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Tissue Engineering einer autologen Neofaszie in Kombination mit synthetischen Netzen im dynamischen Bioreaktor: Morphometrie und explorative Gen-Expressionsanalyse / Tissue Engineering of an autologue neofascia in combination with synthetic meshes in a dynamic bioreactor: morphometrie and explorative analysis of gene-expression

Schulz, Christian Andreas January 2019 (has links) (PDF)
Zusammenfassung Einleitung: Die Inzidenz von Narbenhernien (operativ erworbene Schwachstellen der Bauchwand) ist abhängig von der Art der vorhergegangen Operation, nach Laparaskopien ist sie um einiges niedriger als nach Laparotomien, wird aber mit 2-20% in der Literatur angegeben. Aufgrund der möglichen Komplikationen (Platzbauch, Darminkarzeration, Schmerzen, Funktionseinschränkung, …) stellen Narbenhernien oftmals große Belastungen für die Patienten dar. Die operative Sanierung, in Abhängigkeit von Größe und Lage, wird zumeist durch einbringen eines Netzgewebes erreicht. Dieser Fremdkörper kann seinerseits wieder Komplikationen hervorrufen (Infektionen, Funktionsverlust, Schmerzen, Fisteln), die bis zur Explantation des Netzgewebes führen können. Das Risiko für das Auftreten von Narbenhernien bzw. deren Rezidiven hängt von vielen Faktoren ab, als Risikofaktoren wurden unter anderem Rauchen, männliches Geschlecht, Alter >45 Jahre und ein BMI >25 kg/cm² ausgemacht. Ein Teilbereich des Tissue Engineerings ist die Entwicklung von Modellen, anhand derer in vitro Prozesse des menschlichen Körpers nachvollzogen werden können. Mit dieser Arbeit soll ein Modell etabliert werden Anhand dessen die Untersuchung der Kollagenproduktion und der Netzinkorporation bzw. die Auswirkungen verschiedener Risikofaktoren auf diese Prozesse in vitro ermöglicht werden soll. Weiterhin wurden Studienfragen formuliert, die sich sowohl mit der Durchführbarkeit dieser Methode abzielten, als auch gezielt nach der Stützung der These der „guten und schlechten Heiler“ durch diese Arbeit abzielten. Sowie nach der Vergleichbarkeit der Ergebnisse mit bekannten Kollagenmustern die aus Netzexplantaten bekannt sind. Material und Methode: Für die vorliegende Arbeit wurden Biopsien von Faszien bzw. Narbenhernien im Rahmen einer Operation gewonnen, aus diesen wurden die Fibroblasten isoliert und anschliessend entweder eingefroren bzw. expandiert, um sie in einer Rattenkollagenmatrix mit und ohne synthetischem Netz im dynamisch mechanischen Bioreaktor zu kultivieren. Die Biopsien wurden Anhand der Kollagen I/III Ratio in „gute und schlechte Heiler“ eingruppiert. Anschließend wurden die so gezüchteten Neofaszien HE und Pikrosiriusrot gefärbt um zum einen einen Eindruck von der Verteilung der Fibroblasten innerhalb der Neofaszie zu gewinnen, als auch Aussagen zum Kollagenmuster, der Kollagen I/III Ratio und zur Kollagendensität treffen zu können. Die Dicke der kultivierten Neofaszien wurde sowohl in Sirius als auch in HE Färbung untersucht. Weiterhin wurden RT-PCR und Gene Arrays von Nativgeweben und von Neofaszien mit unterschiedlichen Netztypen durchgeführt. Ergebnisse: Bei gesunden Probanden konnten oftmals nicht genügend Zellen aus den Faszienbiopsaten gewonnen werden, deshalb wurde im Verlauf der Arbeit auf die Gewinnung von gesundem Fasziengewebe als Vergleichsgruppe verzichtet. Fibroblasten von als „schlechten Heilern“ klassifizierten Patienten zeigten meist ein langsameres Wachstum in der Expansionsphase. Der Bioreaktor bereitete kaum Probleme (ein paar Faszien trockneten anfänglich aus, dieses Problem lies sich durch bei Bedarf verkürzten Medienwechselintervallen in den Griff bekommen. Probleme mit Kontaminationen traten nicht auf. Bei den Histologischen Untersuchungen der Neofaszien waren Fibroblasten über den gesamten Bereich der Neofaszie zu sehen, auch in unmittelbarer Umgebung der Netzstrukturen. Die Kollagenmuster stimmten in Ansätzen mit den aus klinischen Netzexplantaten bekannten Mustern überein (Polydirektional bei Polyesternetz, Konzentrisch um die Netzstrukturen bei Polypropylen). Weiterhin war eine verstärkte Kollagenbildung quer zur Druckrichtung des Bioreaktors zu erkennen. Bei der Betrachtung der Dicke der Neofaszien zeigte sich (unter Vorbehalt, aufgrund der geringen Probenanzahl) eine Tendenz zu meist dünneren Faszien bei „schlechten Heilern“ während die Neofaszien von „guten Heilern“ meist eine kleinere Streuung um den Mittelwert zeigten (einheitlicher waren). Die Kollagendensität und auch die Kollagen I/III Ratio lieferten Ergebnisse Anhand derer Gesagt werden kann, dass je höher die Ausgangswerte im Nativgewebe waren, diese mit höherer Wahrscheinlichkeit von den Neofaszien nicht erreicht werden konnten. qRT-PCR und Gene Array zeigten in der Rangkorrelation nach Spearman große Übereinstimmungen. Beantwortung der Studienfragen: Es konnte gezeigt