Submitted by Maria Anália Conceição (marianaliaconceicao@gmail.com) on 2016-06-27T18:14:05Z No. of bitstreams: 1 Publico-NOVO-19.pdf: 3346874 bytes, checksum: 17dd5440a6491e9f9e098ed990f9a67e (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Anália Conceição (marianaliaconceicao@gmail.com) on 2016-06-27T18:14:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Publico-NOVO-19.pdf: 3346874 bytes, checksum: 17dd5440a6491e9f9e098ed990f9a67e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-27T18:14:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Publico-NOVO-19.pdf: 3346874 bytes, checksum: 17dd5440a6491e9f9e098ed990f9a67e (MD5) Previous issue date: 2015 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Rede Ibero-Americana de Biofabricação / Introdução: A aplicação de dexametasona em cultura de células mesenquimais induz diferenciação osteoblástica, consequentemente formação de tecidos mineralizados. A Engenharia Tecidual propõe o desenvolvimento de estratégias terapêuticas direcionadas à regeneração funcional e estrutural de tecidos biológicos. Nesse sentido, a caracterização celular in vitro é fundamental para garantir o desenvolvimento destas técnicas. Objetivo: Avaliar o efeito da dexametasona administrada como medicação pré-operatória na cultura de células primárias de polpa dental humana. Métodos: Foram utilizadas células provenientes da polpa de terceiros molares. Essas foram distribuídas em dois grupos experimentais com dois protocolos de medicação pré-operatória utilizados em rotina odontológica, onde no protocolo B, o paciente ingeria 1 comprimido de dexametasona 1hora antes à cirurgia e no A não. A avaliação da proliferação, viabilidade e diferenciação, foram pelos testes Trypan Blue, MTT, Von Kossa e Alizarin Red respectivamente, e realizadas em intervalos fixados. Análise de variância de Friedman e t test foram aplicados, fixando em 95% de confiança. Resultados: As células pertencentes ao protocolo A atingiram pico de proliferação aos 21 dias de cultura enquanto as células do protocolo B em 14. Células do protocolo A foram estatisticamente mais viáveis aos 7 e 21 dias enquanto as do protocolo B, aos 14. Na análise de Von Kossa e Alizarin Red observou-se que as células pertencentes ao protocolo B formaram nódulos de calcificação desde 7 dias de cultura enquanto no A aos 14. Conclusão: A utilização da dexametasona como medicação pré-operatória em cirurgia de terceiros molares promove diferenciação celular precocemente, quando observada in vitro. / Introduction: The use of dexamethasone in mesenchymal cell culture induces osteoblastic differentiation and, consequently, formation of mineralized tissues. Tissue Engineering proposes the development of therapeutic strategies aiming at structural and functional regeneration of biological tissues. In this sense, cell characterization in vitro is critical to ensure the development of such techniques. Objective: To evaluate the effect of dexamethasone administered as preoperative medication in primary cell culture of human dental pulp. Methods: We used cells from the third molar pulp. These cells were divided into two experimental groups, each with two preoperative medication protocols used in dental routine and differentiated by the intake of dexamethasone in one of them. The assessment of proliferation, differentiation, and viability through Trypan Blue, MTT and von Kossa, and Alizarin Red tests, respectively, were held in fixed intervals. Friedman analysis of variance and t test were applied, and confidence interval was set at 95%. Results: Protocol A cells proliferation reached its peak on day 21 while protocol B cells proliferation reached its peak on day 14. Protocol A cells were statistically more viable between days 7 and 21 whereas protocol B cells viability was higher on day 14. Von Kossa and Alizarin Red analyses showed that calcified nodules formation occurred from the seventh day of cell culture in protocol B cells and on day 14 in protocol A cells. Conclusion: The use of dexamethasone as preoperative medication in third molar surgery promotes cell differentiation earlier, when observed in vitro. / FAPESP: 07/51227-4 / FAPESP: 08/57860-3 / CNPq: 573661/2008-1

Submitted by Maria Anália Conceição (marianaliaconceicao@gmail.com) on 2016-06-27T19:41:41Z No. of bitstreams: 1 Publico-NOVO-21.pdf: 2987989 bytes, checksum: fedc0b7588511ac9f1b74f18e86aed33 (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Anália Conceição (marianaliaconceicao@gmail.com) on 2016-06-27T19:42:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Publico-NOVO-21.pdf: 2987989 bytes, checksum: fedc0b7588511ac9f1b74f18e86aed33 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-27T19:42:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Publico-NOVO-21.pdf: 2987989 bytes, checksum: fedc0b7588511ac9f1b74f18e86aed33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Agência Brasileira de Cooperação (ABC) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Rede Ibero-Americana de Biofabricação / Introdução: A Engenharia Tecidual (ET) é uma ciência multidisciplinar que visa produzir órgãos e partes humanas substitutas acometidas por lesões traumáticas, doenças degenerativas ou agenesias. Uma das suas etapas é a produção de arcabouços biocompatíveis para aplicação na Medicina Regenerativa. Estas estruturas são conhecidas como scaffolds, que apresentam macrogeometria semelhante ao tecido original, em textura e porosidade e direcionam o comportamento das células que serão semeadas. A recuperação da integridade anatômica e funcional de tecidos lesados garante a sobrevivência dos seres vivos e o tratamento de perdas extensas é desafiador. Objetivo: Avaliar a eficiência para desmineralizar e descelularizar dentes viabilizando-os como scaffolds naturais. Métodos: As amostras foram submetidas a um tratamento com soluções desmineralizadoras/descelularizadoras. Foram usadas 5 soluções: G1-Formol 10% controle, EDTA 28% para desmineralização nos quatro grupos; G2- hipoclorito de sódio 2,5%; e G3-peróxido de hidrogênio 9%; G4- hipoclorito de sódio 2,5% associado com detergente enzimático; G5- detergente enzimático associado a peróxido de hidrogênio 9%. A evolução da desmineralização e descelularização foi acompanhada durante 12 semanas, por meio de pesagem, técnicas analíticas MEV (Microscopia eletrônica de