gênica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Two sequential cartoon stories that portrait scientific protocols were created and implemented in association to such protocols on the learning processes of related procedures. Analysis of participating students’ interviews demonstrated that cartoons stimulate memory and improve comprehension of relationship between protocols’ steps. Students’ reflections on science learning and scientific method resulted in a subsequent study, in which students were interviewed about their comprehension on the scientific method. Answers reflect their laboratory science making, which is resumed to scientific projects’ execution, leading to a reduced comprehension of the scientific method as scientific thinking is excluded. Lack of knowledge about science related authors in general, which indicates lack of knowledge of these author’ works, difficulties on comprehending activities that focus on subjects and their learning process, and strict use of objectivity in order to deal with subjectivity issues reflect the lack of articulation between object and subject and the separation of science in distinct fields. Feedback educational activities were created and implemented to work the results with interviewed students.

O presente trabalho teve como objetivo estudar a patogênese das mucopolissacaridoses (MPS), em especial em órgãos de difícil correção pelas terapias atualmente disponíveis, bem como desenvolver novos tratamentos para estas doenças. Nossos estudos em camundongos MPS I e VII evidenciaram um aumento na atividade de proteases, incluindo catepsinas e metaloproteases, que podem contribuir para a patogênese da doença na aorta, articulações e cérebro. Ainda nestes órgãos, foi observada a ativação de vias inflamatórias, como o sitema complemento e a via dos receptores toll like, bem como um processo neuroinflamatório, e também podem ter papel fundamental no aparecimento das anormalidades. Dois protocolos de terapia gênica foram testados e, enquanto a microencapsulação celular atingiu apenas uma correção transitória in vivo (possivelmente por uma formação de fibrose pericapsular), o uso de um vetor retroviral levou a níveis séricos de alfa-L-iduronidase (IDUA) superiores aos níveis normais, com correção da doença no sistema nervoso central. Por fim, o uso da terapia de reposição enzimática desde o nascimento demonstrou uma melhora nas vísceras, especialmente aorta e válvulas cardíacas, e uma redução na formação de anticorpos contra a enzima. De forma surpreendente, a enzima foi detectada no cérebro dos animais, sugerindo que a mesma atravessa a barreira-hemato-encefálica. Nossos dados em conjunto sugerem a participação de vias inflamatórias e proteases na patogênese das MPS, e enquanto o tratamento com as microcapsulas ainda apresenta limitações, a terapia gênica com o retrovírus e a terapia de reposição enzimática desde o nascimento se mostram como alternativas viáveis e promissoras. / In this work we aimed to study the pathogenesis of mucopolysaccharidosis (MPS), especially organs that have been described as difficult-to-reach by current therapies. We also aimed to evaluate new therapies for these diseases. Our studies focused on MPS I and VII mice showed an increase in the activity of proteases, including cathepsins and metallopeptidases, that can contribute to the disease pathogenesis in the aorta, joints and brain. In the same organs, we observed activation of inflammatory pathways, including the complement system, the toll-like recetor pathway and a neuroinflammatory process, who can also contribute to the abnormalities observed. Two gene terapy protocols were tested and, while the cell encapsulation only achieved transient correction in vivo (possibly due to a pericapsular fibrosis), the use of a retroviral gene vector reached supernormal serum IDUA levels and correction of brain abnormalities. Finally the use of enzyme replacement therapy from birth showed improvements in visceral organs, specially the aorta and heart valves, and a reduction in the levels of serum anti-IDUA antibodies. Surprisingly, the enzyme could be detected in the brain, suggesting that a fraction crosses the blood-brain-barier. Our data altogether suggest the participation of inflammatory pathways and proteases in the pathogenesis of MPS, and although the treatment with microcapsules still presents limitations, retroviral gene therapy and enzyme replacement therapy started from birth are promising treatment alternatives.

