A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença lisossomal. A enzima envolvida com essa doença é a a-L-iduronidase (IDUA), e suas alterações levam a depósitos dos glicosaminoglicanos heparan e dermatan sulfato. As características fenotípicas da doença compreendem entre outras características malformações ósseas, hepatoesplenomegalia, problemas cardíacos, opacidade da córnea e retardo mental. O tratamento de MPS I atualmente se baseia em reposição enzimática e transplante de medula óssea. Levando em conta que esses tratamentos ainda não levam a uma correção dos danos ao sistema nervoso central (SNC), há necessidade do desenvolvimento de novos tratamentos para MPS I. Ainda outro problema da MPS I é a falta de estudos sobre os danos fisiológicos resultantes, principalmente no SNC. Visando contribuir com estes pontos, nosso trabalho teve como objetivo (a) o desenvolvimento de três vetores virais para posteriores ensaios pré-clínicos de terapia gênica e (b) o detalhamento da caracterização fisiopatológica de camundongos representando um modelo para MPS I, enfocando alguns aspectos do SNC. Foram produzidos três vetores virais com o cDNA da IDUA humana. O vetor baseado no vírus da imunodeficiência humana (HIV), apesar de baixos títulos virais, foi capaz de aumentar em até 60 vezes a atividade da IDUA nas células transduzidas. Um segundo vetor, baseado no vírus da leucemia murina de Moloney (MoMLV) foi capaz de transduzir células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea do modelo murino de MPS I, sendo assim ótima ferramenta para terapia gênica ex vivo. O terceiro vetor, baseado no vírus da imunodeficiência felina (FIV) mostrou funcionalidade inferior quando comparado aos outros sistemas virais, e deve ser aperfeiçoado para utilização terapêutica. A caracterização do modelo foi feita através do estudo da fosforilação de proteínas de neurofilamentos em diferentes estruturas do cérebro de camundongos MPS I. Os resultados mostraram, além de alterações na fosforilação direta das proteínas analisadas, uma hiperfosforilação na ERK1/2 de córtex e hipocampo. Depósitos de gangliosídeos foram investigados de forma individual no cerebelo, córtex, hipocampo e hipotálamo, sendo detectadas diferenças específicas para cada estrutura. Ainda foram realizados estudos da neurotransmissão glutamatérgica e com isso foi identificada uma diminuição na captação de glutamato em hipocampo e córtex nos camundongos MPS I, além de uma diminuição no binding para glutamato no hipocampo. Como conclusão desses estudos, foram desenvolvidos vetores eficientes para transferência do gene terapêutico e, adicionalmente, os danos fisiológicos causados pela doença no SNC foram melhor elucidados no modelo murino de MPS I. As informações obtidas aqui serão de grande importância principalmente quando associadas a ensaios de terapia gênica, pois as características encontradas no SNC podem ser usadas para acompanhamentos de ensaios préclínicos usando os vetores desenvolvidos no trabalho. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is a monogenic disease resulting from a defect in the gene that encodes the lysosomal hydrolase a-L-iduronidase (IDUA) and characterized by accumulation of glycosaminoglycans (GAGs) heparan and dermatan sulfate. Phenotypic characteristics involve bone malformations, hepatosplenomegaly, heart problems, corneal opacity and mental retardation. Treatment of MPS I is currently based on enzymatic replacement and bone marrow transplantation. Since these treatments are not capable of correcting central nervous system (CNS) effects of the disease, new therapeutic approaches are needed. One of the problems in the investigation of MPS I is the paucity of studies about resulting physiological consequences, particularly those related to the CNS. Aiming to contribute to these aspects of MPS I, this study proposes (a) the development of three viral vectors to be used in gene therapy preclinical studies, and (b) the further investigation of physiopathological alterations in the CNS of a murine model of MPS I (MPS I mice). Three viral vectors, carrying the human IDUA gene, were produced. The vector based on the human immunodeficiency virus (HIV) was produced in low titers, but induced a 60-fold increase in the baseline activity of IDUA in transduced cells. A second vector, based on the Moloney murine leukemia virus (MoMLV), was capable to transduce mesenchymal stem cells isolated from the bone marrow of MPS I mice, representing an interesting tools for ex vivo gene therapy protocols. The third vector, was based on the feline immunodeficiency virus (FIV), was functionally inferior to the other two systems and needs optimization to be therapeutically useful. The model was characterized by the investigation of phosphorylation patterns of neurofilament proteins in different regions of the brain of MPS I mice. The results showed that, besides alterations in the direct phosphorylation profile of the proteins analyzed, ERK1/2 was hyperphosphorylated in the cortex and hippocampus. Ganglioside storage was individually investigated in the cortex, cerebellum, hippocampus and hypothalamus, and specific differences were observed for each structure. An analysis of glutamatergic neurotransmission was also performed. MPS I animals showed a decrease in the glutamate uptake in the cortex and hippocampus. In addition, glutamate binding was decreased in the hippocampus. In conclusion, the present work resulted in the development of efficient viral vectors for the transfer of the therapeutic gene, and CNS physiological damages due to the disease were characterized in the murine model of MPS I. These results will be of great importance particularly when associated to gene therapy trials, since the CNS characteristics described in this work may be used for the follow-up of preclinical assays with the viral vectors developed.