Varredura), fotografia e radiografia. As amostras foram pesadas a cada sete dias para controle da perda de mineral. Os resultados receberam análise estatística de variância de Friedman, Kruskal-Wallis, Resumo xix Teste do Quiquadrado e Teste exato de Fisher. Foi fixado em 0,05 ou 5% o nível de rejeição da hipótese de nulidade. Conclusão: O grupo 5 mostrouse microscopicamente a melhor solução, mesmo mantendo em 30% das amostras resíduos biológicos. / Tissue Engineering (TE) is a multidisciplinary science that aims to produce replacement organs and parts affected by trauma, degenerative diseases or agenesis. One of its goals is to produce biocompatible scaffolds for application in regenerative medicine. These structures are known as scaffolds, presenting three-dimensional shape similar to the original tissue in texture and porosity and directing the behavior of cells to be seeded. The recovery of anatomical and functional integrity of damaged tissues ensures the survival of living beings and the treatment of extensive losses is challenging. Objective: Get decelullarized and demineralized teeth to make them feasible as natural scaffolds. Methods: The samples will be subjected to a treatment with demineralizing/decelularizing solutions. 4 different solutions were used (14% EDTA, 2.5% sodium hypochlorite, hydrogen peroxide and 9% and one group of control (10% formaldehyde). The evolution of demineralization/decellularization was monitored for 90 days through the use of electron scanning microscopy, X-ray and photography. Samples’ weights were measured each seven days to control the mineral loss. Results were subjected to statistical analysis of variance, KruskalWallis test Wilcoxan and Chi-square Test. Was fixed at 0,05 or 5% rejection level of the null hypothesis. / FAPESP: 07/58856-7 / FAPESP: 07/59488-1 / FAPESP: 07/51227-4 / CNPq: 573661/2008-1 / FAPESP: 08/57860-3

O avanço da ciência regenerativa está se comprometendo com a busca de novas opções terapêuticas no combate as diversas doenças e disfunções orgânicas. Nessas avançadas linhas de pesquisas, as células-tronco são um símbolo dessa evolução. A variedade da aplicação deste novo e experimental método de tratamento está sendo utilizado, pela bioengenharia, para reparar tecidos e órgãos lesados. Defeitos ósseos extensos ocorrem após diversos tipos de injúrias ao esqueleto facial, como traumas faciais, ressecções por lesões agressivas e malformações congênitas. Essas sequelas são tratadas, preferencialmente, através da reconstrução utilizando enxertos ósseos de origem autógena. Entretanto, às desvantagens proporcionadas pela obtenção do tecido ósseo autógeno, lançaram um dos maiores desafios, da bioengenharia que é a busca pelo aprimoramento dos substitutos ósseos. Nesse caminho do aprimoramento dos biomateriais a adição de células-tronco mesenquimais representam a possibilidade da criação de um sinergismo, entre as células e o arcabouço, para otimizar a osteogênese. Nessa linha, esse estudo propõe-se a avaliar o reparo ósseo em estudo experimental, em modelo animal, através do tratamento de defeito ósseos criados em fêmures de ratos. A amostra dessa pesquisa foi composta de 96 ratos albinos da espécie Rattus novergicus albinus, linhagem SHR (Spontaneously Hypertensive Rats), isogênicos. Os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos de acordo com o tipo de tratamento (Grupo I: α – TCP + ADSCs; Grupo II: α – TCP + ADSCs/ENDO; Grupo III: α – TCP; Grupo IV). A cultura de células tronco tiveram como tecido de origem o tecido adiposo da região abdominal e as células endoteliais formam coletadas da medula óssea. A peças foram avaliadas em 03 períodos de tempo diferentes (07, 14 e 21 dias). A histomorfometria avaliou a área de neoformação óssea dos defeitos bem como a imunohistoquímica com marcação para a proteína VEGF avaliou a eficácia da adição das células endoteliais. Os resultados demonstraram, através dos testes estatísticos que houve uma diferença estatisticamente significante, no reparo ósseo, favorecendo os tratamentos dos defeitos que utilizaram a terapia celular e a vascularização foi também otimizada no grupo que foi tratado com a adição das células endoteliais. Dessa forma conclui-se que nesse modelo de estudo a utilização das ADSCS foram capazes de otimizar o reparo ósseo. / The regenerative medicine has been searching for a new therapeutic options to manage diseases and also organic dysfunctions. The advanced research fields, has enrolled the stem cells to achieve the upgrade in the new treatment objectives. The bioengineering is application of this new and experimental, treatment method to repair damaged tissues and organs using the stem cells, includes the possibility to acelerating and improving the bone repair process. The autogenous bone graft has been considered the gold standart graft material to reconstruction the bone defects, fundamentally because of the osteogenic potential. However, the harvest disadvantages autogenous bone tissue leads to the search for bone substitutes improvement. In this field a promising alternative has been proposed by tissue engineering. The totipotent cells, also called mesenchymal stem cells, which has the cellular plasticity ability, is associated with biomaterials, creating a synergy, between these cells and the scaffold, to optimize the osteogenesis. The tissue engineering application to tissue repair has been extensively researched with the aim of proposing more reliable and more efficient clinical methods. Although the effects of the use of adult stem cells are well known in bone marrow transplants, in some areas, such as bone repair, there is still lack of scientific data. This research was conducted, in animal model, to assessment bone repair in created femural bone defects treated with mesenchymal stem cells. 96 animals (Rattus novergicus albinus - Spontaneously Hypertensive Rats) were randomly divided into four groups (Group I: α - TCP + ADSCs, Group II: α - TCP + ADSCs/Endo, and Group III: α - TCP; (07, 14 and 21 days). The histological sections were stained in H&E and the histomorphometry was used to evaluated the new bone formation area in the defects and also the immunohistochemical expression of VEGF was analysed. Our results suggest that the combination of ADSCs and the scaffold was able to enhance the bone repair in this study model.