werden, dass es möglich ist Neofaszien mit synthetischen Netzen zu züchten, die über den gesamten Bereich mit Fibroblasten besiedelt waren. Die Ergebnisse der Kollagenmorphologie zeigten in Ansätzen die aus Netzexplantaten bekannten Muster. Bei Kollagen I/III Ratio und Densität war lediglich erkennbar, dass je höher die Ausgangswerte waren, diese mit zunehmender Wahrscheinlichkeit nicht reproduziert werden konnten. Es ließ sich keine Verbindung zwischen der Kollagen I/III Ratio der Histologischen Gewebeproben und den Molekularbiologischen Ergebnissen feststellen. Weiterhin konnte die Theorie der „guten und schlechten Heiler“ molekularbiologisch nicht gestützt werden, da die Proben der als „schlechte Heiler“ Klassifizierten Biopsien stärkere Gemeinsamkeiten mit als „gute Heiler“ Klassifizierten Biopsien aufwiesen als untereinander. Es konnte gezeigt werden dass die Kultur auf die MMP-8 und Elastinproduktion keinen Einfluss zu haben scheint. Diskussion: Im Verlauf der Diskussion wurde darauf hingewiesen, dass die Kollagensynthese, und Sekretion ein komplexes und höchst aktives System darstellt, welches im Rahmen der Wundheilung durch Co-Signalling, und der Interaktion zwischen Fibroblasten und Immunzellen (Makrophagen…) nochmals verändert wird, auch dadurch bedingt, dass Fibroblasten im Verlauf der Wundheilung selbst als immunmodulierende Zellen in Erscheinung treten können. So können weiterhin die Kollagen kodierenden Gene (Col1A1, Col1A2, Col3A1) als Marker für die Kollagenaktivität herangezogen werden, da aber zwischen Synthese und Sekretion des Kollagens ein nicht zu vernachlässigender Teil bereits intrazellulär wieder abgebaut wird kann nur durch Betrachtung dieser Gene die Theorie der „guten und schlechten Heiler“ nicht gestützt werden. Durch die hohe Korrelation der Ergebnisse aus gene-Array und qRT-PCR könnte für die Zukunft vorläufig auf die Durchführung von qRT-PCR verzichtet werden, um eventuell unterschiedliche Pathways mit dem Gene-Array zu identifizieren. Offene Fragen Ausblick und Perspektiven: Da das System der Wundheilung und Kollagensynthese und –Sekretion sehr komplex ist sollte für die Zukunft durch eine Kokultur mit Makrophagen bzw. durch die Zugabe von TNF-α, IL-6, PDGF, G-CSF, GM-CSF, Vitamin C oder Lysyloxidase zum Kulturmedium, geprüft werden ob sich eine Aktivitätsveränderung der Fibroblasten und damit eine andere Neofaszienstruktur erreichen lässt. Weiterhin sollte um einer Verfälschung der Ergebnisse durch das für die Gele verwendete Rattenkollagen vorzubeugen, entweder die Kulturdauer verlängert werden (mit dem Gedanken dass dann das gesamte Rattenkollagen durch humanes ersetzt wurde) bzw. ein Kollagenfreies Gel als Trägerstruktur entwickelt und verwendet werden. Um eine bessere Vergleichbarkeit der Ergebnisse des Gene-Arrays aus Spenderbiopsie und Neofaszie zu erreichen sollten die zur RNA-Gewinnung verwendeten Anteile der Biopsie noch innerhalb des OP in RNA-later bzw. in flüssigen Stickstoff gegeben werden, um einer verstärkten Degradation vorzubeugen. / Summary Introduction: The incidence of scar hernias (surgically acquired weaknesses of the abdominal wall) depends on the type of previous operation, after laparascopies it is much lower than after laparotomies, but is reported to be 2-20% in the literature. Due to the possible complications (burst abdomen, intestinal incarceration, pain, functional limitations, ...), scar hernias often represent a great burden for patients. Surgical restoration, depending on size and location, is usually achieved by inserting a mesh tissue. This foreign body in turn can cause complications (infections, loss of function, pain, fistulas), which can lead to explantation of the mesh tissue. The risk of the occurrence of scar hernias or their recurrence depends on many factors, including smoking, male sex, age >45 years and a BMI >25 kg/cm². One goal of tissue engineering is the development of in vitro models to reproduce processes of the human body. The aim of this work is to establish a model that will enable the investigation of collagen production and mesh incorporation and the effects of different risk factors on these processes in vitro. Study questions were formulated, that were aimed to prove the feasibility of this method, to see if the results support the thesis of "good and bad healers", and to compare the results with known collagen patterns from net implants. Material and method: Biopsies of fascia and scar hernias were obtained during an abdominal surgery, from this tissue the fibroblasts were isolated and then either frozen or expanded in order to cultivate them in a rat collagen matrix with and without synthetic meshes in a dynamic-mechanical bioreactor. The biopsies were grouped into "good and bad healers" using the collagen I/III ratio. The neofasciae were then stained (HE and Pikrosirius