Mestrado (dissertação)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Saúde Coletiva, 2017. / Submitted by Gabriela Lima (gabrieladaduch@gmail.com) on 2017-12-01T11:46:31Z No. of bitstreams: 1 2017_DalilaFernandesGomes.pdf: 1067971 bytes, checksum: a46dc687ffab7bd0e0bd791da70c8ef3 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-01-23T21:50:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_DalilaFernandesGomes.pdf: 1067971 bytes, checksum: a46dc687ffab7bd0e0bd791da70c8ef3 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-23T21:50:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_DalilaFernandesGomes.pdf: 1067971 bytes, checksum: a46dc687ffab7bd0e0bd791da70c8ef3 (MD5) Previous issue date: 2018-01-23 / Introdução: A mucopolissacaridose VI é uma doença rara caracterizada pela deficiência da enzima arilsulfatase B, responsável por diferentes manifestações clínicas. O tratamento consiste na terapia de reposição enzimática com administração intravenosa do medicamento galsulfase. Objetivo: Avaliar a efetividade da terapia de reposição enzimática com galsulfase no tratamento da mucopolissacaridose VI. Método: Trata-se de revisão sistemática de estudos observacionais. Os estudos foram pesquisados nas bases de dados PubMed, Cochrane Library, Lilacs e Journal of Inherited Metabolic Disease. As listas das referências bibliográficas dos estudos relevantes foram consultadas para identificar artigos potencialmente elegíveis. Não foram aplicadas restrições em relação à data de publicação, idioma ou status de publicação. Os estudos foram selecionados por duas avaliadoras independentes que também extraíram os dados e avaliaram a qualidade metodológica dos estudos. Resultados: Dezenove estudos preencheram os critérios de inclusão, dos quais nove foram série de casos, cinco relatos de caso, três coortes e dois transversais. Um total de 414 indivíduos com mucopolissacaridose tipo VI foram avaliados e quatorze desfechos diferentes relacionados ao efeito do tratamento foram identificados. Oito desfechos apresentaram resultados positivos, caracterizados como (1) redução de glicosaminoglicanos urinário, (2) melhora da função respiratória, (3) aumento da amplitude do movimento das articulações, (4) aumento da taxa de crescimento dos pacientes, (5) maior resistência física, (6) redução do tamanho do fígado e baço, (7) melhora da qualidade de vida e (8) normalização das dimensões cardíacas. Outros desfechos permaneceram estáveis, como o desenvolvimento cognitivo, acuidade visual, capacidade auditiva e apneia do sono. Quanto à segurança, reações adversas leves de hipersensibilidade como urticária e pirexia foram relatadas. Conclusão: Limitações metodológicas impossibilitaram a análise da efetividade do tratamento. No entanto, os achados do estudo indicam que a terapia de reposição enzimática tem efeito positivo na maioria dos desfechos associados à doença. Portanto, novos estudos devem ser fomentados a fim de melhorar a qualidade das evidências. / Introduction: Mucopolysaccharidosis VI is a rare disease characterized by the deficiency of the enzyme arylsulfatase B, responsible for different clinical manifestations. Treatment consists of enzyme replacement therapy with intravenous administration of the galsulfase drug. Objective: To evaluate the efficacy of enzyme replacement therapy with galsulfase in the treatment of mucopolysaccharidosis VI. Method: This is a systematic review of observational studies. The studies were searched in the PubMed, Cochrane Library, Lilacs and Journal of Inherited Metabolic Disease databases. The reference lists of relevant studies for consultation to identify potentially eligible articles. No restrictions were applied regarding publishing data, language, or publishing status. The studies were selected by two independent evaluators who also extracted the data and evaluated the methodological quality of the studies. Results: nineteen studies completed the inclusion criteria, of which nine were case series, five case reports, three cohorts and two cross-sectional. A total of 414 people with mucopolysaccharidosis VI were evaluated and fourteen different outcomes related to the treatment effect identified. Eight outcomes presented positive results, characterized as (1) reduction of urinary glycosaminoglycans, (2) improvement of respiratory function, (3) increased range of joint motion, (4) increased patient growth rate, (5) increased physical resistance, (6) reduction of liver and spleen size, (7) improvement of quality of life, and (8) normalization of cardiac dimensions. Other outcomes remained stable, such as cognitive development, visual acuity, hearing capacity and sleep apnea. About safety, mild adverse reactions of hypersensitivity such as urticaria and pyrexia have been reported. Conclusion: Methodological limitations made it impossible to analyze the effectiveness of the treatment. However, the study findings indicate that enzyme replacement therapy has a positive effect on most disease associated outcomes. Therefore, further studies should be fomented to improve the quality of the evidence.