Vascularization is essential for living tissue and remains a major challenge in the field of tissue engineering. A lack of a perfusable channel network within a large and densely populated tissue engineered construct leads to necrotic core formation, preventing fabrication of functional tissues and organs. While many approaches have been reported for forming vascular networks, including materials processing techniques, such those involving lithography, bioprinting, and sacrificial templating; and cell-based approaches, in which cellular self-organization processes form vessels; all are deficient in their ability to form a vessel system of sufficient complexity for supporting a large cellular construct. What is missing from the literature is a method for forming a fully three-dimensional vascular network over the full range of length-scales found in native vessel systems, which can be used alongside cells and perfused with fluids to support their function. A large number of research groups are thus pursuing novel methods for fabricating vascular systems in order that new tissues and organs can be fabricated in the lab. In this project, a 3D printing-based approach was used to form vascular networks which are hierarchical, three-dimensional, and perfusable. This was performed in thick, cellularized hydrogels similar in composition to native tissue; these being collagen (ECM-like) and fibrin (woundlike), both of which are highly capable of supporting cellular activities, such as cell seeding, cell spreading, and capillary morphogenesis. In order to make use of 3D printed network templates in cellularized hydrogel environments, it was necessary to develop a new approach in which standard 3D printed materials were converted into a gelatin template, via an alginate intermediary, which can be removed quickly in physiologic conditions and which does not reduce cell viability. This multi-casting approach enables a hierarchical channel network to be formed in three-dimensions, capable of being perfused with cell medium to maintain the viability of a cell population, thereby addressing the fundamental problem. Using standard cell staining and immuno-histochemistry techniques, we showed good endothelial cell seeding and the presence of tight junctions between the channel endothelial cells. When fibroblasts were seeded into the bulk of the hydrogel, a high degree of cell viability and cell spreading was observed when a threshold flow rate is met. By counting the number of live and dead cells in a sample regions of the gel, we were able to show a dependency of cell viability upon the perfusion flow rate and further determine a regime in which the vast majority of cells are alive and spreading. This data informs future cellular experiments using this platform technology. The limits of existing 3D printing technology meant that the micro-scale vasculature needed to be formed by other means. Cellular co-culture of endothelial and stromal cell types has been shown to be capable of forming capillary-like structures in vitro. For inclusion with the 3D printed channel system, we investigated the use of an angiogenic method for capillary formation, using multi-cellular spheroids, and a vasculogenic approach, using individual cells, in order that the full vascular system could be constructed. Endothelial and mesenchymal stromal cells were encapsulated in small fibrin and collagen gels and maintained under static culture conditions in order to form capillaries by the above approaches. The aim here was to find a particular gel composition and cell concentration which would support capillary morphogenesis while being suitably robust to handle the mechanical stresses associated with perfusion. As future work, the next step will be to incorporate the vasculogenic co-culture technique, used to form capillary-sized vessels, into a perfusable gel containing the large templated channels, formed via the multi-casting approach. The challenge here is to anastomose the capillary-sized vessels to the large templated channels and thereby enable perfusion of the capillary vessels. This step would be a highly significant development in the field as it would mean large constructs could be fabricated with physiological densities of cells, which could lead to a range of potential therapeutic applications.