red) to gain an impression of the distribution of the fibroblasts within the neofascia and to be able to make statements about the collagen pattern, the collagen I/III ratio and the collagen density. The thickness of the cultured neofascia was investigated in both Sirius and HE staining. Furthermore, RT-PCR and gene arrays of native tissues and neofascia with different net types were performed. Results: In healthy volunteers, it was often not possible to obtain a sufficient number of fibrobasts from the fascia biopsies. Therefore, in the course of the study, healthy fascia tissue was not obtained as a comparison group. Fibroblasts from patients classified as "bad healers" usually showed slower growth in the expansion phase. The bioreactor caused hardly any problems (a few fasciae initially dried out, this problem could be solved by shortening the intervals between media changes if necessary). Problems with contamination did not occur. During the histological examination of the neofascia, fibroblasts were visible over the entire area of the neofascia, even in the immediate vicinity of the mesh structures. The collagen patterns were similar to those already known from clinical mesh explants (polydirectional in the case of polyester mesh, concentric around the mesh structures in the case of polypropylene). Furthermore, an increased collagen formation transverse to the pressure direction of the bioreactor could be observed. When considering the thickness of the neofasciae, a tendency towards thinner fasciae in "bad healers" was observed (with reservations, due to the small number of samples), whereas the neofasciae of "good healers" showed a smaller scatter around the mean value (were more uniform). The collagen density and also the collagen I/III ratio also showed results, to state: the higher the initial values in the native tissue, the higher the probability that these could not be achieved by the neofasciae. qRT-PCR and Gene Array showed a high correlation (rank correlation according to Spearman). Answering the study questions: It could be shown that it is possible to breed neofasciae with synthetic meshes that were colonized with fibroblasts over the entire area. The results of the collagen morphology showed patterns known from mesh explants. With collagen I/III ratio and density it was only recognizable that the higher the initial values were, the more likely it was that they could not be reproduced. There was no connection between the collagen I/III ratio of the histological tissue samples and the molecular biological results. Furthermore, the theory of "good and bad healers" could not be supported by molecular biology, since the samples of the biopsies classified as "bad healers" had more in common with biopsies classified as "good healers" than with each other. It could be shown that the culture does not seem to have any influence on MMP-8 and elastin production. Discussion: In the course of the discussion, it was pointed out that collagen synthesis and secretion is a complex and highly active system, which is further altered in the context of wound healing by co-signalling and the interaction between fibroblasts and immune cells (macrophages...), also due to the fact that fibroblasts themselves can appear as immunomodulating cells in the course of wound healing. Thus, the collagen coding genes (Col1A1, Col1A2, Col3A1) can still be used as markers for collagen activity, but since between synthesis and secretion of the collagen a not negligible part is already degraded intracellularly, the theory of "good and bad healers" cannot be supported only by considering these genes. Due to the high correlation of the results from gene arrays and qRT-PCR, the use of qRT-PCR could be dispensed with for the time being in order to identify possible different pathways with the gene array. Open questions Outlook and perspectives: The system of wound healing and collagen synthesis and secretion is very complex, it should be examined whether a change in the activity of the fibroblasts and thus a different neofascia structure can be achieved in the future by cocultivation with macrophages or by adding TNF-α, IL-6, PDGF, G-CSF, GM-CSF, vitamin C or lysyl oxidase to the culture medium. Furthermore, in order to prevent falsification of the results by the rat collagen used for the culture medium, either the culture duration should be extended (with the thought that the entire rat collagen was then replaced by human collagen) or a collagen-free culture medium should be developed and used as carrier structure. In order to achieve a better comparability of the results of the gene array from donor biopsy and neofascia, the parts of the biopsy used for RNA extraction should be given in RNA later or in liquid nitrogen in the OR (operation room) to prevent an increased degradation.
