Es wird eine Bioassay-Analyse von 168 Testsubstanzen gegenüber Tetrahymena pyriformis beschrieben. Mithilfe dieses In-vitro-Ansatzes konnte eine erste prognostische Aussage über die toxische Wirkung unbekannter Stoffe getroffen werden. Aus den Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen erfolgte eine Bestimmung der Toxizitätserhöhung gegenüber der Narkoselevel-Toxizität. Dadurch war eine mechanistische Interpretation der Wirkstärke der Fremdstoffe möglich. Die Wirkung der Fremdstoffe basiert auf direkten toxikologisch relevanten Reaktionsmechanismen mit nukleophilen Biomolekülen oder nach entsprechender enzymatischer Aktivierung und ermöglichte die Aufstellung von Strukturalarmen. Aus jeder Stoffklasse waren Vertreter direkt oder nach enzymatischer Biotransformation erhöht toxisch. Somit ist mithilfe der Ciliaten eine Vorhersage der direkten reaktiven Toxizität möglich. Zudem enthält es für eine metabolische Aktivierung bedeutsame Enzymsysteme. Damit ist es für eine prognostische Vorhersage der Toxizität unbekannter Stoffe anwendbar.

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec králové Department of Pharmaceutical Botany and Ecology Author: Lenka Nechanická Supervisor: RNDr. Jitka Vytlačilová, Ph.D. Title of diploma thesis: Antiprotozoal activity of natural substances The discovery of new active substances and plants with a potential antiprotozoal effect nowadays is the aim of many studies and is required for obtaining more active drugs in a number of protozoal disease. In this study was investigated antiprotozoal activity of extracts obtained from various plant parts Salvia officinalis, Apium graveolens L. var. rapaceum, Evodia rutaecarpa, Coptis chinensis, Zanthoxylum nitidum and Ziziphus jujuba. Effect of the tested extracts was evaluated in a typical unicellular organism Tetrahymena thermophila using MTT method. From the values obtained the percent inhibition was detected Tetrahymena thermophila and for each extract value calculated median inhibitory concentrations IC50. Of the extracts tested had the greatest antiprotozoal activity of the extract of C. chinensis, further extracts activity decreases in the order C. chinensis > Z. nitidum > Z. jujuba > S. officinalis > E. rutaecarpa > A. graveolens L. var. rapaceum Key words: antiprotozoal activity, Tetrahymena thermophila, cytotoxicity, natural substances

Within the cell nucleus, there are regions of highly condensed, transcriptionally silent chromatin called heterochromatin. Heterochromatin plays an important role in both chromosomal stability and gene regulation within the cell. Heterochromatin assembly is mediated by Heterochromatin Protein 1 (HP1) binding to epigenetically marked histone tails, most notably methylated H3K9. HP1 is post-translationally phosphorylated at serine and threonine residues, and this phosphorylation has been shown to increase HP1’s binding affinity for methylated H3K9 and heterochromatin formation. To study the effect of phosphorylation on heterochromatin assembly and HP1 localization within the nucleus, the unicellular protozoan Tetrahymena thermophila was used. Tetrahymena is an ideal model for this work because cells have a dynamic chromatin environment. Tetrahymena have an HP1-like protein, tHP1, which localizes to transcriptionally silent chromatin bodies within the otherwise transcriptionally active macronucleus. tHP1 is known to be phosphorylated at threonine-64 (site one) and at either serine-102 or threonine-103 (site two). Previous work shows that when phosphorylation at both sites is prevented, tHP1 exhibits decreased localization to chromatin bodies. In order to determine which site of phosphorylation accounts for tHP1’s localization to regions of heterochromatin, mutant proteins that allow phosphorylation at only one of the two sites were generated. The efforts to engineer a mutant protein that cannot be phosphorylated at site two and to visualize the protein’s localization throughout cell development are discussed. When phosphorylation is prevented at site two, tHP1 localization to regions of heterochromatin remains intact. These results suggest that phosphorylation at site one, not site two, may be responsible for tHP1 localization to macronuclear chromatin bodies. A mechanism by which site one phosphorylation influences tHP1 targeting to regions of heterochromatin is proposed. Furthermore, bioinformatics techniques are employed to identify other tHP1-like proteins within Tetrahymena. Characterization of these proteins will likely contribute to a more complete model of how heterochromatin is assembled in Tetrahymena.

Chromatin is the combination of DNA and proteins in the nucleus that is used to aid in the compaction of DNA. Histones are a group of proteins used to condense DNA by forming a complex (nucleosome) around which DNA wraps around; there are two of each type of histone in a nucleosome: H2A, H2B, H3 and H4. Once the DNA is wrapped around the histones, the genome is further compacted. A shortened, "clipped" version of histone H3 has been found in some organisms including yeasts, flies, mammalian stem cells, and the ciliated protozoan, Tetrahymena thermophila. In each organism, clipping occurs at a different site on the N-terminus, usually before an alanine residue. Clipping is important as it may affect other epigenetic modifications and gene regulation in cell differentiation, but the regulation of this histone proteolysis has remained largely unstudied. In Tetrahymena thermophila, approximately half of the histone H3 molecules are clipped between residues 6 and 7 on histone H3, solely in the transcriptionally silent micronucleus. The histones in the micronuclei are deacetylated, while histones in the macronuclei can be acetylated or deacetylated. It is hypothesized that the post-translational acetylation modification to the histone tails may inhibit histone H3 clipping. Immunoblot analyses were carried out with acetylated and deacetylated micronuclei, demonstrating an increase of clipping when acetylated. Additionally, mutations were created at lysine 9 upstream of the clip site on the histone H3 tails to mimic acetylation and deacetylation to study whether the modification of that site has a regulatory effect.

Thesis (M.S.)--Tennessee Technological University, 2009. / Title from title page screen (viewed on Aug. 26, 2009). Bibliography: leaves 40-45.

Universiẗat, Diss., 2004--Bonn.

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Zur Bestimmung der toxizitätsrelevanten Thiolreaktivität wurde ein Chemoassay mit dem Modellnukleophil 4-Nitrothiophenol (NBT) entwickelt. Es wurden die Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten kNBT für insgesamt 145 Verbindungen aus verschiedenen Stoffklassen bestimmt. Ein Modell zur Berücksichtigung der Flüchtigkeit der Elektrophile bei der Berechnung von kNBT wurde entwickelt. Außerdem wurde der Einfluss des pH-Werts auf die Thiolreaktivität unter reaktionsmechanistischen Gesichtspunkten diskutiert. Die NBT-Reaktivität wurde mit der Reaktivität gegenüber anderen toxizitätsrelevanten Nukleophilen verglichen. Zur Einordnung der Thiolreaktivität in den toxikologischen Zusammenhang wurden die Korrelationen zwischen kNBT und ausgewählten toxikologischen Endpunkten betrachtet. Am Beispiel der aquatischen Toxizität im Bioassay mit Tetrahymena pyriformis konnten stoffklassenspezifische Modelle zur Beschreibung der absoluten Toxizität log EC50 und der Toxizitätserhöhung log Te mit guter bis sehr guter Vorhersagekraft abgeleitet werden.

Im Rahmen der EU-Richtlinie REACH müssen industrierelevante Chemikalien bezüglich des Risikos für Mensch und Umwelt (neu) untersucht und bewertet werden, wobei die Anzahl an Tierversuchen zu minimieren ist und neue toxikologische Prüfmethoden, Bewertungsstrategien sowie alternative Testsysteme entwickelt und optimiert werden sollen. Ubiquitär vorkommende Testorganismen, welche ähnliche Eigenschaften und eine vergleichbare Sensitivität bezüglich äußerer Einflüsse wie komplexere Organismen (Fisch, Säugetier, Mensch) besitzen, sind hier besonders gefragt um die Belastung abzuschätzen und Trendaussagen über die Wirkung zu formulieren. Durch den Einsatz vieler dieser Testorganismen sowie durch die Ermittlung der chemischen Reaktivität und der Strukturmerkmale einer Verbindung kann ein globales Bild über die Wirkung erhalten werden. Ein Organismus, der diese Charakteristika aufweist, ist der eukaryotische Einzeller Tetrahymena pyriformis GL. In der vorliegenden Dissertation wird zum einen die jeweilige Toxizität elektrophiler Substanzen unterschiedlicher Stoffklassen und Reaktions-mechanismen (α,β-ungesättigte Carbonyl- und Carboxylverbindungen, heterozyklische Drei- und Vierringe, α-halogenierte Carbonyle, Harnstoffe und Thioharnstoffe, aromatische Disulfide sowie aliphatische und aromatische Nitroverbindungen) nach den Expositionszeiten 24 h, 48 h und 72 h mit Hilfe eines etablierten Wachstumshemmtests (Müller, 2001) bestimmt und Struktur-Toxizitäts-Beziehungen bzw. Strukturalarme abgeleitet. Neben der methodischen Optimierung werden die substanzspezifischen Eigenschaften, Flüchtigkeit und Sorptionsfähigkeit, quantitativ erfasst und durch neu aufgestellten Modellgleichungen für jede Substanz ermittelt. Mit der Bestimmung der Toxizitätserhöhung, Te, welche auch als ein Maß für die Reaktivität angesehen werden kann, werden Organismen-spezifische Narkose-Basis-Geraden generiert, exzesstoxische Verbindungen identifiziert und Strukturalarme für die jeweiligen Stoffklassen aufgestellt. Zum anderen werden binäre Mischungen untersucht, welche aus den Einzelstoffen bestehen, deren Toxizität im ersten Abschnitt der Arbeit ermittelt wurden und bei denen theoretische Annahmen über die Reaktionsmechanismen bestehen. Dieser Abschnitt identifiziert, ob gleiche bzw. unähnliche primäre Wechselwirkungen zweier Substanzen mit den biologischen Targets vorliegen und welcher Mechanismus, der reaktive Mechanismus exzesstoxischer Substanzen oder die Wechselwirkungen mit Membran-Bestandteilen, dominierend ist. Für die Auswertung der Mischungsergebnisse werden die etablierten biometrischen Modelle Konzentrations-Additivität und Unabhängigen Wirkung verwendet. Es wird dargestellt, dass die Mischungstoxizitäten der binären Mischungen ähnlich wirkender Substanzen zwar relativ genau mithilfe beider Modelle berechnet werden, jedoch keine eindeutige Charakterisierung der Mechanismen möglich ist. Die Ergebnisse der untersuchten binären Mischungen unterschiedlich wirkender Substanzen zeigen dagegen, dass die Mischungstoxizitäten unähnlicher Substanzen relativ genau mithilfe des Modells der Unabhängigen Wirkung berechnet werden und eine Charakterisierung der Mechanismen möglich ist.