Made available in DSpace on 2016-04-01T17:54:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-31. Added 1 bitstream(s) on 2016-04-01T18:00:34Z : No. of bitstreams: 1 000860768.pdf: 1686526 bytes, checksum: 979e2944f4a6b89a46fd9bb6b0302204 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi avaliar a função da via de sinalização Wnt/β- catenina através dos receptores LRP6 e Frizzled6 na diferenciação de células-tronco de polpa dental de dentes permanentes (DPSC) em células endoteliais. DPSC foram transduzidas com marcadores eGFP e vetores lentivirais shRNA (LRP6, Frizzled6 ou vetor vazio - controle) para os experimentos. Os testes in vitro avaliaram a expressão de GSK3-β e β- catenina por western blot na presença de rhWnt1 e rhVEGF165 e de VEGF e CXCL-8 (IL-8) por ELISA. A expressão de marcadores endoteliais (western blot e PCR) e formação de túbulos capilares foram analisados após a diferenciação endotelial das DPSCs. In vivo, fatias dentárias/matrizes condutivas semeadas com DPSCs-shRNA foram implantadas em subcutâneo de dorso de camundongos imunodeprimidos por 28 dias e o número de vasos sanguíneos foi determinado por imunohistoquímica para eGFP e coloração por HE. β-catenina ativa foi mais expressa em shRNA-LRP6 e shRNA-Frizzled6 que nas células controle, e sua expressão aumentou com a suplementação com rhVEGF165 e rhWnt1. A expressão de GSK3-β fosforilado foi menor, porém também aumenta ou permanece estável com rhVEGF165 ou rhWnt1. Quanto à expressão de VEGF, em shRNA-Frizzled6 foi maior que nas células controle e em shRNA-LRP6 (p<0,05), enquanto que a expressão de IL8 foi menor em shRNA-LRP6, diferindo estatisticamente das outras células. A expressão dos marcadores endoteliais CD31 e VEGFR2 diminuiu nas células shRNA-LRP6, enquanto que em shRNAFrizzled6 a expressão de VEGFR2 foi aumentada. A formação de túbulos capilares de shRNA-Frizzled6 e shRNA-LRP6 foi menor quando comparado ao controle, porém shRNA-Frizzled6 obteve uma tendência de aumento na proliferação de capilares em 144h. In vivo, DPSC-shRNALRP6 apresentou menor número de capilares formados quando comparados com as outras duas... / The aim of this study was to evaluate the function of Wnt/β-catenin signaling through LRP-6 and Frizzled-6 receptors in the differentiation of dental pulp stem cells from permanent teeth (DPSC) into endothelial cells. DPSC were transduced with EGFP-tagged lentiviral shRNA vectors (LRP6, Frizzled6 or empty vector - control) for experiments. In vitro assay evaluated GSK3-β and β-catenin expression by western blot in rhWnt1 and rhVEGF165 presence, and VEGF and CXCL-8 (IL-8) expression by ELISA. Endothelial markers expression (western blot and PCR) and tube formation were analyzed after endothelial differentiation of DPSCs. In vivo, tooth slices/scaffolds seeded with transduced DPSCs were implanted subcutaneously in back of immunodefficient mice and blood vessels were counted per immunohistochemistry for eGFP and HE staining. Active β- catenin was more expressed in shRNA-LRP6 and shRNA-Frizzled6 than in control cells, and increased with rhVEGF165 and rhWnt1 supplementation. Phosphorylated GSK3-β expression was lower, however also increased or maintained with rhVEGF165 or rhWnt1. VEGF expression was higher in shRNA-Frizzled6 than in control and shRNA-LRP6 (p<0,05), IL8 expression was lower in shRNA-LRP6, with statistically difference of the others cells. Endothelial markers CD31 and VEGFR2 expression decreased in shRNA-LRP6, but VEGFR2 expression increased in shRNAFrizzled6. shRNA-Frizzled6 and shRNA-LRP6 tube formation was lower when compared to control, however shRNA-Frizzled6 had tendency to increase proliferation in 144h. In vivo, shRNA-LRP6 showed fewer blood vessels formed than other cells (p<0,05). Collectively, the results of this study suggest that Wnt/β-catenin signaling regulates endothelial differentiation of DPSC through LRP6

O avanço da ciência regenerativa está se comprometendo com a busca de novas opções terapêuticas no combate as diversas doenças e disfunções orgânicas. Nessas avançadas linhas de pesquisas, as células-tronco são um símbolo dessa evolução. A variedade da aplicação deste novo e experimental método de tratamento está sendo utilizado, pela bioengenharia, para reparar tecidos e órgãos lesados. Defeitos ósseos extensos ocorrem após diversos tipos de injúrias ao esqueleto facial, como traumas faciais, ressecções por lesões agressivas e malformações congênitas. Essas sequelas são tratadas, preferencialmente, através da reconstrução utilizando enxertos ósseos de origem autógena. Entretanto, às desvantagens proporcionadas pela obtenção do tecido ósseo autógeno, lançaram um dos maiores desafios, da bioengenharia que é a busca pelo aprimoramento dos substitutos ósseos. Nesse caminho do aprimoramento dos biomateriais a adição de células-tronco mesenquimais representam a possibilidade da criação de um sinergismo, entre as células e o arcabouço, para otimizar a osteogênese. Nessa linha, esse estudo propõe-se a avaliar o reparo ósseo em estudo experimental, em modelo animal, através do tratamento de defeito ósseos criados em fêmures de ratos. A amostra dessa pesquisa foi composta de 96 ratos albinos da espécie Rattus novergicus albinus, linhagem SHR (Spontaneously Hypertensive Rats), isogênicos. Os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos de acordo com o tipo de tratamento (Grupo I: α – TCP + ADSCs; Grupo II: α – TCP + ADSCs/ENDO; Grupo III: α – TCP; Grupo IV). A cultura de células tronco tiveram como tecido de origem o tecido adiposo da região abdominal e as células endoteliais formam coletadas