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Vergleich der Kollagenentwicklung und Differenzierungsfähigkeit humaner Stammzellen des Fettgewebes unter dem Einfluss des Prolyl-4- Hydroxylase-Inhibitors EDHB im 2D und 3D Modell / Comparison of collagen development and differentiation ability of human adipose-derived stem cells under the influence of prolyl-4-hydroxylase inhibitor EDHB in a 2D and 3D Model

Lukaszyk, Daniel January 2021 (has links) (PDF)
Das Tissue Engineering von Fettgewebe befasst sich mit der Herstellung von biologisch äquivalenten Gewebekonstrukten mit dem Ziel, diese in der Regenerativen Medizin zur Deckung von Weichteildefekten einzusetzen. Für die Ausreifung, Funktion und das Überleben von Adipozyten wurde die Bedeutung der Extrazellulärmatrix (EZM) zunehmend deutlich.18-20 Untersuchungen zur EZM und ihrer Einflussnahme auf die Adipogenese wurden bislang hauptsächlich an konventionellen zweidimensionalen Zellkulturen unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark (bone marrow-derived MSC), Präadipozyten der Mauszelllinie 3T3-L1 und intramuskulären Präadipozyten aus Rindern (bovine intramuscular preadipocytes, BIP) vorgenommen.23,56,69,76,115 Ziel dieser Arbeit war es Erkenntnisse über den Einfluss der EZM auf die adipogene Differenzierungsfähigkeit unter Verwendung von humanen mesenchymalen Stammzellen des Fettgewebes (human adipose-derived stem cells, hASC) zu gewinnen. Um in vitro eine natürlichere Mikroumgebung der Zellen zu generieren, wurde neben einer 2D Kultur vergleichend ein 3D Modell bestehend aus multizellulären Sphäroiden verwendet.84,85 Zudem war die Bestimmung eines stabilen Housekeeping-Gens notwendig, um valide Ergebnisse in qPCR-Analysen von Genexpressionsstudien zu gewährleisten. Die Auswertung statistischer Parameter (Standardabweichung und Interquartilsbereich) sowie die Ergebnisse dreier zur Stabilitätsprüfung eingesetzten Softwares identifizierten EF1α als robustestes HKG. Der Zusammenhang zwischen der EZM-Entwicklung und der Adipogenese wurde durch Hemmung der Kollagenentwicklung unter Verwendung von Ethyl-3,4-dihydroxybenzoat (EDHB) untersucht. Bei Betrachtung der Triglyceridsynthese mittels Histologie und quantitativer Analyse (Triglyceridassay) konnte in beiden Kultursystemen eine konzentrationsabhängige Hemmung der Adipogenese festgestellt werden. Im Unterschied zur 2D Kultur konnte der Triglyceridgehalt im 3D Modell annähernd auf das Niveau der nicht-induzierten Kontrolle gesenkt werden und damit ein tendenziell stärkerer negativer Effekt im 3D Modell demonstriert werden. In Untersuchungen zur Genexpression wurde die Expressionsrate der späten adipogenen Marker aP2 und C/EBPα maximal durch Zugabe von 0,05 mM EDHB gesenkt, wobei der Effekt in 3D erneut stärker ausgeprägt war. Bei Betrachtung der Kollagenentwicklung zeigte sich immunhistochemisch zunächst eine Adipogenese-assoziierte Entwicklung der Kollagene I, IV und VI im 2D und 3D Modell. Durch die Zugabe von EDHB ließ sich die Kollagenbildung gleichermaßen in 2D und 3D konzentrationsabhängig inhibieren. Damit konnte ein Rückgang der Synthese von drei für die Adipozyten relevanten Kollagenen zusammen mit der Störung der adipogenen Differenzierung nachgewiesen werden. Auf mRNA-Ebene hingegen war eine unterschiedliche Expression von Kollagen I und IV nachweisbar. Für Kollagen I wurde eine Abnahme der Expression bei Differenzierung der Zellen beobachtet, während die Expressionsrate von Kollagen IV erst mit Beginn der Adipogenese gesteigert wurde. Die Genexpression der untersuchten Kollagene wurde durch EDHB nicht negativ beeinflusst. Insgesamt weisen die Ergebnisse auf einen engen Zusammenhang der Kollagensynthese mit der Adipogenese hin. Inwieweit eine durch Zell-Matrix-Interaktionen ausgelöste Signaltransduktion und regulatorische Mechanismen in den Präadipozyten die Adipogenese beeinflussen, bleibt jedoch Gegenstand zukünftiger Forschung. / Adipose tissue engineering focuses on the generation of biologically equivalent tissue constructs that can be used in regenerative medicine to cover tissue defects. The relevance of the extracellular matrix (ECM) in adipocyte maturation, function, and survival has become increasingly apparent.18-20 Studies on the ECM and its influence on adipogenesis have so far mainly been performed on conventional two-dimensional cell cultures using bone marrow-derived mesenchymal stem cells (bone marrow-derived MSC), mouse cell line 3T3-L1 preadipocytes, and bovine intramuscular preadipocytes (BIP).23,56,69,76,115 The goal of the study was to gain insights into the role of the ECM on adipogenic differentiation capacity using human adipose-derived stem cells (hASC). To generate a more natural cell microenvironment in vitro, a 3D model consisting of multicellular spheroids was used in comparison to a 2D culture.84,85 Moreover, to ensure valid results in gene expression studies obtained by qPCR analyses, determination of a stable housekeeping gene was necessary. The evaluation of statistical parameters (standard deviation and interquartile range) and the results achieved by three softwares known for stability testing identified EF1α as the most robust HKG. The relationship between ECM development and adipogenesis was investigated by inhibition of collagen development using ethyl-3,4-dihydroxybenzoate (EDHB). Histological staining of lipids and quantitative analysis (triglyceride assay) revealed a concentration-dependent inhibition of adipogenesis in both culture systems. In contrast to the 2D culture, the triglyceride content in the 3D model could be reduced approximately to the level of the non-induced control, demonstrating an overall stronger inhibitory effect in the 3D model. In gene expression studies, the expression levels of the late adipogenic markers aP2 and C/EBPα were maximally decreased by addition of 0.05 mM EDHB, whereby the effect was again more pronounced in 3D. Regarding the collagen development, an adipogenesis-associated development of collagen I, IV, and VI was seen by immunohistochemical analysis in the 2D and 3D models. Addition of EDHB equally inhibited collagen formation in 2D and 3D in a concentration-dependent manner. This demonstrated a decrease in the synthesis of three collagens relevant to adipocytes along with the disruption of adipogenic differentiation. In contrast, a different expression pattern of collagen I and IV was detectable at the mRNA level. For collagen I, a decrease in expression was observed upon differentiation of the cells, whereas the expression level of collagen IV was increased only with the onset of adipogenesis. Both expression patterns were not affected by EDHB. Overall, the results indicate a close relationship of collagen synthesis with adipogenesis. However, the extent to which signal transduction triggered by cell-matrix interactions and regulatory mechanisms in preadipocytes influence adipogenesis remains the subject of future research.