A concepção deste trabalho surgiu a partir de observações de lacunas na clínica das adições às drogas. Com o objetivo de oferecer maior suporte no tratamento do uso abusivo de drogas, essa pesquisa propõe-se a abordar o problema reconhecendo a multiplicidade de fatores presentes nas adições. Inicialmente foi revisada a literatura sobre o uso de drogas na história da humanidade e seu possível significado de acordo com o momento histórico. Na pesquisa da literatura, procurou-se descrever o desenvolvimento psíquico do sujeito, e foram abordadas formas de resolução de conflitos comuns a quem chegou ao uso abusivo de drogas. Foi apresentada uma visão do sujeito na sua totalidade, tanto individual quanto social. Essa versão serviu como suporte para investigar a possível interferência da sociedade de consumo no uso de drogas. A investigação também deu ênfase às vicissitudes surgidas durante a trajetória do adicto após a tentativa de deixar esse comportamento. Para realização desse trabalho, foi utilizada metodologia qualitativa de caráter descritivo. Na pesquisa de campo, optou-se por entrevistas semi-estruturadas como instrumento de investigação. Essa escolha deu-se pela intenção de buscar na palavra do adicto uma percepção própria a respeito de sua trajetória após o tratamento, quando está experimentando um novo modo de existência. A análise das entrevistas mostrou um tipo de pensamento concreto presente no discurso do adicto. Isso foi identificado pela ausência de uma percepção crítica a respeito da influência do meio no uso de drogas. Essa verificação levou a algumas conclusões. A droga, usada como uma mentira, evita, de forma onipotente, que o adicto entre em contato com as verdadeiras emoções. Com o uso de drogas, o adicto fica impossibilitado de pensar, já que o pensamento supõe uma experiência emocional correspondente. Sem a possibilidade de ter uma referência simbólica, ele adere a crenças sem atingir o nível do pensar. Portanto, é importante que os profissionais envolvidos no tratamento das adições ajudem os sujeitos adictos a ampliarem a sua capacidade de pensar. Isso poderá ser feito através da integração do pensar e sentir. Somente assim será possível a utilização da palavra como recurso simbólico que permite tolerar e nomear, tanto a presença quanto a ausência de satisfação. Sem a capacidade de pensar ampliada, produz-se um hábito sem que ocorram transformações verdadeiras. Corre-se o risco de que o tratamento das adições não auxilie o sujeito a ter experiências reflexivas, onde o pensamento se antecipa à ação.

Resumo não disponível

Esta pesquisa tem como tema central a operação de inscrição psíquica como estruturante do sujeito. É uma pesquisa psicanalítica e, portanto, possui um campo conceitual e método próprios. Seu fio condutor é o caso Julia, que é uma construção de caso concebida a partir da metodologia proposta por Fédida (1992, 1999), que possibilitou a formulação de um ensaio metapsicológico. Trata-se de um ensaio sobre o registro psíquico, construído a partir da noção freudiana de ação específica (spezifische Aktion), que é desenvolvida em sua relação com a percepção, relação esta suscitada pela clínica da pesquisadora e articulada à proposta de Chemama (2002) a propósito do conceito de forclusão do falo. A noção freudiana é também articulada ao conceito de transtitivismo proposto por Bergès e Balbo (2001, 2002, 2003) e ainda à possibilidade de sua ocorrência na situação psicanalítica de tratamento. A pesquisa aborda aspectos técnicos a serem ressaltados no tratamento de analisantes que se aproximam do caso Julia, sendo esta a contribuição desta pesquisa para a comunidade psicanalítica. A idéia de que o psicanalista com seu presencial, em uma postura não apática, através do golpe de força, pode entrar no jogo de posições necessário para que o analisante inscreva algo de sua vivência parece ser pertinente nesse tipo de problemática.