da medula óssea. A peças foram avaliadas em 03 períodos de tempo diferentes (07, 14 e 21 dias). A histomorfometria avaliou a área de neoformação óssea dos defeitos bem como a imunohistoquímica com marcação para a proteína VEGF avaliou a eficácia da adição das células endoteliais. Os resultados demonstraram, através dos testes estatísticos que houve uma diferença estatisticamente significante, no reparo ósseo, favorecendo os tratamentos dos defeitos que utilizaram a terapia celular e a vascularização foi também otimizada no grupo que foi tratado com a adição das células endoteliais. Dessa forma conclui-se que nesse modelo de estudo a utilização das ADSCS foram capazes de otimizar o reparo ósseo. / The regenerative medicine has been searching for a new therapeutic options to manage diseases and also organic dysfunctions. The advanced research fields, has enrolled the stem cells to achieve the upgrade in the new treatment objectives. The bioengineering is application of this new and experimental, treatment method to repair damaged tissues and organs using the stem cells, includes the possibility to acelerating and improving the bone repair process. The autogenous bone graft has been considered the gold standart graft material to reconstruction the bone defects, fundamentally because of the osteogenic potential. However, the harvest disadvantages autogenous bone tissue leads to the search for bone substitutes improvement. In this field a promising alternative has been proposed by tissue engineering. The totipotent cells, also called mesenchymal stem cells, which has the cellular plasticity ability, is associated with biomaterials, creating a synergy, between these cells and the scaffold, to optimize the osteogenesis. The tissue engineering application to tissue repair has been extensively researched with the aim of proposing more reliable and more efficient clinical methods. Although the effects of the use of adult stem cells are well known in bone marrow transplants, in some areas, such as bone repair, there is still lack of scientific data. This research was conducted, in animal model, to assessment bone repair in created femural bone defects treated with mesenchymal stem cells. 96 animals (Rattus novergicus albinus - Spontaneously Hypertensive Rats) were randomly divided into four groups (Group I: α - TCP + ADSCs, Group II: α - TCP + ADSCs/Endo, and Group III: α - TCP; (07, 14 and 21 days). The histological sections were stained in H&E and the histomorphometry was used to evaluated the new bone formation area in the defects and also the immunohistochemical expression of VEGF was analysed. Our results suggest that the combination of ADSCs and the scaffold was able to enhance the bone repair in this study model.

A bioengenharia de tecidos baseia-se no uso de moléculas bioativas, células-tronco e biomateriais para reparação de tecidos e/ou órgãos. Biomateriais podem ser classificados de acordo com sua origem em sintéticos ou biológicos. Biomateriais biológicos podem ser produzidos por decelularização, que visa a remoção de células da matriz extracelular (MEC), a qual deve manter sua integridade química e física. Placentas são órgãos de grande interesse na bioengenharia de tecidos visto que são descartadas após o parto e possuem grande volume de matriz extracelular. Métodos de decelularização podem ser classificados em químicos, físicos e enzimáticos. Todos conhecidamente causam alterações na MEC, sendo que a associação deles é comumente utilizada. Este trabalho comparou diferentes protocolos e estabeleceu um método mais favorável para a decelularização de placentas caninas, visando a produção de um biomaterial para futuras aplicações clínicas. Inicialmente ambas as porções - materna e fetal - das placentas foram submetidas à 10 protocolos, que avaliaram variáveis como concentração e tempo de incubação em detergentes, diferentes gradientes de temperatura e a influência da perfusão versus imersão das soluções, na MEC remanescente. Com base na transparência do tecido e na ausência de núcleo celular em cortes histológicos, dois protocolos foram selecionados (I e II). Além dos critérios já mencionados, ambos os protocolos foram comparados quanto à quantidade de DNA remanescente na MEC decelularizada e à permanência e distribuição de algumas das proteínas da matriz. O detergente SDS foi o mais eficaz na remoção de células, embora não tenha sido suficiente para promover uma decelularização tecidual completa. O congelamento prévio das placentas requereu um maior tempo de incubação posterior das amostras nos distintos detergentes. Ambos métodos de perfusão e imersão foram eficazes na remoção das células, embora grande concentração de proteínas do citoesqueleto tenham permanecido retidas na matriz. As amostras processadas pelo protocolo I (SDS 1%, 5mM EDTA &#43; 50mM TRIS &#43; 0,5% antibiótico, e Triton X-100 1%) apresentaram maior preservação da organização estrutural da MEC quando comparadas àquelas processadas de acordo com o protocolo II (que diferiu do anterior pela utilização de solução contendo 0,05% tripsina ao invés de 50mM TRIS), esse último método entretanto foi o que melhor removeu as células das placentas, conforme observado em lâminas histológicas e demonstrado pela menor concentração de DNA. Tanto as porções materna quanto fetal submetidas à ambos protocolos, mantiveram as proteínas laminina, fibronectina e colágeno tipo I. O colágeno tipo III foi observado somente na porção fetal. Conclui-se que o protocolo II foi o mais eficaz no processo de decelularização de placentas caninas tendo promovido a remoção do conteúdo celular e diminuição da concentração de DNA na MEC remanescente. No entanto é necessário otimizar o tempo de incubação das placentas em soluções enzimáticas visando maior conservação do arranjo da matriz decelularizada. A análise da capacidade da MEC decelularizada por tal método para ser utilizada em bioengenharia de tecidos ainda deve ser avaliada in vitro e in vivo / Tissue engineering is based on the use of bioactive molecules, stem cells and biomaterials to repair tissues and/organs. Biomaterials can be classified according to their origin in synthetic or biological. Biological biomaterials can be produced by decellularization wich aims at removing cells from the extracellular matrix (ECM), while maintain its chemical and physical integrity. Placentas are organs of great interest in tissue engineering due to the fact that they are discarded after birth and present large amount of ECM. Decellularization methods can be classified into chemical, physical and enzymatic. All of them are known to cause changes on ECM; thus their association has been commonly used. This study compared different protocols and established a more favorable method for decellularization of canine placentas, aiming at the production of a biomaterial for clinical applications. Initially both placental portions maternal and fetal were subjected to ten different protocols that evaluated variables such as concentration and time of incubation in detergents, different temperatures and the influence of perfusion versus immersion of solutions in the remaining ECM were analysed. The analysis of tissue transparence and absence of cellular nuclei in histological slices stained with HE, led to selection of two protocols (I and II). Besides the before mentioned criteria, both protocols were compared according to the amount of DNA that remained in the ECM decelullarized and the distribution of some ECM proteins. SDS was the most effective detergent for cell removal although it was not enough to complete decellularization. The freezing of placentas led to larger periods of samples incubation in different detergents. Both perfusion and immersion methods were capable of removing cells, although large concentration of cytoskeletal proteins remained entrapped in the matrix. Samples subjected to protocol I (1% SDS, 5 mM EDTA &#43; 50 mM TRIS &#43; 0,5% antibiotic, and 1% Triton X-100) better preserved the structural organization of ECM when compared to those subjected to protocol II (wich differed from the first by the use of 0,05% trypsin instead of 50mM TRIS). However, protocol II optimized cell removal as observed in histological slices and decreased the DNA concentration. Both maternal and fetal portions, subjected to both protocols, retained the laminin, fibronectin and collagen type I proteins. Collagen type III was identified only in fetal portion. In conclusion, protocol II was more effective in the decellularization of canine placentas than protocol I; it removed cellular content and decrease the concentration of remaining DNA in remaining ECM. The ability of ECM decellularized by such method to be applied in tissue engineering strategies still need to be evaluated in vitro and in vivo

Orientadores: Marcos Akira d'Ávila, Cecília Amélia de Carvalho Zavaglia / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Mecânica / Made available in DSpace on 2018-08-18T04:11:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ramos_SergioLopesFernandes_M.pdf: 1999649 bytes, checksum: 3668df0532fba5829156d8937f7ba8be (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O uso e pesquisa do polímero Policaprolactona (PCL) como biomaterial vem sendo amplamente difundido nas últimas décadas. Sua capacidade de interagir com o organismo, propriedades mecânicas e capacidade de reabsorção são as principais características que levaram a escolha deste material para o desenvolvimento de uma estrutura que aja como suporte celular para uso em Engenharia Tecidual. Neste trabalho, o objetivo foi produzir e caracterizar membranas de PCL obtidas pelo processo de eletrofiação ou "electrospinning". Este processo, que utiliza uma diferença de potencial para extrair "fios" a partir de uma solução polimérica eletricamente carregada, é relativamente novo e versátil, sendo capaz de produzir redes macrométricas a partir de um emaranhado de "fios" que variam de diâmetros nano até micrométricos. As amostras foram devidamente analisadas e caracterizadas utilizando Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC), Termogravimetria (TG), Infravermelho por Transformada de Fourrier (FTIR), Análise Dinâmico Mecânica (DMA) e ensaio in vitro com células tronco mesenquimais de tecido adiposo (MSCs). As membranas exibiram propriedade de biocompatibilidade, o que levou à crer que a porção de solvente utilizada para fabricação dos fios foi eliminada, possibilitando adesão, penetração e proliferação celular através da estrutura / Abstract: The Policaprolactone polymer has been widely investigated as cellular support for tissue engineering purposes. Its biocompatibility, adequate mechanical properties and resorption capability are the main aspects that has led to the choice of this material for a possible use as tissue engineering scaffolds. In this work, the objective was to prepare and characterize PCL non-woven fibrous networks obtained through the electrospinning process. This process, which uses electrical potential in order to extract fibers from a electrically charged polymer solution is relatively new and versatile, being capable to produce a macroscopic structure composed of non-woven networks of fibers varying from the nanoscale to the microscale range. The samples were characterized using Scanning Electron Microscopy (SEM), Scanning Differential Calorimetry (DSC), Thermogravimetry (TG), Infrared Fourrier Transform (FTIR), Dynamic Mechanical Analysis (DMA) and in vitro tests with Mesenquimal Stem Cells (MSCs). The membranes were considered biocompatible, which led to believe that the solvent portion was eliminated during the process, enabling adhesion, penetration and cellular proliferation within the structure / Mestrado / Materiais e Processos de Fabricação / Mestre em Engenharia Mecânica