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Aufbau eines humanen 3D-Atemwegsmodells zur Modellierung der Atemwegsinfektion mit Bordetella pertussis / Investigations of pertussis toxins in a 3D in vitro model of the human respiratory mucosa

Seidensticker, Katharina January 2021 (has links) (PDF)
Mittels Tissue Engineering hergestellte humane 3D in vitro-Testsysteme sind ein neuer Ansatz, um u.a. Erkrankungen der Atemwege zu simulieren und zu untersuchen. Obwohl gegen B. pertussis, den Erreger des Keuchhustens, Impfstoffe zur Verfügung stehen, nimmt die Erkrankungs-Inzidenz in den letzten Jahren deutlich zu. Da B. pertussis zu den obligat humanpathogenen Erregern zählt, sind die aus Tierversuchen stammenden Daten nur unzureichend auf den Menschen übertragbar. Die genauen Pathomechanismen der Infektion sind bisher nicht geklärt. Auf einer biologischen Kollagenmatrix wurde eine Ko-Kultur aus humanen tracheobronchialen Fibroblasten und humanen tracheobronchialen Epithelzellen (hTEC) angesiedelt und 3 Wochen unter apikaler Belüftung kultiviert. Die ausdifferenzierten 3D Testsysteme wurden mit Überständen von Bordetella pertussis-Kulturen inkubiert und auf licht- und elektronenmikroskopischer Ebene analysiert. Weiterhin wurden 2D Kulturen der hTEC mit Hilfe der Ramanspektroskopie nicht-invasiv auf intrazelluläre Veränderungen nach der Inkubation mit den bakteriellen Überständen untersucht. Das 3D Testsystem der humanen Atemwegschleimhaut zeigte auf lichtmikroskopischer und ultrastruktureller Ebene eine hohe in vitro – in vivo-Korrelation. Die elektronenmikroskopische Analyse zeigte morphologische Veränderungen nach der Inkubation mit den B. pertussis Überständen, die mit vorbeschrieben Effekten einer B. pertussis Infektion korrelieren. Mittels der Ramanspektroskopie ließen sich Gruppen von unbehandelten Zellen von Gruppen, die zuvor mit Bakterienüberständen inkubiert wurden, trennen. Somit zeigte sich die Ramanspektroskopie sensitiv für intrazelluläre Infektionsfolgen. Zusammenfassend wurde belegt, dass das 3D-Modell der humanen Atemwegschleimhaut zur Untersuchung obligat humanpathogener Infektionserreger geeignet ist und dass die Ramanspektroskopie eine nicht-invasive Methode ist, um durch Infektionen hervorgerufene intrazellulären Pathologien zu analysieren. / Three dimensional (3D) tissue-engineered human tissue models are of high relevance, e.g. to investigate virulence mechanisms of human obligate pathogens in vitro. One major obligate agent causing acute respiratory diseases is Bordetella pertussis (Bp), the agent of whooping cough. The progress towards elimination Bp has stalled which is mainly caused due to an absence of suitable models to gain more knowledge about its pathomechanism. On a biological collagen matrix (SISser) a co-culture of human fibroblasts and human airway epithelial cells (hTEC) was seeded and cultured under airlift conditions. The completely differentiated test systems were treated with sterile-filtrated supernatants of Bp and afterwards analyzed with light and transmission electron microscopy. 2D cultures of hTEC were also infected and analyzed with Raman spectroscopy. The 3D test system of the human airway mucosa shows high in vitro - in vivo - correlation on both structural and ultrastructural level. Preliminary morphological analysis after infection with Bp supernatant reveals considerable ultrastructural changes which were not observed in control samples and correlate to effects knows from Bp infections in vivo. In 2D cultivation conditions the Raman spectra of infected hTEC clearly differ from spectra of the control. It is shown that the 3D airway mucosa model represents pathological effects of Bp toxins and offers an opportunity to further examine their pathomechanisms. Raman spectroscopy appears to be a practical method to show intracellular changes on living cells non-invasively.
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Entwicklung eines \(in\) \(vitro\) Modells für Verbrennungen ersten Grades zur Testung einer zellbasierten Wundauflage / Development of an \(in\) \(vitro\) model for first degree burn wounds to test a cell based wound dressing

Weigel [geb. Schneider], Verena January 2022 (has links) (PDF)
Mit jährlich circa 11 Millionen Fällen weltweit, stellen schwere Brandwunden bis heute einen großen Anteil an Verletzungen dar, die in Kliniken behandelt werden müssen. Während leichte Verbrennungen meist problemlos heilen, bedarf die Behandlung tieferer Verbrennungen medizinischer Intervention. Zellbasierte Therapeutika zeigen hier bereits große Erfolge, aufgrund der eingeschränkten Übertragbarkeit von Ergebnissen aus Tiermodellen ist jedoch sowohl die Testung neuer Produkte, als auch die Erforschung der Wundheilung bei Brandwunden noch immer schwierig. Aufgrund dessen wurden in dieser Arbeit zwei Ziele verfolgt: Die Etablierung von Methoden, um ein zellbasiertes Therapeutikum produzieren zu können und die Entwicklung eines Modells zur Untersuchung von Verbrennungswunden. Zunächst wurden hierfür die Kulturbedingungen und -protokolle zur Isolation und Expansion von Keratinozyten so angepasst, dass sie gängigen Regularien zur Produktion medizinischer Produkte entsprechen. Hier zeigten die Zellen auch in anschließenden Analysen, dass charakteristische Merkmale nicht verloren hatten. Darüber hinaus gelang es, die Zellen mithilfe verschiedener protektiver Substanzen erfolgreich einzufrieren und zu konservieren. Des Weiteren konnte ein Modell etabliert werden, das eine Verbrennung ersten Grades widerspiegelt. Über einen Zeitraum von zwei Wochen wurde seine Regeneration hinsichtlich verschiedener Aspekte, wie der Histomorphologie, dem Metabolismus und der Reepithelialisierungsrate, untersucht. Die Modelle zeigten hier viele Parallelen zur Wundheilung in vivo auf. Um die Eignung der Modelle zur Testung von Wirkstoffen zu ermitteln wurde außerdem eine Behandlung mit 5% Dexpanthenol getestet. Sie resultierte in einer verbesserten Histomorphologie und einer erhöhten Anzahl an proliferativen Zellen in den Modellen, beschleunigte jedoch die Reepithelialisierung nicht. Zusammengefasst konnten in dieser Arbeit zunächst Methoden etabliert werden, um ein medizinisches Produkt aus Keratinozyten herzustellen und zu charakterisieren. Außerdem wurde ein Modell entwickelt, anhand dessen die Wundheilung und Behandlung von Verbrennungen ersten Grades untersucht werden kann und welches als Basis zur Entwicklung von Modellen von tieferen Verbrennungen dienen kann. / With approximately 11 million cases annually worldwide, severe burns still represent a large proportion of injuries requiring hospital treatment. While minor burns usually heal without problems, the treatment of deeper burns requires medical intervention. Cell-based therapeutics have already shown great success in this area, but due to the limited transferability of results from animal models, both the testing of new products and research into wound healing in burn wounds is still difficult. Due to this, two objectives were pursued in this work: The establishment of methods to enable the production of a cell-based therapeutic and the development of a model to study burn wounds. First, the culture conditions and protocols for the isolation and expansion of keratinocytes were adapted to meet common regulations for the production of medical products. The cells showed in subsequent analyses that characteristic features had not been lost. In addition, the cells were successfully frozen and preserved with the use of different protective substances. Furthermore, it was possible to establish a model that reflects a first-degree burn wound. Over a period of two weeks, the regeneration of the models was investigated with regard to various aspects, such as histomorphology, metabolism and the rate of reepithelialization. Here, the models showed many parallels to wound healing in vivo. In addition, to determine the suitability of the models for testing active ingredients, a treatment with 5% dexpanthenol was tested. It resulted in an improved histomorphology and increased numbers of proliferative cells in the models, but did not accelerate overall reepithelialization. In summary, this work initially established methods to produce and characterize a medical product from keratinocytes. In addition, an in vitro model was developed that can be used to study wound healing and treatment of first-degree burns and can serve as a basis for developing models of deeper burns.
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Application of a Periosteum-bone Allograft for Healing of Segmental Bone Defects

Yu, Qing 07 June 2013 (has links)
No description available.
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Investigation of Magnesium-based Interventions for Central and Peripheral Nervous Tissue Regeneration

Vennemeyer, John J. 30 September 2013 (has links)
No description available.
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DEVELOPMENT AND CHARACTERIZATION OF L-TYROSINE BASED POLYURETHANES FOR TISSUE ENGINEERING APPLICATIONS

Sarkar, Debanjan 02 October 2007 (has links)
No description available.