A transferência de material genético para dentro das células de um indivíduo com o objetivo de conferir um benefício terapêutico ao corrigir uma anormalidade ou proporcionar às células uma nova função constitui a essência da terapia gênica. Seu princípio baseia-se no entendimento de que algumas doenças são causadas por defeitos em um ou mais genes, levando à produção descontrolada ou à supressão de uma proteína essencial para o funcionamento das células. Doenças monogênicas (como os erros inatos do metabolismo), câncer, doenças cardiovasculares, desordens neurodegenerativas e doenças adquiridas (infecciosas, por exemplo) são alvos da terapia gênica. Na terapia gênica, o agente terapêutico em questão é o material genético de interesse. Tanto os elementos regulatórios quanto o gene de interesse são clonados em um plasmídio de expressão, que é, então, utilizado para a construção de vetores de transferência virais e não virais. Bicamadas lipídicas microscópicas denominadas lipossomos são vetores não virais comumente utilizados. Este trabalho teve como objetivo iniciar uma adaptação das abordagens da farmacologia ao estudo de vetores não virais em terapia gênica e padronizar a detecção da green fluorescent protein (GFP) por espectrofotometria de fluorescência, determinando o tempo de expressão máxima dessa proteína em cultura de células HepG2 e obtendo-se, assim, um método quantitativo para avaliação da eficiência de transfecção de vetores e parâmetros de tempo para futura detecção da GFP in vivo. É possível traçar paralelos entre a farmacoterapia e a terapia gênica. A comparação entre as composições de formulações farmacêuticas e de vetores de transferência leva-nos a pensar que o gene de interesse corresponderia à pró-droga, enquanto a proteína expressa equivaleria à droga, uma vez que se constitui no componente terapeuticamente ativo. Os demais elementos presentes nos plasmídios, como os promotores e sítios de poliadenilação, corresponderiam aos excipientes e o vetor de transferência como um todo equivaleria à formulação farmacêutica. A detecção da GFP expressa por células HepG2 transfectadas pelo plasmídio pTracer associado a LipofectamineTM2000 mostrou-se semi-quantitativamente possível por espectrofotometria de fluorescência. O tempo de expressão máxima desta proteína neste estudo foi 48 horas, sendo este também o tempo máximo de análise. É necessário, portanto, que os tempos de análise da expressão protéica sejam expandidos. A adaptação de abordagens farmacológicas pode contribuir para o aprimoramento técnico necessário para que a terapia gênica torne-se uma forma de tratamento amplamente difundida.

A hiperprolactinemia constitui-se num achado laboratorial que quando resultante de secreção inapropriada, pode indicar tanto um processo patológico orgânico, como uma desordem funcional reversível. Representa o distúrbio hipofisário mais frequentemente encontrado na prática clinica e constitui um dos aspectos mais importantes no estudo da endocrinologia da reprodução. As hiperprolactinemias de causas não fisiológicas são secundárias mais frequentemente a efeito farmacológico, presença de tumor hipofisário, disfunção tireoideana, insuficiência renal crônica e distúrbios do SNC. Quando as situações acima citadas são excluídas, a hiperprolactinemia é considerada de origem funcional, um diagnóstico que representa particular interesse, pois seu estudo tem permitido maior conhecimento sobre os mecanismos implicados no controle neuroendócrino do eixo hipotálamo-hipófise-ovário. O manejo das diferentes causas de hiperprolactinemia tem se modificado à medida que nos familiarizamos com os recursos oferecidos pelos métodos diagnósticos e se amplia o conhecimento das características evolutivas de cada caso em particular. O reconhecimento deste distúrbio nas suas formas leves de apresentação pode ser o caminho para um melhor controle destas pacientes, com melhor-seleção de pacientes que necessitam de tratamento e possibilidade de utilização de medidas cada vez mais conservadoras. Os agonistas da dopamina representam o principal recurso no controle da hiperprolactinemia. Deste grupo a droga mais utilizada é a bromocriptina, que apesar de comprovadamente eficaz em reduzir os níveis de prolactina, não pode ser aplicada na totalidade dos casos porque algumas pacientes apresentam hiperprolactinemia resistente ao tratamento ou intolerância à medicação. O objetivo deste trabalho foi descrever as características clinicas, hormonais e radiológicas em pacientes portadoras de hiperprolactinemia, e observar as alterações clinicas e hormonais que ocorrem durante o tratamento com bromocríptina e com acetato de noretisterona, um progestágeno do grupo noresteróide, cuja atividade antiestrogênica pode determinar redução nos níveis de prolactina.