Orientadores: Enilson Antônio Sallum, Karina Gonzales Silvério Ruiz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-16T00:46:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Suaid_FabriciaFerreira_D.pdf: 4378938 bytes, checksum: 06a24b032e38b3ae490047a4a2ba7544 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O objetivo do presente estudo foi avaliar histometricamente o efeito dotransplante autógeno de células do ligamento periodontal (PDLCs), associado à regeneração tecidual guiada (RTG), no tratamento de defeitos de furca grau III criados cirurgicamente em cães. Inicialmente, as PDLCs foram obtidas das raízes do 2º pré-molar e do 1º molar inferior extraídos, bilateralmente, de sete cães da raça beagle. Em seguida, as células foram cultivadas in vitro e caracterizadas fenotipicamente. Lesões de furca grau III foram criadas nos 3os e 4os pré-molares inferiores e os defeitos foram aleatoriamente escolhidos para receber os seguintes tratamentos: Grupo Controle - instrumentação da superfície radicular com auxílio de curetas e posicionamento coronário dos retalhos (7); Grupo RTG - regeneração tecidual guiada (7); Grupo Esponja - RTG + esponja de colágeno (7); Grupo Células - RTG + células do ligamento periodontal embebidas na esponja de colágeno, na ausência de soro fetal bovino (7). Após três meses, os animais foram sacrificados e os blocos contendo os espécimes foram processados para análise histológica. Os parâmetros histométricos avaliados foram: extensão total do defeito (ETD), extensão não preenchida do defeito (ENP), novo cemento (NC), regeneração periodontal (RP), extensão de epitélio/conjuntivo (EEC), anquilose (ANQ), área total do defeito (ATD), área não preenchida (ANP), área preenchida (AP), área de novo osso (NO), área de epitélio/tecido conjuntivo (AEC). Resultados: A caracterização fenotípica, in vitro, demonstrou que as PDLCs foram capazes de promover a formação de nódulos minerais, bem como de expressar sialoproteína óssea (BSP), colágeno do tipo I (COL I) e a fosfatase alcalina (ALP). Histometricamente, a análise de dados demonstrou que o grupo tratado com células apresentou uma maior extensão de novo cemento (1,70 ± 0,60 mm; 2,87 ± 0,74 mm; 3,66 ± 0,95 mm e 4,82 ± 0,61mm, para os grupos controle, RTG, esponja e células, respectivamente; p<0,001), uma maior extensão da regeneração periodontal (0,69 ± 0,59 mm; 1,52 ± 0,39 mm; 2,33 ± 0,95 mm e 3,43 ± 1,44 mm, para os grupos controle, RTG, esponja e células, respectivamente; p = 0,001) e uma maior área de novo osso (1,89 ± 0,95 mm2; 2,91 ± 0,56 mm2; 3,94 ± 1,52 mm2 e 5,45 ± 1,58 mm2, para os grupos controle, RTG, esponja e células, respectivamente; p = 0, 0012). Dentro dos limites deste estudo, concluiu-se que o transplante autógeno de PDLCs associadas à RTG favoreceu a regeneração periodontal em defeitos de furca grau III. / Abstract: The aim of this study was to histometrically investigate the potential use of autogenous periodontal ligament cells (PDLCs) associated with guided tissue regeneration (GTR) for tissue engineering in surgically created class III furcation defects in dogs. PDLCs were obtained from the tooth root of bilateral mandibular 2nd premolar (P2) and the 1st molar (M1) extracted from seven beagle dogs, cultured in vitro and phenotypically characterized with regard to their biological properties. Bilateral class III furcation lesions were surgically created at 3rd and 4th premolars (P3, P4) and the defects were randomly assigned to one of the following groups: Control Group: root surface was scaled and planned with curettes and the flap was coronally positioned (n=7), GTR Group: two bioabsorbable membranes were adapted to cover the buccal and lingual aspects of the defect (n=7), Sponge Group: the collagen sponge scaffold was placed in the furcation area associated with GTR (n=7), Cell Group: the collagen sponge scaffold, with the cell suspension without FBS was placed in the furcation area associated with GTR (n=7). After 3 months, the animals were sacrificed and the blocks containing the experimental specimens were processed for histological analysis. The histometric parameters evaluated were: total defect length (TDL), tissue-free defect length (TFL), new cementum (NC), periodontal regeneration (R), epithelium/connective tissue extension (ECT), Ankylosis (ANQ), total defect area (TDA), non-filled area (NFA), soft tissue area (STA) and new bone area (NBA). Results: In vitro, phenotypic characterization demonstrated that PDLCs were able to promote mineral nodule formation as well as to express bone sialoprotein (BSP), type I collagen (COL I) and alkaline phosphatase (ALP). Histometrically, data analysis demonstrated that the cell-treated group presented a superior length of new cementum (1.70 ± 0.60 mm; 2.87 ± 0.74 mm; 3.66 ± 0.95 mm and 4.82 ± 0.61 mm, for control, GTR, sponge and cell groups, respectively; p<0.001), a greater extension of periodontal regeneration (0.69 ± 0.59 mm; 1.52 ± 0.39 mm; 2.33 ± 0.95 mm and 3.43 ± 1.44 mm, for control, GTR, sponge and cell groups, respectively; p=0.001) and a larger area of new bone (1.89 ± 0,95 mm2; 2.91 ± 0,56 mm2; 3.94 ± 1,52 mm2 and 5.45 ± 1,58 mm2, for control, GTR, sponge and cell groups, respectively; p=0,0012). Within the limits of this animal study, it was concluded that PDLCs in association with GTR may be a useful option to promote periodontal tissue regeneration in class III furcation defects. / Doutorado / Periodontia / Doutor em Clínica Odontológica