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Charakterisierung von Zellen aus dem vorderen Kreuzband nach Vorderer- Kreuzband-Ruptur im Hinblick auf das Rupturalter / Characterisation of cells isolated from the ruptured anterior cruciate ligament in regard to the time since rupture

Kupczyk, Eva Katharina January 2023 (has links) (PDF)
Die Vordere Kreuzband (VKB)-Ruptur ist eine häufige Verletzung, welche eine hohe individuelle und sozioökonomische Belastung verursacht. Eine etablierte Therapie ist die VKB-Plastik, problematisch sind jedoch die hohen Rerupturraten nach operativer Versorgung. In der Annahme, dass Mesenchymale Stammzellen (MSC) eine bedeutende Rolle für die Heilung spielen, sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob ein Zusammenhang zwischen Zahl und Qualität der aus dem VKB isolierten MSC sowie der Latenz zwischen Ruptur und Rekonstruktion besteht und so ein optimaler Therapiezeitraum eingegrenzt werden kann. Zunächst erfolgte die Zellisolierung aus intraoperativ gewonnenen VKB-Biopsien. Je nach Latenz zwischen Ruptur und Operation wurden drei Gruppen (akute ≙ ≤ 30 d, subakute ≙ 31-90 d, verzögerte Rekonstruktion ≙ > 90 d) gebildet. Zum Nachweis von MSC wurden die Zellen hinsichtlich ihrer Plastikadhärenz, eines multipotenten Differenzierungspotentials sowie eines spezifischen Oberflächenantigenmusters (CD73+, CD90+, CD105+, CD34-) untersucht. Zudem wurde ihr Einflusses auf die biomechanischen und histologischen Eigenschaften eines analysiert. Der Nachweis von MSC war in allen Gruppen möglich. Das Proliferationspotential war in Gruppe II am größten, ebenso der Anteil der MSC an allen Zellen. Er war 5,4% (4,6% - 6,3%, 95% CI; p < 0,001) höher als in Gruppe I und 18,9% (18,2% - 19,6%, 95% CI; p < 0,001) höher als in Gruppe III. In den mit Zellen kultivierten Bandkonstrukten konnte im Gegensatz zu zellfreien Konstrukten humanes Kollagen I nachgewiesen werden. Die Stabilität nahm bei Kultivierung mit Zellen ab. Die Ergebnisse legen nahe, dass das Regenerationspotential bei subakuter VKB-Rekonstruktion (31-90 d) am höchsten ist. Potenziell ursächlich sind die Regeneration hemmende Entzündungsprozesse zu Beginn sowie degenerative Prozesse im längerfristigen Verlauf. Zudem konnte gezeigt werden, dass die isolierten Zellen die Eigenschaften eines Bandkonstruktes durch Bildung von Kollagen I und Reduktion der Stabilität im kurzfristigen Verlauf verändern und dementsprechend den Therapieerfolg beeinflussen könnten. Zur Verifizierung der Ergebnisse bedarf es weiterer Untersuchungen. / A ruptured Anterior Cruciate Ligament (ACL) can significantly impact an individual’s health and cause great socioeconomic repercussions. Despite a well-established surgical treatment, the rate of secondary rupture remains high. Previous research has highlighted the important role of Mesenchymal Stem Cells (MSC) in ligament regeneration. This study sets out to analyse possible correlations between the quality and quantity of MSC and the time between rupture and repair, and thus defining the optimal time for surgery. Cells were isolated from ACL biopsies gained intraoperatively. Three groups (acute ≙ ≤ 30d, subacute ≙ 31-90d and delayed reconstruction ≙ > 90d) were defined based on the time from trauma to surgery. To prove the presence of MSC the cells were analysed for proliferative capacity, adherence to plastic, multilineage differentiation potential, as well as the presence of specific surface antigens (CD73+, CD90+, CD105+ and CD34-). The cells’ ability to support healing was assessed through biomechanical tests and histological analysis of ligament models created using isolated ACL cells and a rat collagen type I-based scaffold. Cells that fulfil MSC criteria were isolated in all three groups. In the subacute reconstruction group the proportion of cells which fulfilled the criteria was 5.4% (4,6% - 6,3%, 95% CI; p < 0,001) higher than in the acute reconstruction group and 18.9% (18,2% - 19,6%, 95% CI; p < 0,001) higher than in the delayed reconstruction group. Human collagen I could be isolated in ligament models cultivated using ACL cells. However, the stability of the ligament models decreased after cell cultivation. The results described above suggest that the potential for regeneration is highest in the subacute reconstruction group. This may be because the post traumatic inflammation slows regeneration, while degenerative processes set in in the weeks to months following the rupture. The fact that the presence of human collagen I in the ligament models was associated with decreased stability suggests that the concentration of MSC can affect the surgical outcome. More research into the subject is required to further explore these preliminary findings.
