En este trabajo se presentan los resultados en simulación de un sistema de control tolerante a fallas activo aplicado al proceso hidráulico de cuatro tanques acoplados. El sistema de control tiene el objetivo de mantener las propiedades de desempeño deseadas con y sin la presencia de fallas parciales en actuadores (bombas). El sistema de control tolerante se desarrolla a partir de un sistema de detección y diagnóstico de fallas empleando el observador de entrada desconocida para estimar los niveles de los tanques. Después, se generan los residuos y se evalúan mediante un método basado en la norma del vector. Para aislar las fallas en los dos actuadores se utilizan dos observadores de entrada desconocida. La ventaja de este observador es el permitir estimar la magnitud de la falla. El mecanismo de compensación consiste en calcular una nueva ley de control que se adiciona a la señal que envía el controlador. Este método se conoce como compensación aditiva de fallas. Dicho método se aplica a dos tipos de controladores: basado en realimentación de estados (con acción integral), y basado en matriz dinámica. La principal contribución de este trabajo es el sistema de control tolerante, el cual tiene la capacidad de mantener al sistema de control operando en presencia de una falla parcial en uno de los actuadores con un desempeño cercano al obtenido cuando no hay fallas. Se utiliza la integral del error cuadrático como ´índice de desempeño. Las pruebas de simulación en SIMULINK muestran que la estrategia de compensación permite que los niveles de los tanques sigan sus valores de referencia de manera adecuada incluso en presencia de fallas. La misma metodología se implementa en el software RSLogix 5000 y se descarga en un PLC virtual, obteniéndose resultados similares a SIMULINK. Las simulaciones en SIMULINK y RSLogix 5000 demuestran que el controlador tolerante a fallas tiene un rendimiento superior en comparación al controlador sin compensación de fallas. / Tesis

Orientador: Isabel Cristina Boleli / Banca: Silvana Martinez Baraldi Artoni / Banca: Kênia Cardoso Bícego / Banca: Elisabeth Gonzáles / Banca: Vanessa Michalsky Barbosa / Resumo: Estresse por calor durante a criação altera o desempenho e as características morfofuncionais de frangos de corte. Programação térmica fetal tem se mostrado efetiva na indução de características adaptativas ao calor na incubação, aumentando a termotolerância das aves no período pós-eclosão, por meio de adaptação epigenética. O presente estudo analisou os efeitos da exposição à temperatura de incubação fria ou quente durante a fase fetal sobre as características morfofisiológicas de pintos na eclosão e de frangos criados sob temperatura de preferência, recomendada para a linhagem ou alta. No Capítulo 1 é apresentada uma abordagem teórica sobre o tema. No Capítulo 2 são abordados os efeitos da temperatura fria ou quente durante a fase fetal sobre parâmetros de incubação (temperatura da casca dos ovos e eclodibilidade), temperatura de preferência e características do pinto recém-eclodido (peso corporal e dos órgãos, características da pele e das penas, temperatura superficial corporal e retal e concentração plasmática de T3, T4 e GH). Para isso, ovos férteis de matrizes de frangos de corte (Cobb 500®) foram incubados a partir do 13° dia à temperatura fria (36°C), controle (37,5°C) ou quente (39°C). Os dados mostram que exposição ao frio diminuiu a temperatura superficial corporal, a vascularização da pele e a concentração plasmática de T3 e GH. Por outro lado, exposição ao calor aumentou a eclodibilidade dos ovos, a temperatura superficial corporal e a vascularização dérmica, reduziu a espessura da pele e aumentou a temperatura de preferência dos pintos. No Capítulo 3 foi estudado se a exposição à temperatura fria ou quente de incubação altera a temperatura de preferência e resposta ao estresse dos frangos ao longo da criação. Para isso, foi adotado o mesmo protocolo de incubação utilizado no Capítulo 1. Após a eclosão, as aves foram alojadas em câmara climática com... / Abstract: Heat stress changes the performance and morphological and functional characteristics of broilers. Thermal programming during fetal development has been shown to be effective in the induction of adaptive characteristics to heat, increasing the thermotolerance of the birds during the post-hatching period by epigenetic adaptation. This study examined the effects of exposure to cold or hot incubation temperature during the fetal stage on the physical and physiological characteristics of chicks, at hatching, and chickens reared under preferred, recommended or high temperature. In Chapter 1 we present a theoretical approach to the topic. In Chapter 2, the effects of cold or hot temperature during the fetal stage on incubation parameters (temperature, eggshell and hatchability), preferred ambient temperature and characteristics of newly hatched chicks (body and organs weight, skin and feathering characteristics, body surface and rectal temperature and plasma T3, T4 and GH concentrations) were examined. For this, hatching eggs from a commercial broiler breeder flock (Cobb 500®) were exposed from day 13 of incubation to cold (36°C), control (37.5°C) or hot (39°C) temperature. The data show that exposure to cold reduced body surface temperature, skin vascularity and plasma T3 and GH concentrations. Moreover, exposure to hot increased eggs hatchability, body surface temperature and dermal vascularity, reduced skin thickness and increased thermal preference of the chicks. In Chapter 3 was studied whether exposure to cold or hot incubation temperature alters preferred ambient temperature and response to heat stress of broilers along rearing phase. For this, we adopted the same incubation protocol used in Chapter 1. After hatching, the birds were housed in climatic chamber with temperature set to the recommended values for the line. Weekly, during the six weeks of rearing, thermal preference and response to heat stress of birds were ... / Doutor

Orientador: Newton Castagnolli / Banca: Dalton José Carneiro / Banca: João Donato Scorvo Filho / Banca: José Eurico Possebon Cyrino / Banca: Teresa Cristina Ribeiro Dias / Resumo: Alevinos de tilápia vermelha foram transferidos diretamente da água doce (0‰) para água do mar (35‰), e também submetidos a dois diferentes sistemas gradativos de aclimação: aumento gradual de salinidade em 5‰ a cada dia e, aumentos de 5‰ a cada dois dias. O estudo foi conduzido no Setor de Carcinicultura do Centro de Aqüicultura da Universidade Estadual Paulista (CAUNESP), Jaboticabal, SP. Três diferentes tamanhos de alevinos de tilápia vermelha foram testados: tratamento 1 - animais com 18,50 ± 1,2 mm; tratamento 2 - 49,33 ± 4,45 mm; tratamento 3 - 71,97 ± 5,7 mm respectivamente. Grupos de 10 animais (n = 3) de cada classe de tamanho foram transferidos diretamente da água doce para água do mar em aquários de 10 litros, aerados, e mantidos a 26ºC e com salinidade de 35‰, A mortalidade foi avaliada em intervalos de 15 minutos. Para aclimação gradativa, 25 animais por parcela (n = 3) foram mantidos em tanques cilíndrico-cônicos de 100 L equipados com filtro mecânico de 40 L com substrato de conchas marinhas. Os peixes foram alimentados duas vezes ao dia, sendo a temperatura, salinidade e mortalidade avaliadas diariamente. Os experimentos tiveram duração de 20 dias cada, e 20% dos indivíduos sobreviventes foram submetidos à biometria. Os dados foram analisados segundo delineamento fatorial 3 x 2. Os resultados demonstraram não haver sobrevivência da tilápia vermelha, quando transferida diretamente da água doce para a água do mar, para todos os tamanhos estudados. Os sistemas de aclimação demonstram a viabilidade de aclimação gradativa de alevinos de tilápia vermelha em todos os tamanhos testados, porém, a maior taxa de sobrevivência foi obtida com alevinos com comprimento padrão médio ³ a 49,3 mm e aumento de salinidade de 5‰.dia- 1, Os animais apresentaram melhores condições corporais quando aclimados mais lentamente (5‰ 2 dias-1) / Abstract: Red tilapia fingerlings were either directly transferred from freshwater to sea water (35‰) and also submitted to two different systems of gradual acclimation: daily increasing of 5‰ and the same gradual increment every two days. The study was set up at the Freshwater Prawn Laboratory, classes Aquaculture Center of the UNESP, Jaboticabal, SP. Three different size of red tilapia fingerlings were used: Trial 1 - 18.5 ± 1.2 mm, Trial 2 - 49.33 ± 4.45mm and Trial 3 - 71.9 ± 5.7 mm, respectively. Groups of 10 animals (n = 3) of each class were directly transferred to sea water in 10 L aquarium and maintained at 26oC, 35‰ salinity, and mortality were recorded every 15 minutes. For the gradual acclimation, 25 fish per parcel (n = 3) of each treatment were stocked in 100 L, conic-cylindrical tanks equipped with mechanical filter (40 L) made out of marine shell substrate. Fish were fed twice a day and water salinity and temperature and mortality were recorded every day. The experiment lasted for 20 days, 20% of the remained fish were weighed and data were analyzed through a 3 x 2 factorial. Results show that the tolerance of red tilapia to direct transfer to sea water increases with size until a certain extent, and that viability of a gradual acclimation to marine water as satisfactory for all tested class sizes but better survival rates were obtained with fingerlings measuring 49.3 mm total length, with a daily increase in salinity of 5‰. Better condition factor was presented by animals acclimated with 5‰ increase every two days / Doutor

A comunicação entre circuitos integrados tem evoluído em desempenho e confiabilidade ao longo dos anos. Inicialmente os projetos utilizavam barramentos paralelos, onde existe a necessidade de uma grande quantidade de vias, utilizando muitos pinos de entrada e saída dos circuitos integrados resultando também em uma grande suscetibilidade a interferências eletromagnéticas (EMI) e descargas eletrostáticas (ESD). Na sequência, ficou claro que o modelo de barramento serial possuía ampla vantagem em relação ao predecessor, uma vez que este utiliza um menor número de vias, facilitando o processo de leiaute de placas, facilitando também a integridade de sinais possibilitando velocidades muito maiores apesar do menor número de vias. Este trabalho faz uma comparação entre os principais protocolos seriais de baixa e média velocidade. Nessa pesquisa, foram salientadas as características positivas e negativas de cada protocolo, e como resultado o enquadramento de cada um dos protocolos em um segmento de atuação mais apropriado. O objetivo deste trabalho é utilizar o resultado da análise comparativa dos protocolos seriais para propor um aparato de hardware capaz de suprir uma deficiência encontrada no protocolo serial I2C, amplamente utilizado na indústria, mas que possui restrições quando a aplicação necessita alta confiabilidade. O aparato, aqui chamado de Monitor de Barramento I2C, é capaz de verificar a integridade de dados, sinalizar métricas sobre a qualidade das comunicações, detectar falhas transitórias e erros permanentes no barramento e agir sobre os dispositivos conectados ao barramento para a recuperação de tais erros, evitando falhas. Foi desenvolvido um mecanismo de injeção de falhas para simular as falhas em dispositivos conectados ao barramento e, portanto, verificar a resposta do monitor. Resultados no PSoC5, da empresa Cypress, mostram que a solução proposta tem um baixo custo em termos de área e nenhum impacto no desempenho das comunicações. / The communication between integrated circuits has evolved in performance and reliability over the years. Initially projects used parallel buses, where there is a need for a large amount of wires, consuming many input and output pins of the integrated circuits resulting in a great susceptibility to electromagnetic interference (EMI) and electrostatic discharge (ESD). As a result, it became clear that the serial bus model had large advantage over predecessor, since it uses a smaller number of lanes, making the PCB layout process easier, which also facilitates the signal integrity allowing higher speeds despite fewer pathways. This work makes a comparison between the main low and medium speed serial protocols. The research has emphasized the positive and negative characteristics of each protocol, and as a result the framework of each of the protocols in a more appropriate market segment. The objective of this work is to use the results of comparative analysis of serial protocols to propose a hardware apparatus capable of filling a gap found in the I2C protocol, widely used in industry, but with limitations when the application requires high reliability. The apparatus, here called I2C Bus Monitor, is able to perform data integrity verification activities, to signalize metrics about the quality of communications, to detect transient faults and permanent errors on the bus and to act on the devices connected to the bus for the recovery of such errors avoiding failures. It was developed a fault injection mechanism to simulate faults in the devices connected to the bus and thus verify the monitor response. Results in the APSoC5 from Cypress show that the proposed solution has an extremely low cost overhead in terms of area and no performance impact in the communication.

Orientador: Nubia Maria Correia / Banca: Roberto Estêvão Bragion de Toledo / Banca: Mariluce Pascoina Nepomuceno / Resumo: A escolha do tratamento químico (herbicida, associações de produtos, dosagem ou época de aplicação) deve considerar a sua seletividade para a cultura de interesse econômico. Além disso, o tratamento escolhido pode afetar a microbiota do solo. Assim, objetivou-se estudar a ação fitotóxica dos herbicidas sulfentrazone e amicarbazone para a cultura da cana-de-açúcar, especificamente, cana soca, utilizando-se o método de testemunhas pareadas para aumentar a precisão experimental; e avaliar a ação dos herbicidas na microbiota do solo. O trabalho englobou a realização de três experimentos em área de produção comercial de cana-de-açúcar, dois relacionados à seletividade dos herbicidas amicarbazone e sulfentrazone para soqueira de cana (cvs. RB855453 e SP87-365); e um sobre a ação desses herbicidas na microbiota do solo cultivado com cana soca (cv. RB975944). Nos dois experimentos sobre seletividade, o delineamento experimental foi de blocos ao acaso, em esquema de parcelas subdividias, com quatro repetições. Cada parcela foi subdividida em duas, o herbicida foi aplicado em uma metade e a outra metade foi mantida como testemunha pareada. Oito tratamentos com herbicidas foram estudados: amicarbazone (700 e 1050 g ha-1) e sulfentrazone (600 e 800 g ha-1), pulverizados em pré-emergência e brotação inicial da cana-de-açúcar (plantas com 2 a 3 folhas, 60% brotada). Foram realizações avaliações de fitointoxicação visual, altura, diâmetro, estande e produtividade de colmos, além de análises... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The choice of chemical treatments (herbicide, product associations, dosage or time of application) should consider selectivity for the culture of economic interest. Moreover, the chosen treatment can affect the soil microbiota. The aim of this study was to evaluate the phytotoxicity of herbicides sulfentrazone and amicarbazone for ratoon sugarcane, using the method of additional checks to increase experimental precision and assess the effect of herbcides on soil microbiota. The work included the development of three experiments in comercial área of sugarcane, two related to the selectivity of herbicides amicarbazone and sulfentrazone to ratonn (cvs RB855453 and SP87-365) Other for the action of these herbicides in the soil microbiota, cultivate with ratoon (cv. RB975944). Both selectivity experiments used randomized blocks experimental design with subdivided plots, with four replications. Herbicides was sprayed on half and the other was kept with an additional check. Eight herbicides treatments were studied: Amicarbazone (700 and 1050 g ha-1) and sulfentrazone (600 and 800 g ha-1), sprayed in pre-emergence and inicial sprouting of sugarcane (plants with 2-3 leaves, 60% sprouted). Were achievements reviews of visual phytotoxicity, height, stem diameter, stand, stem productivity and technological analysis. The soil microbiota experiment was in a randomized block design also with subdivided plot, with five replications. The plots were studied five treatments with herbicides (Amicarbaazone 700 and 1050 g ha-1, sulfentrazone at 600 and 800 g ha-1, and check); subplots, two soil sampling sites (row and interow of sugarcane) and in subsubplots, five samplings (before application - zero, 15, 30, 60 and 90 days after application). The assessment consisted in soil misture, microbioal respiratory rate, microbial biomass carbono ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Este trabalho trata da utilização de protocolos de comunicação de grupo para a disseminação de escritas em arquivos replicados. A replicação de arquivos tem como objetivo aumentar a disponibilidade dos dados mesmo mediante a ocorrência de alguma falha. Existem duas abordagens principais para a replicação de arquivos: a da cópia primária e das cópias ativas. