Os laboratórios de pesquisa científica acadêmica na área da saúde são ambientes nos quais os estudantes vivenciam processos educacionais. A sistematização em estudos científicos dos conhecimentos relacionados a estes processos requer pesquisas que enfoquem os alunos, o que não é comum neste tipo de ambiente, onde o estudo dos objetos é predominante. Em conseqüência, as publicações científicas dos laboratórios de pesquisa científica acadêmica na área da saúde limitam-se majoritariamente aos experimentos, indicando que os conhecimentos produzidos pelos processos educacionais que ocorrem nestes laboratórios não estão sendo cientificamente sistematizados e compartilhados com os pares. A presente tese parte da pesquisa científica em terapia gênica para Gangliosidose GM1 em busca do enfoque no aluno para estudar os processos educacionais que ocorrem em um laboratório de pesquisa científica acadêmica na área da saúde. Seu objetivo é articular a relação entre sujeito que pesquisa e objeto pesquisado, problematizando, com base no referencial teórico de complexidade de Edgar Morin, a pesquisa qualitativa com enfoque em educação em ciências no Centro de Terapia Gênica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Duas histórias em quadrinhos seqüenciais foram elaboradas para retratar protocolos de procedimentos científicos e implementadas em associação aos respectivos protocolos no processo de aprendizado destes procedimentos. A análise das entrevistas com os estudantes que participaram deste processo demonstram que as histórias em quadrinhos estimulam a memória e promovem a compreensão das relações entre os passos dos protocolos. As reflexões espontâneas destes estudantes sobre o aprender a fazer ciência e o método científico durante as entrevistas resultaram em um estudo subseqüente, no qual os estudantes foram entrevistados sobre a sua compreensão do método científico. As respostas refletem o fazer ciência dos entrevistados no laboratório, que se dá pela realização de projetos, constituindo uma compreensão reduzida sobre o método científico ao excluir o pensamento científico. O desconhecimento de autores relacionados à ciência em geral, que indica o desconhecimento das suas obras, as dificuldades em compreender atividades e questões que têm enfoque no sujeito e seus processos e o emprego estrito da objetividade para tratar de questões subjetivas refletem a não articulação entre objeto e sujeito e a separação das ciências. Atividades educativas de retorno foram realizadas para trabalhar os resultados com os entrevistados. / Health field academic science research laboratories are environments in which students experience educational processes. Scientific systematization of knowledge related to such processes requires research focusing the students, which are not common in this type of environment, where the study of objects major. Consequently, scientific publications from health field academic science research laboratories are mainly limited to objective bench experiments, indicating that the knowledge related to the educational processes that take place in these labs is not being scientifically systemized and shared with peers. The present thesis uses scientific research on gene therapy for GM1 Gangliosidosis in order to focus subjects and study the educational processes in a health field academic science research lab. The aim is to articulate the relationship between research subjects and objects, thereby developing, in regard to Edgar Morin’s complexity theoretical reference, qualitative research focusing science education at Centro de Terapia Gênica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Two sequential cartoon stories that portrait scientific protocols were created and implemented in association to such protocols on the learning processes of related procedures. Analysis of participating students’ interviews demonstrated that cartoons stimulate memory and improve comprehension of relationship between protocols’ steps. Students’ reflections on science learning and scientific method resulted in a subsequent study, in which students were interviewed about their comprehension on the scientific method. Answers reflect their laboratory science making, which is resumed to scientific projects’ execution, leading to a reduced comprehension of the scientific method as scientific thinking is excluded. Lack of knowledge about science related authors in general, which indicates lack of knowledge of these author’ works, difficulties on comprehending activities that focus on subjects and their learning process, and strict use of objectivity in order to deal with subjectivity issues reflect the lack of articulation between object and subject and the separation of science in distinct fields. Feedback educational activities were created and implemented to work the results with interviewed students.