O presente trabalho teve como objetivo estudar a patogênese das mucopolissacaridoses (MPS), em especial em órgãos de difícil correção pelas terapias atualmente disponíveis, bem como desenvolver novos tratamentos para estas doenças. Nossos estudos em camundongos MPS I e VII evidenciaram um aumento na atividade de proteases, incluindo catepsinas e metaloproteases, que podem contribuir para a patogênese da doença na aorta, articulações e cérebro. Ainda nestes órgãos, foi observada a ativação de vias inflamatórias, como o sitema complemento e a via dos receptores toll like, bem como um processo neuroinflamatório, e também podem ter papel fundamental no aparecimento das anormalidades. Dois protocolos de terapia gênica foram testados e, enquanto a microencapsulação celular atingiu apenas uma correção transitória in vivo (possivelmente por uma formação de fibrose pericapsular), o uso de um vetor retroviral levou a níveis séricos de alfa-L-iduronidase (IDUA) superiores aos níveis normais, com correção da doença no sistema nervoso central. Por fim, o uso da terapia de reposição enzimática desde o nascimento demonstrou uma melhora nas vísceras, especialmente aorta e válvulas cardíacas, e uma redução na formação de anticorpos contra a enzima. De forma surpreendente, a enzima foi detectada no cérebro dos animais, sugerindo que a mesma atravessa a barreira-hemato-encefálica. Nossos dados em conjunto sugerem a participação de vias inflamatórias e proteases na patogênese das MPS, e enquanto o tratamento com as microcapsulas ainda apresenta limitações, a terapia gênica com o retrovírus e a terapia de reposição enzimática desde o nascimento se mostram como alternativas viáveis e promissoras. / In this work we aimed to study the pathogenesis of mucopolysaccharidosis (MPS), especially organs that have been described as difficult-to-reach by current therapies. We also aimed to evaluate new therapies for these diseases. Our studies focused on MPS I and VII mice showed an increase in the activity of proteases, including cathepsins and metallopeptidases, that can contribute to the disease pathogenesis in the aorta, joints and brain. In the same organs, we observed activation of inflammatory pathways, including the complement system, the toll-like recetor pathway and a neuroinflammatory process, who can also contribute to the abnormalities observed. Two gene terapy protocols were tested and, while the cell encapsulation only achieved transient correction in vivo (possibly due to a pericapsular fibrosis), the use of a retroviral gene vector reached supernormal serum IDUA levels and correction of brain abnormalities. Finally the use of enzyme replacement therapy from birth showed improvements in visceral organs, specially the aorta and heart valves, and a reduction in the levels of serum anti-IDUA antibodies. Surprisingly, the enzyme could be detected in the brain, suggesting that a fraction crosses the blood-brain-barier. Our data altogether suggest the participation of inflammatory pathways and proteases in the pathogenesis of MPS, and although the treatment with microcapsules still presents limitations, retroviral gene therapy and enzyme replacement therapy started from birth are promising treatment alternatives.

O estudo de metodologias que possibilitem o acesso de moléculas terapêuticas ao cérebro evitando a barreira hematoencefálica (blood-brain barrier, BBB), é extremamente importante para o tratamento das doenças que afetam o sistema nervoso central. Os estudos se concentram na busca por vias seguras e pouco invasivas. Recentemente a via nasal tem mostrado resultados positivos na administração de fármacos ao sistema nervoso central de maneira segura, sugerindo a utilização desta via para a terapia gênica. Neste trabalho, foi estudada a administração intranasal de um vetor não viral, que codifica o gene da proteína verde fluorescente otimizada (enhanced green fluorescent proten, EGFP), diluído em água ou em solução de sulfato de zinco em camundongos adultos da linhagem BALB/c. Os resultados de RT-PCR mostraram que o vetor atingiu o cérebro em ambos tratamentos, e sua expressão foi mantida até 8 semanas após o tratamento. A expressão da EGPF em diferentes regiões cerebrais foi analisada 1, 2, 4 e 8 semanas após o tratamento, através de imunohistoquímica. Nossos resultados mostraram que um número muito pequeno de células foi transfectado em ambos tratamentos e que a freqüência destas células nas regiões cerebrais estudadas varia muito mesmo entre animais do mesmo grupo. O tratamento com sulfato de zinco não aumentou a eficiência do vetor. Os maiores números de células transfectadas encontradas foram no bulbo olfatório e hipocampos uma semana após o tratamento. Nossos resultados mostram pela primeira vez a expressão prolongada de um gene administrados pela via nasal no cérebro. / The investigation of methods that allow the access of therapeutic molecules to the brain, overcoming the blood-brain barrier (BBB), is of great importance for the treatment of diseases reaching the central nervous system. Studies concentrate mainly on the search for safer and less aggressive routes. Recent studies have suggested that pharmaceutical agents can reach the brain by the nasal route, that may thus be also appropriate for gene therapy. Here, we investigated brain targeting by intranasal administration of a plasmid vector (pREGFP) with the reporter gene EGFP, diluted in water or in a zinc sulfate/water solution, to adult BALB/c mice. Brain regions were examined by RT-PCR or immunohistochemistry 1, 2, 4 or 8 weeks after the treatment. RT-PCR results showed that the plasmid DNA reached the brain similarly with the two types of treatment. Expression of egfp was observed in all groups, and maintained even 8 weeks after treatment. Brain sections submitted to immunohistochemistry (IHC) were analyzed for the detection of EGFP-positive cells, that could be observed in brain samples from mice treated by intranasal administration of pREGFP. The frequency of EGFP-positive cells was very low, and presented great variation even among mice from the same experimental group. The supplementation of the transfection medium with zinc sulfate did not induce higher numbers of EGFP-positive cells. A higher frequency of these cells was observed in the olfactory bulb one week after treatment, and in the hippocampus as compared to other brain regions. Our results show for the first time the long-term expression of a gene carried by a nonviral vector to the central nervous system.