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A high-content multiplexed screening platform for the evaluation and manipulation of force and fatigue of adult derived skeletal muscle myotubes in defined serum-free medium

McAleer, Christopher 01 January 2015 (has links)
The overall focus of this project has two parts: First, was to develop a protocol utilizing serum-free media formulations and defined plating and culture techniques to create functional in vitro myotubes derived from adult skeletal muscle satellite cells. The second was to manipulate the inherent muscle parameters such as force output and fatigue of these myotubes by employing exercise regimes or by small molecule application. The importance of serum-free medium use for in vitro cultures is becoming increasingly important in creating functional systems that can be validated for drug testing by the Food and Drug Administration (FDA). Also, the study of age related diseases as well as the potential for “personalized medicine” relies on the proliferation and maturation of satellite cells from adult derived tissue. For that purpose, a serum-free medium and culture system was designed to create mature striated myotubes in culture on a defined non-biological substrate N-1[3-trimethoxysilyl propyl] diethylenetriamine (DETA). These myotubes were evaluated by morphology, muscle specific protein expression, and by muscle functionality. After the thorough characterization of the resultant myotubes the functional output of the muscle was altered utilizing chemical means (creatine supplementation and PGC-1? agonists), chronic long term stimulation, and the use of PGC-1? deficient tissue. In this thesis presentation the utility of the newly developed medium formulation to create myotubes from a variety of adult derived muscle sources will be shown. A protocol in which to exercise skeletal muscle in vitro to alter endurance was developed and employed to manipulate skeletal muscle. Finally, small molecules were tested to validate this system for drug study use. This engineered system has the potential for high-throughput screening of drugs for efficacy and drug toxicity studies as well as general biological studies on muscle fatigue.
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Tissue Engineering The Motoneuron To Muscle Segment Of The Stretch Reflex Arc Circuit Utilizing Micro-fabrication, Interface Design And Defined Medium Formulation

Das, Mainak 01 January 2008 (has links)
The stretch reflex circuit is one of the most primitive circuits of mammalian system and serves mainly to control the length of the muscle. It consists of four elements: the stretch sensor (muscle spindle/ intrafusal fiber lie parallel between extrafusal, contractile musculature), extrafusal muscle fiber, sensory neuron and motoneuron. The basic principle of the stretch reflex arc circuit is as follows: whenever there is a sudden stretch in a muscle, it needs to compensate back to its original length so as to prevent any kind of injury. It performs this compensation process using a simple negative feed back circuit called the stretch reflex arc. Any form of stretch in a muscle activates the stretch sensors (muscle spindle/ intrafusal fiber) lying deep in each muscle. After the stretch sensors get activated, it sends a train of signals to the spinal cord through the sensory neurons. The sensory neurons relay this information to the motoneuron. The motoneuron performs the necessary information processing and sends the message to the extrafusal fibers so as to compensate for the sudden stretch action. The motoneuron conveys this message to the extrafusal fibers by communicating through the special synaptic junctions called neuromuscular junctions. Based on this information, the extrafusal fibers act accordingly so as to counter the effect of sudden stretch. This is also called the monosynaptic stretch reflex that involves a single synapse between a sensory neuron and a motoneuron. To date studying these stretch reflex circuits is only feasible in animal models. Almost no effort has been made to tissue engineer such circuits for a better understanding of the complex development and repair processes of the stretch reflex circuit formation. The long-term goal of this research is to tissue engineer a cellular prototype of the entire iii stretch reflex circuit. The specific theme of this dissertation research was to tissue engineer the motoneuron to muscle segment of the stretch reflex arc circuit utilizing micro-fabrication, interface design and defined medium formulations. In order to address this central theme, the following hypothesis has been proposed. The first part of the hypothesis is that microfabrication technology, interface design and defined medium formulations can be effectively combined to tissue engineer the motoneuron to muscle segment of the stretch reflex arc. The second part of the hypothesis is that different growth factors, hormones, nanoparticles, neurotransmitters and synthetic substrate can be optimally utilized to regenerate the adult mammalian spinal cord neurons so as to replace the embryonic motoneurons in the stretch reflex tissue engineered construct with adult motoneurons. In this body of work, the different tissue engineering strategies and technologies have been addressed to enable the recreation of a in vitro cellular prototype of the stretch reflex circuit with special emphasis on building the motoneuron to muscle segment of the circuit. In order to recreate the motoneuron to muscle segment of the stretch reflex arc, a successful methodology to tissue engineer skeletal muscle and motoneuron was essential. Hence the recreation of the motoneuron to muscle segment of the stretch reflex circuit was achieved in two parts. In the part 1 (Chapters 2-5), the challenges in skeletal muscle tissue engineering were examined. In part 2 (Chapters 6-7), apart from tissue engineering the motoneuron to muscle segment, the real time synaptic activity between motoneuron and muscle segment were studied using extensive video recordings. In part 3 (Chapters 8-10), an innovative attempt had been made to tissue engineer the adult mammalian spinal cord neurons so that in future this technology could utilized to replace the iv embryonic neurons used in the stretch reflex circuit with adult neurons. The advantage of using adult neurons is that it provides a powerful tool to study older neurons since these neurons are more prone to age related changes, neurodegenerative disorders and injuries. This study has successfully demonstrated the recreation of the motoneuron to muscle segment of the stretch reflex arc and further demonstrated the successful tissue engineering strategies to grow adult mammalian spinal cord neurons. The different cell culture technologies developed in these studies could be used as powerful tools in nerve-muscle tissue engineering, neuro-prosthetic devices and in regenerative medicine.

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