A Mucopolisacaridose tipo I é uma doença lisosomal caracterizada pela deficiência de a-L-iduronidase (IDUA), que é responsável pela degradação de glicosaminoglicanos (GAGs). Esta deficiência leva ao acúmulo de dermatan e heparan sulfato nos lisossomos. Atualmente, os tratamentos disponíveis envolvem transplante de medula óssea e terapias de reposição enzimática que são limitadas em seus efeitos. Neste trabalho, camundongos nocaute (KO) para o gene IDUA (gentilmente fornecidos pela Dr. Elizabeth Neufeld, UCLA) foram tratados com um vetor nonviral contendo cDNA IDUA humano (pRIDUA). Os camundongos KO foram transfectados através de injeção hidrodinâmica pRIDUA na veia caudal (iv, n = 3) ou por injeção intraperitoneal de complexos pRIDUA/Superfect (ip, n = 3). A acumulação de GAGs foi medida nos rins, baço, pulmões, cérebro e fígado; atividade de IDUA foi analisada nos órgãos. A expressão de IDUA também foi analisada nos órgãos por RT-PCR. A concentração de GAGs nos órgãos foi diferente entre KO e camundongos normais. No baço, níveis de GAGs foram significativamente mais baixos em camundongos KO tratados iv comparando com o grupo KO sem tratamento. O RT-PCR mostrou amplificação do cDNA IDUA em todos órgãos dos camundongos KO ambos tratados por iv ou ip. Os resultados mostram atividade da enzima nos mesmos órgãos analisados (principalmente no baço, cérebro e pulmão). Estes dados sugerem que o transgene é expresso nos órgãos dos camundongos KO tratados ip ou iv com pRIDUA. Este tipo de transfecção pode ser uma ferramenta útil para protocolos não-virais de terapia de gene de MPS. / Mucopolysaccharidosis I is a lysosomal disorder characterized by deficiency of a-L-iduronidase (IDUA), which is responsible for the degradation of glycosaminoglycans (GAGs). This deficiency leads to accumulation of dermatan and heparan sulphate on lysosomes. Presently, available treatments involve bone marrow transplantation and enzyme replacement therapies which are however limited in their effects. In this work, knockout (KO) MPS I mice (gently provided by Dr Elizabeth Neufeld, UCLA) were treated with a nonviral vector with the human IDUA cDNA. KO mice were transfected with by hydrodynamic injection of pRIDUA in the caudal vein (iv, n = 3) or by intraperitoneal injection of pRIDUA/Superfect complexes (ip, n = 3). GAG accumulation was measured in the kidneys, spleen, lungs, brain and liver; IDUA activity was analyzed in the organs. The expression of IDUA was also analyzed in the organs by RT-PCR. The concentration of GAGs in the organs was different between KO and normal mice. In the spleen, however, GAGs levels were significantly lower in KO mice treated iv with pRIDUA than in control KO. RT-PCR showed amplification of IDUA cDNA in all organs of the KO mice both treated by iv and ip. The results show enzyme activity in the same the organs analyzed (specially in spleen, brain and lung). These data suggest that the transgene is expressed in the organs of KO mice treated ip or iv with pRIDUA. This kind of transfection may be a useful tool for non-viral protocols of gene therapy of MPS.

A Mucopolisacaridose tipo I é uma doença lisosomal caracterizada pela deficiência de a-L-iduronidase (IDUA), que é responsável pela degradação de glicosaminoglicanos (GAGs). Esta deficiência leva ao acúmulo de dermatan e heparan sulfato nos lisossomos. Atualmente, os tratamentos disponíveis envolvem transplante de medula óssea e terapias de reposição enzimática que são limitadas em seus efeitos. Neste trabalho, camundongos nocaute (KO) para o gene IDUA (gentilmente fornecidos pela Dr. Elizabeth Neufeld, UCLA) foram tratados com um vetor nonviral contendo cDNA IDUA humano (pRIDUA). Os camundongos KO foram transfectados através de injeção hidrodinâmica pRIDUA na veia caudal (iv, n = 3) ou por injeção intraperitoneal de complexos pRIDUA/Superfect (ip, n = 3). A acumulação de GAGs foi medida nos rins, baço, pulmões, cérebro e fígado; atividade de IDUA foi analisada nos órgãos. A expressão de IDUA também foi analisada nos órgãos por RT-PCR. A concentração de GAGs nos órgãos foi diferente entre KO e camundongos normais. No baço, níveis de GAGs foram significativamente mais baixos em camundongos KO tratados iv comparando com o grupo KO sem tratamento. O RT-PCR mostrou amplificação do cDNA IDUA em todos órgãos dos camundongos KO ambos tratados por iv ou ip. Os resultados mostram atividade da enzima nos mesmos órgãos analisados (principalmente no baço, cérebro e pulmão). Estes dados sugerem que o transgene é expresso nos órgãos dos camundongos KO tratados ip ou iv com pRIDUA. Este tipo de transfecção pode ser uma ferramenta útil para protocolos não-virais de terapia de gene de MPS. / Mucopolysaccharidosis I is a lysosomal disorder characterized by deficiency of a-L-iduronidase (IDUA), which is responsible for the degradation of glycosaminoglycans (GAGs). This deficiency leads to accumulation of dermatan and heparan sulphate on lysosomes. Presently, available treatments involve bone marrow transplantation and enzyme replacement therapies which are however limited in their effects. In this work, knockout (KO) MPS I mice (gently provided by Dr Elizabeth Neufeld, UCLA) were treated with a nonviral vector with the human IDUA cDNA. KO mice were transfected with by hydrodynamic injection of pRIDUA in the caudal vein (iv, n = 3) or by intraperitoneal injection of pRIDUA/Superfect complexes (ip, n = 3). GAG accumulation was measured in the kidneys, spleen, lungs, brain and liver; IDUA activity was analyzed in the organs. The expression of IDUA was also analyzed in the organs by RT-PCR. The concentration of GAGs in the organs was different between KO and normal mice. In the spleen, however, GAGs levels were significantly lower in KO mice treated iv with pRIDUA than in control KO. RT-PCR showed amplification of IDUA cDNA in all organs of the KO mice both treated by iv and ip. The results show enzyme activity in the same the organs analyzed (specially in spleen, brain and lung). These data suggest that the transgene is expressed in the organs of KO mice treated ip or iv with pRIDUA. This kind of transfection may be a useful tool for non-viral protocols of gene therapy of MPS.

O presente trabalho teve como objetivo estudar a patogênese das mucopolissacaridoses (MPS), em especial em órgãos de difícil correção pelas terapias atualmente disponíveis, bem como desenvolver novos tratamentos para estas doenças. Nossos estudos em camundongos MPS I e VII evidenciaram um aumento na atividade de proteases, incluindo catepsinas e metaloproteases, que podem contribuir para a patogênese da doença na aorta, articulações e cérebro. Ainda nestes órgãos, foi observada a ativação de vias inflamatórias, como o sitema complemento e a via dos receptores toll like, bem como um processo neuroinflamatório, e também podem ter papel fundamental no aparecimento das anormalidades. Dois protocolos de terapia gênica foram testados e, enquanto a microencapsulação celular atingiu apenas uma correção transitória in vivo (possivelmente por uma formação de fibrose pericapsular), o uso de um vetor retroviral levou a níveis séricos de alfa-L-iduronidase (IDUA) superiores aos níveis normais, com correção da doença no sistema nervoso central. Por fim, o uso da terapia de reposição enzimática desde o nascimento demonstrou uma melhora nas vísceras, especialmente aorta e válvulas cardíacas, e uma redução na formação de anticorpos contra a enzima. De forma surpreendente, a enzima foi detectada no cérebro dos animais, sugerindo que a mesma atravessa a barreira-hemato-encefálica. Nossos dados em conjunto sugerem a participação de vias inflamatórias e proteases na patogênese das MPS, e enquanto o tratamento com as microcapsulas ainda apresenta limitações, a terapia gênica com o retrovírus e a terapia de reposição enzimática desde o nascimento se mostram como alternativas viáveis e promissoras. / In this work we aimed to study the pathogenesis of mucopolysaccharidosis (MPS), especially organs that have been described as difficult-to-reach by current therapies. We also aimed to evaluate new therapies for these diseases. Our studies focused on MPS I and VII mice showed an increase in the activity of proteases, including cathepsins and metallopeptidases, that can contribute to the disease pathogenesis in the aorta, joints and brain. In the same organs, we observed activation of inflammatory pathways, including the complement system, the toll-like recetor pathway and a neuroinflammatory process, who can also contribute to the abnormalities observed. Two gene terapy protocols were tested and, while the cell encapsulation only achieved transient correction in vivo (possibly due to a pericapsular fibrosis), the use of a retroviral gene vector reached supernormal serum IDUA levels and correction of brain abnormalities. Finally the use of enzyme replacement therapy from birth showed improvements in visceral organs, specially the aorta and heart valves, and a reduction in the levels of serum anti-IDUA antibodies. Surprisingly, the enzyme could be detected in the brain, suggesting that a fraction crosses the blood-brain-barier. Our data altogether suggest the participation of inflammatory pathways and proteases in the pathogenesis of MPS, and although the treatment with microcapsules still presents limitations, retroviral gene therapy and enzyme replacement therapy started from birth are promising treatment alternatives.

O estudo de metodologias que possibilitem o acesso de moléculas terapêuticas ao cérebro evitando a barreira hematoencefálica (blood-brain barrier, BBB), é extremamente importante para o tratamento das doenças que afetam o sistema nervoso central. Os estudos se concentram na busca por vias seguras e pouco invasivas. Recentemente a via nasal tem mostrado resultados positivos na administração de fármacos ao sistema nervoso central de maneira segura, sugerindo a utilização desta via para a terapia gênica. Neste trabalho, foi estudada a administração intranasal de um vetor não viral, que codifica o gene da proteína verde fluorescente otimizada (enhanced green fluorescent proten, EGFP), diluído em água ou em solução de sulfato de zinco em camundongos adultos da linhagem BALB/c. Os resultados de RT-PCR mostraram que o vetor atingiu o cérebro em ambos tratamentos, e sua expressão foi mantida até 8 semanas após o tratamento. A expressão da EGPF em diferentes regiões cerebrais foi analisada 1, 2, 4 e 8 semanas após o tratamento, através de imunohistoquímica. Nossos resultados mostraram que um número muito pequeno de células foi transfectado em ambos tratamentos e que a freqüência destas células nas regiões cerebrais estudadas varia muito mesmo entre animais do mesmo grupo. O tratamento com sulfato de zinco não aumentou a eficiência do vetor. Os maiores números de células transfectadas encontradas foram no bulbo olfatório e hipocampos uma semana após o tratamento. Nossos resultados mostram pela primeira vez a expressão prolongada de um gene administrados pela via nasal no cérebro. / The investigation of methods that allow the access of therapeutic molecules to the brain, overcoming the blood-brain barrier (BBB), is of great importance for the treatment of diseases reaching the central nervous system. Studies concentrate mainly on the search for safer and less aggressive routes. Recent studies have suggested that pharmaceutical agents can reach the brain by the nasal route, that may thus be also appropriate for gene therapy. Here, we investigated brain targeting by intranasal administration of a plasmid vector (pREGFP) with the reporter gene EGFP, diluted in water or in a zinc sulfate/water solution, to adult BALB/c mice. Brain regions were examined by RT-PCR or immunohistochemistry 1, 2, 4 or 8 weeks after the treatment. RT-PCR results showed that the plasmid DNA reached the brain similarly with the two types of treatment. Expression of egfp was observed in all groups, and maintained even 8 weeks after treatment. Brain sections submitted to immunohistochemistry (IHC) were analyzed for the detection of EGFP-positive cells, that could be observed in brain samples from mice treated by intranasal administration of pREGFP. The frequency of EGFP-positive cells was very low, and presented great variation even among mice from the same experimental group. The supplementation of the transfection medium with zinc sulfate did not induce higher numbers of EGFP-positive cells. A higher frequency of these cells was observed in the olfactory bulb one week after treatment, and in the hippocampus as compared to other brain regions. Our results show for the first time the long-term expression of a gene carried by a nonviral vector to the central nervous system.

Dissertação (mestrado) - Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, 2011 / Bibliografia: p. 93-97 / A biotecnologia, ramo da ciência que lida com a vida, permitiu ao ser humano o conhecimento de sua estrutura celular e comportamento dos genes na difusão dos dados hereditários. A partir da década de oitenta iniciou-se o projeto Genoma Humano, que desvend / Biotechnology, a branch of science that deals with life, enabled the human beings the knowledge of their cellular structure and the behavior of genes in the hereditary transmission of data. From the eighties, it began the Human Genome Project, which revea

Os laboratórios de pesquisa científica acadêmica na área da saúde são ambientes nos quais os estudantes vivenciam processos educacionais. A sistematização em estudos científicos dos conhecimentos relacionados a estes processos requer pesquisas que enfoquem os alunos, o que não é comum neste tipo de ambiente, onde o estudo dos objetos é predominante. Em conseqüência, as publicações científicas dos laboratórios de pesquisa científica acadêmica na área da saúde limitam-se majoritariamente aos experimentos, indicando que os conhecimentos produzidos pelos processos educacionais que ocorrem nestes laboratórios não estão sendo cientificamente sistematizados e compartilhados com os pares. A presente tese parte da pesquisa científica em terapia gênica para Gangliosidose GM1 em busca do enfoque no aluno para estudar os processos educacionais que ocorrem em um laboratório de pesquisa científica acadêmica na área da saúde. Seu objetivo é articular a relação entre sujeito que pesquisa e objeto pesquisado, problematizando, com base no referencial teórico de complexidade de Edgar Morin, a pesquisa qualitativa com enfoque em educação em ciências no Centro de Terapia Gênica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Duas histórias em quadrinhos seqüenciais foram elaboradas para retratar protocolos de procedimentos científicos e implementadas em associação aos respectivos protocolos no processo de aprendizado destes procedimentos. A análise das entrevistas com os estudantes que participaram deste processo demonstram que as histórias em quadrinhos estimulam a memória e promovem a compreensão das relações entre os passos dos protocolos. As reflexões espontâneas destes estudantes sobre o aprender a fazer ciência e o método científico durante as entrevistas resultaram em um estudo subseqüente, no qual os estudantes foram entrevistados sobre a sua compreensão do método científico. As respostas refletem o fazer ciência dos entrevistados no laboratório, que se dá pela realização de projetos, constituindo uma compreensão reduzida sobre o método científico ao excluir o pensamento científico. O desconhecimento de autores relacionados à ciência em geral, que indica o desconhecimento das suas obras, as dificuldades em compreender atividades e questões que têm enfoque no sujeito e seus processos e o emprego estrito da objetividade para tratar de questões subjetivas refletem a não articulação entre objeto e sujeito e a separação das ciências. Atividades educativas de retorno foram realizadas para trabalhar os resultados com os entrevistados. / Health field academic science research laboratories are environments in which students experience educational processes. Scientific systematization of knowledge related to such processes requires research focusing the students, which are not common in this type of environment, where the study of objects major. Consequently, scientific publications from health field academic science research laboratories are mainly limited to objective bench experiments, indicating that the knowledge related to the educational processes that take place in these labs is not being scientifically systemized and shared with peers. The present thesis uses scientific research on gene therapy for GM1 Gangliosidosis in order to focus subjects and study the educational processes in a health field academic science research lab. The aim is to articulate the relationship between research subjects and objects, thereby developing, in regard to Edgar Morin’s complexity theoretical reference, qualitative research focusing science education at Centro de Terapia Gênica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Two sequential cartoon stories that portrait scientific protocols were created and implemented in association to such protocols on the learning processes of related procedures. Analysis of participating students’ interviews demonstrated that cartoons stimulate memory and improve comprehension of relationship between protocols’ steps. Students’ reflections on science learning and scientific method resulted in a subsequent study, in which students were interviewed about their comprehension on the scientific method. Answers reflect their laboratory science making, which is resumed to scientific projects’ execution, leading to a reduced comprehension of the scientific method as scientific thinking is excluded. Lack of knowledge about science related authors in general, which indicates lack of knowledge of these author’ works, difficulties on comprehending activities that focus on subjects and their learning process, and strict use of objectivity in order to deal with subjectivity issues reflect the lack of articulation between object and subject and the separation of science in distinct fields. Feedback educational activities were created and implemented to work the results with interviewed students.

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-09-13Bitstream added on 2014-11-10T11:58:07Z : No. of bitstreams: 1 000787252.pdf: 3794432 bytes, checksum: 85f2a289aa4b969ceaadd7ef6d8e6d13 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Uma possível estratégia para aumentar a eficiência de transfecção gênica da quitosana como vetor não viral é a modificação desse policátion com adição de grupos hidrofílicos, sensíveis ao pH e seletivos quanto às células alvo, sem interferir nas propriedades biológicas da quitosana, como biodegradabilidade e baixa toxicidade. Nesse tema, a presente tese teve como objetivo a modificação da estrutura da quitosana com grupos fosforilcolina (PC), dietilaminoetila (DEAE) e o ligante folato (FA). Derivados de quitosana com diferentes proporções de grupos PC e DEAE foram sintetizados e caracterizados utilizando-se RMN de 1H, titulação condutimétrica, Cromatografia de permeação em gel e espectroscopia UV-vis. Os derivados foram utilizados para a preparação de poliplexos com o plasmídeo VR1412 e com o RNA de interferência siRNA-SSB. Esses poliplexos preparados foram caracterizados por espalhamento de luz dinâmico, obtendo-se nanopartículas (NPs) cujos diâmetros variaram de 100 nm a 700 nm, e com valores de potencial zeta de -25 mV a +22 mV, dependentes dos graus de substituição de PC e DEAE. A estabilidade das partículas e a integridade do plasmídeo foram verificadas a partir de eletroforese em gel de agarose, observando-se maior estabilidade para maiores razões N/P (N = grupos amina do policátion; P = grupos fosfato do pDNA ou siRNA), e para os polímeros de maior massa molecular e substituídos com o grupo DEAE. Células HeLa foram utilizadas para analisar a citotoxicidade dos poliplexos e polímeros, bem como a eficiência de transfeção. Os resultados mostraram que a citotoxicidade dos derivados aumenta com o grau de substituição por DEAE. Entretanto, a composição pode ser controlada e todos os derivados foram menos tóxicos que o lipídeo comercial lipofetamina, lipídeo geralmente utilizado para transferência gênica. A eficiência de transfecção foi altamente intensificada com as modificações ... / One possible strategy to improve the efficiency of chitosan as a non viral vector is the modification on the polycation with the additions of hydrophilic, pH-sensitive and selective groups for the target cells, without interfering with the biological properties of chitosan, such as biodegradability and low toxicity. On this matter, the present thesis aimed the modification on the structure of chitosan, with phosphorylcholine (PC), diethylaminoethyl (DEAE) and the ligand folate (FA). Chitosan derivatives with different proportions of PC and DEAE groups were synthesized and characterized using 1H-NMR, conductimetric titration, gel permeation chromatography and UV-vis spectroscopy. The derivatives were used to prepare polyplexes with plasmid VR1412 and small interference RNA, siRNA-SSB. The particles were characterized by dynamic light scattering, resulting in nanoparticles with diameters ranging from 100 nm to 700 nm, and the zeta potential values from -25 mV to +22 mV dependent on the degree of substitution of PC and DEAE. The colloidal stability of these particles and integrity of the plasmid were verified with agarose gel electrophoresis, observing improved stability with higher N/P ratio (N = amine groups from polycation / P = phosphate groups from pDNA or siRNA), molecular weight of polymers and substitution of DEAE group. HeLa cells were used to analyze the cytotoxicity of polyplexes and polymers, as well as the transfection efficiency. The results showed that the cytotoxicity of the derivatives increases with the degree of substitution of DEAE. However, the composition can be controlled, and all the derivatives were less toxic than lipofectamine, a general commercial lipid used for gene transfer. Transfection efficiency was highly enhanced with the modifications, arrising to eight times more efficient than unmodified deacetylated chitosan and very close to the results observed for lipofectamine. The results evidenced that changes on ... / FAPESP: 10/09651-6

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-05-05Bitstream added on 2014-11-10T11:57:27Z : No. of bitstreams: 1 000790040.pdf: 1326937 bytes, checksum: af8ee251aaaf5a06acd1e6604ded62a3 (MD5) / O presente estudo teve como objetivo principal a síntese e caracterização de derivados hemocompatíveis de quitosana e sua utilização na preparação de nanopartículas para terapia gênica não-viral. O trabalho foi realizado em duas etapas, sendo a primeira a obtenção dos derivados, seguido de estudos da interação com o plasmídeo VR 1412 (pDNA) que expressa a β-galactosidase. A primeira etapa de síntese envolve a modificação de quitosana pela introdução de grupos amino, seguido pela ligação de cadeias de polietilenoglicol (PEG). Os derivados foram caracterizados por espectrometria de ressonância magnética nuclear de hidrogênio, potenciometria e viscosidade. Os estudos da interação foram realizados utilizando as técnicas de fluorescência, eletroforese em gel de agarose, espalhamento de luz dinâmica e citotoxicidade. O trabalho foi conduzido de forma comparativa, avaliando as mudanças estruturais e seus efeitos na força de interação e estabilidade das nanopartículas / The current study aimed at the synthesis and characterization of hemocompatible chitosan derivatives and their use in the preparation of nanoparticles for non-viral gene therapy. The project was carried out in two steps, first the synthesis and characterization of the derivatives, followed by studies of the interaction between the chitosan derivatives and the VR1412 plasmid (pDNA), that expresses the β-galactosidase protein. The first step of synthesis was the modification of chitosan by introducing tertiary amino groups, followed by attaching the polyethyleneglycol (PEG) to the chitosan backbone. The study of the interaction between the chitosan derivatives and the pDNA was carried out using the fluorescence, electrophoresis in agarose gel, and light scattering techniques. The study was performed in order to evaluate the effect of structural changes of the chitosan backbone on the strength of interaction and stability of the nanoparticles

A Mucopolisacaridose tipo I é uma doença lisosomal caracterizada pela deficiência de a-L-iduronidase (IDUA), que é responsável pela degradação de glicosaminoglicanos (GAGs). Esta deficiência leva ao acúmulo de dermatan e heparan sulfato nos lisossomos. Atualmente, os tratamentos disponíveis envolvem transplante de medula óssea e terapias de reposição enzimática que são limitadas em seus efeitos. Neste trabalho, camundongos nocaute (KO) para o gene IDUA (gentilmente fornecidos pela Dr. Elizabeth Neufeld, UCLA) foram tratados com um vetor nonviral contendo cDNA IDUA humano (pRIDUA). Os camundongos KO foram transfectados através de injeção hidrodinâmica pRIDUA na veia caudal (iv, n = 3) ou por injeção intraperitoneal de complexos pRIDUA/Superfect (ip, n = 3). A acumulação de GAGs foi medida nos rins, baço, pulmões, cérebro e fígado; atividade de IDUA foi analisada nos órgãos. A expressão de IDUA também foi analisada nos órgãos por RT-PCR. A concentração de GAGs nos órgãos foi diferente entre KO e camundongos normais. No baço, níveis de GAGs foram significativamente mais baixos em camundongos KO tratados iv comparando com o grupo KO sem tratamento. O RT-PCR mostrou amplificação do cDNA IDUA em todos órgãos dos camundongos KO ambos tratados por iv ou ip. Os resultados mostram atividade da enzima nos mesmos órgãos analisados (principalmente no baço, cérebro e pulmão). Estes dados sugerem que o transgene é expresso nos órgãos dos camundongos KO tratados ip ou iv com pRIDUA. Este tipo de transfecção pode ser uma ferramenta útil para protocolos não-virais de terapia de gene de MPS. / Mucopolysaccharidosis I is a lysosomal disorder characterized by deficiency of a-L-iduronidase (IDUA), which is responsible for the degradation of glycosaminoglycans (GAGs). This deficiency leads to accumulation of dermatan and heparan sulphate on lysosomes. Presently, available treatments involve bone marrow transplantation and enzyme replacement therapies which are however limited in their effects. In this work, knockout (KO) MPS I mice (gently provided by Dr Elizabeth Neufeld, UCLA) were treated with a nonviral vector with the human IDUA cDNA. KO mice were transfected with by hydrodynamic injection of pRIDUA in the caudal vein (iv, n = 3) or by intraperitoneal injection of pRIDUA/Superfect complexes (ip, n = 3). GAG accumulation was measured in the kidneys, spleen, lungs, brain and liver; IDUA activity was analyzed in the organs. The expression of IDUA was also analyzed in the organs by RT-PCR. The concentration of GAGs in the organs was different between KO and normal mice. In the spleen, however, GAGs levels were significantly lower in KO mice treated iv with pRIDUA than in control KO. RT-PCR showed amplification of IDUA cDNA in all organs of the KO mice both treated by iv and ip. The results show enzyme activity in the same the organs analyzed (specially in spleen, brain and lung). These data suggest that the transgene is expressed in the organs of KO mice treated ip or iv with pRIDUA. This kind of transfection may be a useful tool for non-viral protocols of gene therapy of MPS.