Apesar da aparente acessibilidade, a pele é bem protegida contra a absorção de materiais estranhos. Esta função barreira é exercida principalmente pelo estrato córneo. Dessa forma, a administração cutânea de fármacos precisa transpor esta barreira para atingir uma concentração efetiva. Uma maneira de tornar o tratamento eficaz é o uso de injeções, forma de administração muito invasiva e desconfortável para o paciente. A administração tópica é uma forma simples e confortável para a administração cutânea de fármacos. As doenças cutâneas, em geral, são doenças estigmatizadas. Assim, o desenvolvimento de uma formulação capaz de transpor as barreiras impostas a esta via de administração e um novo tratamento para estas doenças complexas, com componentes genéticos, devem ser estudados. O siRNA veiculado com nanocarreadores foi aplicado a esta via de administração. O nanocarreador possibilita um maior tempo de permanência na superfície da pele devido às propriedades adesivas, além de proteger o siRNA contra a degradação. O siRNA visa o bloqueio específico da expressão de genes, por isso é capaz de agir em diferentes caminhos de uma doença. A maior limitação para o uso de siRNA é a incapacidade de difundir-se através das membranas celulares devido a carga negativa, o que gera uma repulsão eletrostática da membrana celular. Portanto, a complexação com um carreador torna a liberação do siRNA no interior celular mais efetiva. É amplamente aceito que o desenvolvimento de um sistema de liberação eficiente é um dos principais obstáculos para transformar siRNA em terapêutica. Consequentemente, o objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento farmacotécnico de um nanocarreador capaz de liberar o siRNA de maneira efetiva na aplicação tópica cutânea, respeitando as peculiaridades desta via. As formulações de monoleína (MO), polietilenoimina (PEI) e diferentes concentrações de vitamina E TPGS, contendo ou não ácido oléico (AO), foram caracterizadas como fases líquido cristalinas com tamanho de partícula e potencial zeta desejado, mostrando-se eficazes em complexar o siRNA. As nanodispersões desenvolvidas foram efetivas na complexação do siRNA, na estabilização deste ácido nucléico frente a degradação enzimática, e na efetiva internalização celular in vitro em células de fibroblastos de camundongos L929. As nanodispersões contendo maior quantidade de vitamina E TPGS, ou contendo o AO foram as formulações que promoveram um maior aumento da penetração cutânea de siRNA in vitro em peles de modelo animal. Logo, os resultados obtidos permitiram concluir que as formulações desenvolvidas são sistemas de liberação nanotecnológicos, contendo cristais líquidos, promissores para a administração tópica de siRNA, no tratamento de patologias cutâneas na terapia gênica / Despite its apparent easy accessibility, the skin is, in fact, well protected against the absorption of foreing materials. The barrier function is imposed, mainly, by the stratum corneum. Thus, the cutaneous administration of drugs needs to overcome this barrier to reach an effective concentration. One way to make an effective treatment is the use of injections, mode of administration very invasive and uncomfortable for the patient. Topical administration is simple and comfortable for cutaneous administration of drugs. Skin diseases, in general, are stigmatized diseases. Therefore, the development of a formulation capable of overcoming the barriers of this route of administration and a new treatment for these complex diseases, with the genetic components, shall be studied. The siRNA in nanocarriers has been applied to this route of administration. The nanocarrier allows siRNA to stay longer on the skin surface because of its adhesive properties, while also protects siRNA against degradation. The siRNA is directed for producing gene-specific inhibition, so it is able to act in different ways to the same disease. The most critical factor limiting the use of siRNA as therapeutics is delivering siRNA to its intracellular target site due to their negative charge, which cause an electrostatic repulsion of the cell membrane. Therefore, complexation with a carrier makes the release of siRNA inside the cells more effective. It is widely accepted that the development of an efficient delivery system is a major obstacle to change siRNA into therapeutics. Consequently, the objective of this work was the pharmacotechnical development of a nanocarrier capable of releasing the siRNA effectively in topical skin, respecting the peculiarities of this pathway. The formulations of monoolein (MO), polyethylenimine (PEI) and different concentrations of vitamin E TPGS, with or without oleic acid (OA), were characterized as liquid crystalline phases with particles size and zeta potential desired, proving to be effective in complexing the siRNA. The nanodispersions developed were effective for the complexation of siRNA, for the stabilization of nucleic acid against enzymatic degradation, and for the effective in vitro cellular uptake into cells of mouse fibroblast L929. The nanodispersions containing higher amounts of vitamin E TPGS, or containing OA, have been the formulations which promoted a greater increase in skin penetration of siRNA in vitro in animal model skin. Therefore, the results obtained allowed one to conclude that the formulations developed are delivery systems based on nanotechnology, with liquid crystalline phase, promising for topical administration of siRNA, for the treatment of cutaneous diseases in gene therapy