A utilização e o desenvolvimento de biomateriais para a regeneração tecidual são de grande importância, principalmente para a área médica e odontológica. Matrizes de colágeno derivadas de tecidos de origem animal são utilizadas devido o colágeno apresentar características como biodegradabilidade e biocompatibilidade. Essas matrizes podem ser obtidas a partir de várias fontes, sendo uma delas o pericárdio porcino, que apresenta vantagens como grande disponibilidade, baixo custo, fácil obtenção e possibilidade de sofrer modificações químicas. Além disso, tecidos de origem suína são muito similares aos tecidos humanos, podendo ser utilizados para a produção de biomateriais para a regeneração de tecido mole. Este trabalho teve como objetivo a preparação de membranas acelulares derivadas de pericárdio porcino por hidrólise alcalina em diferentes tempos, para posterior utilização em engenharia de tecido. As membranas de colágeno foram obtidas por hidrólise alcalina de pericárdio porcino durante 4, 8, 12 e 24 h e caracterizadas por análise histológica, microscopia eletrônica de varredura (MEV), avaliação da citoxicidade in vitro, estabilidade biológica in vitro (colagenase), titulação potenciométrica, porcentagem de absorção de água, calorimetria exploratória diferencial (DSC), termogravimetria (TG), análise térmica dinâmico-mecânica (DMTA) e ensaios de tração. A análise histológica mostrou que após 4h de hidrólise as células foram removidas das membranas. A avaliação da citotoxicidade in vitro mostrou que as membranas preparadas neste trabalho não são citotóxicas. Os ensaios de estabilidade biológica in vitro por colagenase mostraram que as membranas hidrolisadas degradaram mais rapidamente que a não hidrolisada e, quando comparadas com matrizes derivadas de pericárdio bovino, as derivadas de pericárdio porcino foram mais resistentes à degradação por colagenase. A titulação potenciométrica possibilitou determinar o número de grupos carboxílicos das membranas e o incremento desses grupos por molécula de colágeno. Os resultados mostraram que houve um aumento no número de grupos carboxílicos tituláveis nas membranas hidrolisadas e, consequentemente, houve um aumento do número de cargas negativas incorporadas na molécula de colágeno. As membranas hidrolisadas apresentaram uma maior absorção de água, uma diminuição das temperaturas de desnaturaçãoe e menor estabilidade térmica em função do aumento do tempo de hidrólise. Os ensaios de tração mostraram que após a hidrólise alcalina as membranas apresentaram maiores valores de resistência à tração e que a deformação é dependente do tempo de hidrólise alcalina. Esses resultados mostraram que a preparação de membranas de colágeno derivadas de pericárdio porcino com diferentes tempos de hidrólise alcalina é um procedimento viável para ser utilizado na produção de biomateriais para engenharia de tecido. / The use and development of biomaterials for tissue regeneration are of great importance, especially for medical and dental care. Collagen matrices derived from animal tissues are widely used because collagen has characteristics such as biodegradability and biocompatibility. These matrices can be obtained from various sources, such as porcine pericardium, which is a tissue that can be used due its low cost, wide availability and because it can be chemically modified. Besides, porcine tissues are very similar to human tissue and can be used to produce biomaterials for soft tissue regeneration. The aim of this study was the preparation and characterization acellular membranes by alkaline hydrolysis of porcine pericardium. Membranes were characterized by histological analysis, scanning electron microscopy (SEM), in vitro cytotoxicity evaluation, in vitro biological stability (collagenase), potentiometric titration, water absorption percentage, differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetry (TG), dynamic mechanical thermal analysis (DMTA) and tensile tests. Histological analysis showed that after 4h of hydrolysis, cells were totally removed from matrices. In vitro cytotoxicity showed that all matrices prepared in this work are not cytotoxic. In vitro biological stability tests (collagenase) showed that the hydrolyzed membranes degraded more quickly than the non hydrolized matrix and more resistant to collagenase degradation when compared to matrices derived from bovine pericardium. The potentiometric titration allowed the determination carboxylic groups and the increase of these groups per collagen molecule. Hydrolyzed matrices had an increase in water absorption, a decrease in denaturation temperature and a small decrease in thermal stability with the increase of hydrolysis time. Tensile tests showed that after alkaline hydrolysis matrices showed higher tensile strength and the deformation was independent of the time of alkaline hydrolysis. These results showed that the preparation of collagen biological matrices derived from porcine pericardium with different times of alkaline hydrolysis is a viable procedure to be subsequently used in the production of biomaterials for tissue engineering.