Introdução: A avaliação de resultados do tratamento de pacientes criticamente doentes é ainda predominantemente baseada mais em taxas de mortalidade do que em instrumentos associados com morbidade. Assim, a avaliação por meio do comprometimento funcional, interação social e função cognitiva desses pacientes após internação em UTI é parte de uma iniciativa crescente para se suplementar as informações de mortalidade com resultados funcionais, tendo o potencial de prover uma visão mais ampla do desempenho da unidade. Objetivos: Avaliar o impacto da internação sobre os desempenhos cognitivo e global em crianças admitidas na UTI Pediátrica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil. Métodos: Estudo longitudinal e observacional de amostra de conveniência de crianças gravemente doentes. Foram utilizados os indicadores PIM (Pediatric Index of Mortality), para gravidade e risco de morte na admissão, PCPC (Pediatric Cerebral Performance Category), para morbidade cognitiva, e POPC (Pediatric Overall Performance Category), para morbidade global, na admissão e na alta, e a diferença entre as classificações de alta e de admissão (escores delta), para morbidade relacionada à UTI. Foram empregados os testes de Kruskal-Wallis para comparação de indicadores e de correlação de Spearman para associação com variáveis categóricas, considerando um α=0,05. Aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da instituição e solicitada concordância dos pais para participação no estudo. Resultados: Foram avaliados 443 pacientes, sendo 54% do sexo masculino, com mediana de idade de 12 meses (Intervalo Inter-quartil [IQ] 4–45) e mediana de permanência na UTI de 4,24 dias (IQ 2,4–8). A taxa de mortalidade foi de 6,3%, a mediana do PIM da admissão foi de 2,36% (IQ 1–7), e 43% dos pacientes foram admitidos por doença respiratória. Na admissão, 46% dos pacientes tinham algum grau de morbidade cognitiva (PCPC >1) e 66% de morbidade global (POPC >1). Na alta, 60% de morbidade cognitiva e 86% de morbidade global. Na avaliação de morbidade relacionada à UTI, 25% dos pacientes mostraram variação na área cognitiva (delta-PCPC≠0), enquanto que 41% mostraram variação global (delta-POPC≠0) na alta em comparação à admissão. Houve uma correlação positiva do tempo de internação na UTI e do PIM com os escores delta, tanto para o domínio cognitivo (rs=0,18 & rs=0,32; p<0,0001) quanto global (rs=0,21 & rs=0,33; p<0,0001). Conclusões: Ainda que influenciado por elevado grau de morbidade na admissão, o impacto da internação na UTI é mais importante no domínio global do que no cognitivo. Da mesma forma, tanto o risco de morte na admissão quanto o tempo de permanência têm efeito significativo na morbidade de pacientes gravemente doentes. Palavras-chave: desfecho, cuidados intensivos, Categoria de Performance Cerebral Pediátrica, Categoria de Performance Global Pediátrica, morbidade. / Introduction: The assessment of treatment results for critically ill patients is still primarily based on mortality rates rather than on morbidity instruments. Therefore, assessment of results by means of functional impairment, social interaction and cognitive functioning of patients after hospitalization in ICU is part of a growing initiative to supplement informations on mortality with functional results, giving the potencial of providing an insight about the unit performance. Objective: To assess the impact of hospitalization on cognitive and functional performances of children admitted to the pediatric ICU of Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil. Methods: Longitudinal and observational study of a convenient sample of critically ill children. PIM (Pediatric Index of Mortality), for severity of illness and death risk on admission, PCPC (Pediatric Cerebral Performance Category), for cognitive morbidity, and POPC (Pediatric Overall Performance Category), for overall morbidity, on admission and discharged, and the difference between discharge and admission (the delta scores), for morbidity related to the ICU, were used. The Kruskal-Wallis test was used to compare variables and the Spearman correlation to associate categorical variables, considering α=0.05. The study was approved by the institution’s Ethics Committee and the informed consent was applied. Results: 443 patients were assessed; 54% were male, with median age was 12 months (IQ 4-45) and median ICU length of stay was 4.24 days (2.4-8). The mortality rate was 6.3%. Median PIM on admission was 2.36% (1-7), and 43% of patients were admitted because of respiratory disease. On admission, 46% of patients had some degree of cognitive morbidity (PCPC >1) and 66% overall morbidity (POPC >1). On discharge, 60% had cognitive morbidity and 86% overall morbidity. In the assessment of morbidity related to the ICU, 25% of the patients showed variation in the cognitive area (delta-PCPC≠0), whereas 41% showed variation in the global area (delta-POPC≠0) at the time of discharge in comparison to admission. There was positive correlation between ICU length of stay and PIM with the delta scores, for the cognitive area (rs=0.18 & rs=0.32; p<0.0001) and the global area (rs=0.21 & rs=0.33; p<0.0001). Conclusions: Even if influenced by high degree of morbidity at admission, the impact of hospitalization in ICU was more important in the global area than in the cognitive one. In the same way, both risk of mortality and length of stay had a significant effect in morbidity of critically ill patients. Key-words: outcome, critical care, Pediatric Cerebral Performance Category, Pediatric Overall Performance Category, morbidity.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2012. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2012-10-29T14:09:23Z No. of bitstreams: 1 2012_LudmyllaCostaCunha_Parcial.pdf: 2564492 bytes, checksum: 6e6ce6ca592e7c52d9722490cc9c373a (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-11-22T12:01:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_LudmyllaCostaCunha_Parcial.pdf: 2564492 bytes, checksum: 6e6ce6ca592e7c52d9722490cc9c373a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-22T12:01:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_LudmyllaCostaCunha_Parcial.pdf: 2564492 bytes, checksum: 6e6ce6ca592e7c52d9722490cc9c373a (MD5) / Gliomas representam o tipo de tumor cerebral primário de maior malignidade. Entre as alterações que conferem competência tumoral ao glioma, está o aumento na expressão do canal de potássio hEag1. Na última década, a interferência de RNA (RNAi) tem se destacado como técnica para estudo da função de genes em mamíferos, via silenciamento gênico pós-transcricional. Neste sentido, a técnica de RNAi foi utilizada no atual estudo para silenciar o gene Eag1 em células de glioma. Na primeira etapa deste projeto, foram identificados alvos para RNAi na região codante do gene hEag1 (NM_172362.2), via algoritmo baseado em redes neurais artificiais. Foram identificados 25 alvos de RNAi, com escores variando de 0,82 a 0,87, e selecionados para o atual estudo os dois alvos com maiores escores. Foi realizada síntese química de siRNAs para estes alvos situados nos exons 2 e 8, daí a denominação e2_hEag1 e e8_hEag1. Também foram sintetizados o siRNA controle positivo descrito anteriormente Kv10.1-3 e o controle negativo scramble (Qiagen). Foi inicialmente determinado o ponto temporal (4h, 8h, ou 48h) e a concentração (18,75 nM, 37,5 nM ou 75,0 nM) de maior silenciamento de hEag1, utilizando-se os siRNAs controles transfectados em lipossomas catiônicos. O maior silenciamento foi observado no tempo de 8h pós-transfecção, na menor dosagem testada, 18,75 nM. Nesta condição experimental, foi testado o grau de silenciamento de Eag1 causado pelos dois novos siRNAs, em comparação com o controle positivo Kv10.1-3. Ambos siRNAs desenhados no atual estudo -e2_hEag1 e e8_hEag1 -foram mais efetivos que o controle positivo Kv10.1-3, reduzindo assim o conteúdo relativo de hEag1 em 0,46 vezes e 0,52 vezes, respectivamente, em relação ao valor obtido no controle negativo scramble (p < 0,05). Na última etapa deste estudo, foi avaliado se vetores de expressão de short hairpins RNAs (shRNA) direcionados ao alvo 5´ GTCCACTTGGTCCATGTCCAG 3´ do controle positivo Kv10.1-3 (pKv10.1-3hum_LI), causariam alteração de fenótipo celular, ou seja, redução da viabilidade dos gliomas. O efeito destes vetores de expressão (pKv10.1-3hum_LI ou pScramble, dose de 0,2 µg) sobre a viabilidade de gliomas, em uso isolado ou em combinação com interferon gama (IFN-y, 25 ng/mL ) foi testado pelo ensaio de MTT. A redução de viabilidade obtida com a combinação do vetor pKv10.1-3hum_LI e IFN-y (40,4 %)foi superior àquela obtida com o uso isolado de ambos, 16,0% e 11,4%, nesta ordem (p < 0,05). Este efeito sinérgico não foi observado com o vetor controle negativo pScramble, o que indica tratar-se de efeito sequência-específico, ou seja, dependente da sequência do shRNA expresso pelo vetor pKv10.1-3hum_LI. Em síntese, o presente estudo mostra que é possível silenciar a expressão de hEag1 de gliomas via siRNAs sintéticos. Além disto, revela a importância de hEag1 para a viabilidade celular do glioma, principalmente durante a injúria por IFN-y. No sentido tecnológico, o atual estudo apresenta um protocolo inovador com potencial uso na terapêutica de gliomas, baseado na associação de RNAi sobre hEag1 com o agente imunomodulador IFN-y. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Glioma is the most common type of primary malignant brain tumor. The disease presents poor clinical outcome and the treatment is essentially palliative. Among the genetic changes that confer capability to tumor cells is the hEag1 gene overexpression. RNA interference (RNAi) has rapidly advanced into a practical technique for mammalian gene function studies, through post-transcriptional genetic silencing. The technique was used in the present study to silence hEag1 gene in glioma cells in culture. We first identified RNAi targets in the coding region of hEag1 (NM_172362.2) by using algorithms based on artificial neural networks. Twenty-five hEag1 RNAi targets were found, with scores ranging from 0.82 to 0.87; the two highest rated were selected. They were chemically synthesized as short interfering RNAs (siRNAs), and designated e2_hEag1 and e8_hEag1, according to the targeted exon. Positive and negative siRNA controls were the previously published Kv10.1-3, and the scramble All Star (Qiagen), respectively. We first determined the time-point (4h, 8h, or 48h) and siRNA concentration (18.75 nM, 37.5 nM, or 75.0 nM) that provide the highest silencing effect, by using RT-qPCR. The best hEag1 knock-down occurred at 8h post-transfection with 18.75 nM siRNA concentration. We used this experimental condition to compare the two new siRNAs - e2_hEag1 and e8_hEag1 – with the positive control Kv10.1-3. Both siRNAs in test produced higher silencing effects compared to Kv10.1-3 (p < 0.05). The mRNA fold decrease varied from 0.46 to 0.52, according to each transfected siRNA e2_hEag1 or e8_hEag1, respectively. Finally, we evaluated whether an expressed short hairpin RNA (shRNA) to the same hEag1 Kv10.1-3 target sequence (5´- GTCCACTTGGTCCATGTCCAG 3´) would decrease the glioma cell viability. The expression vectors (pKv10.1-3hum_LI or a scramble control one pScramble, dose 0.2 µg) were transfected into glioma cells, with or without interferon gamma concurrent treatment (IFN- y, 25 ng/mL ) viability was determined by MTT assay. The association of the vector pKv10.1-3hum_LI and IFN- y decreased the glioma cell viability to 40.4%, which surpassed the results obtained from their isolate use, 16.0% and 11.4%, respectively (p<0.05). As pScramble showed no synergism with IFN- y we consider the pKv10.1-3hum_LI effects were sequence-specific. In conclusion, this study showed the ability of two unpublished siRNAs to knock-down hEag1. Our results are in agreement with previous data that established a role for Eag1 in the tumor cell viability. This role seems to be even more important during IFN-y injury. Regarding to biotechnology, this study presents an innovative treatment able to reduce the glioma cell viability, based on the association of shRNA expression vector to hEag1 and the immunomodulatory agent IFN- y.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Psicologia, Departamento de Processos Psicológicos Básicos, 2009. / Submitted by Washington da Silva Chagas (washington@bce.unb.br) on 2012-01-12T22:11:34Z No. of bitstreams: 1 2009_AlessandraMouraBradao.pdf: 816137 bytes, checksum: 8201136fbb1c299eca42cd5209d05985 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2012-01-19T18:39:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_AlessandraMouraBradao.pdf: 816137 bytes, checksum: 8201136fbb1c299eca42cd5209d05985 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-01-19T18:39:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_AlessandraMouraBradao.pdf: 816137 bytes, checksum: 8201136fbb1c299eca42cd5209d05985 (MD5) / Os efeitos da radiação ionizante sobre o comportamento mantido por contingências operantes são modulados por diferentes parâmetros, tanto da variável radiação (tipo de radiação, doses, fracionamento da dose e outros) quanto da variável comportamental (tipo de contingência, linha de base, complexidade da tarefa e outros). Do ponto de vista biológico, a variação circadiana também tem se mostrado um modulador dos efeitos da radiação. Entretanto, pouco se sabe sobre a interação de parâmetros temporais como moduladores de tais efeitos sobre o comportamento. Nesse sentido, o objetivo do presente trabalho consistiu em explorar o efeito de alguns parâmetros temporais como o horário da sessão experimental e o horário da irradiação como moduladores dos efeitos produzidos pela radiação ionizante sobre o comportamento mantido por contingências operantes. Doze ratos privados de alimento foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: (A) irradiação às 12h e sessão experimental às 8h; (B) irradiação à 0h e sessão experimental às 8h; (C) irradiação às 12h e sessão experimental às 16h; e (D) irradiação à 0h e sessão experimental às 16h. Após modelados para a resposta de pressão à barra, os sujeitos foram expostos a um esquema múltiplo de reforçamento em intervalo fixo de 60 segundos (FI 60 s) e intervalo variável de 60 segundos (VI 60 s). Posteriormente, os sujeitos foram expostos a doses de radiação ionizante de 4,5, 3,0 e 6,0 Gy com intervalo de cinco semanas entre as exposições, durante as quais foram mantidos sob o esquema múltiplo de reforçamento. Nas medidas taxa de respostas e reforços obtidos, os resultados mostraram uma relação dose-resposta, com maior redução quando da exposição à dose 6,0 Gy. Os resultados apontam para uma queda mais acentuada na taxa de respostas de pressão à barra para os sujeitos cuja sessão experimental ocorreu às 16h principalmente nas sessões realizadas 24 e 48 horas após a irradiação. Além disso, os sujeitos irradiados à 0h apresentaram uma maior redução nas taxas de pressão à barra se comparados a aqueles expostos à irradiação ionizante às 12h principalmente para a dose de 6,0 Gy. Para os mesmo sujeitos, o retorno aos níveis de linha de base foi mais lento. No que se refere à interação dos parâmetros temporais manipulados, observou-se uma intensificação dos efeitos dose-dependentes da radiação ionizante sobre o comportamento operante para os sujeitos cuja irradiação ocorreu à 0h e a sessão experimental ocorreu às 16h. Tais efeitos se mostraram mais pronunciados na sessão realizada 48 horas após a irradiação podendo ser observado 96 horas após a exposição à radiação ionizante. Ritmicidade circadiana do tecido hematopoiético e do trato gastrointestinal com maior radiossensibilidade no período noturno podem ter contribuído para os resultados apresentados. Os resultados obtidos replicam dados existentes na literatura, em relação a comportamentos operantes, e ampliam o conhecimento acerca da modulação de parâmetros temporais dos efeitos da radiação ionizante. __________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The effects of ionizing radiation on behavior maintained by operant contingencies are modulated by different parameters of the radiation variables (type of radiation, dose, dose fractioning and others) as well the behavioral variable (type of contingency, baseline, task complexity and others). From a biological standpoint, the circadian variation has also shown a modulator role on the effects of radiation. However, little is known about the interaction of temporal parameters as modulators of such effects on behavior. Thus, the purpose of this study was to explore the effect of some parameters, such as the time of the experimental session and time of irradiation as a modulator of the effects produced by ionizing radiation on the behavior maintained by operant contingencies. Twelve rats food deprived were randomly divided into four groups: (A) irradiation at 12:00 p.m. and experimental session at 08:00 a.m., (B) irradiation at 12:00 a.m. and experimental session at 08:00 a.m., (C) irradiation at 12:00 p.m. and experimental session at 04:00 p.m., and (D) irradiation at 12:00 a.m. and experimental session at 04:00 p.m.. After being shapped for bar pressing, the subjects were exposed to a multiple schedule of reinforcement of fixed interval of 60 s (FI 60 s) and variable interval 60-second (VI 60 s). Then, the subjects received doses of ionizing radiation of 4.5, 3.0 and 6.0 Gy with an interval of five weeks between exposures, during which period they were under the multiple schedule of reinforcement. With the measures of response rate and reinforcements obtained, the results showed a dose-response relation, with greater reduction after exposure to the dose of 6.0 Gy. The results point to a sharper decrease in the rate of bar pressing responses for those subjects whose experimental session occurred at 04:00 p.m. mainly at the experimental sessions 24 and 48 hours after irradiation. In addition, the subjects irradiated at 12:00 a.m. showed a greater reduction in bar pressing rates when compared to those exposed to ionizing radiation at 12:00 p.m., primarily to the dose of 6.0 Gy. For the same subjects, the return to the baseline levels was slower. With regard to the interaction of the temporal parameters manipulated, there was an intensification of the dose-response effects for those subjects whose irradiation session occurred at 12:00 a.m. and the experimental session occurred at 04:00 p.m.. These effects were more pronounced at the experimental session occurring 48 hours after irradiation and could be observed at 96 hours after the exposure to ionizing radiation. Circadian rhythm of the hematopoietic tissue and of the gastrointestinal tract with greater radiossensitivity during the night may have contributed to the results presented. The results replicate data in the literature in relation to operant behaviors and extend the knowledge about the modulation of temporal parameters on the effects of ionizing radiation on behavior.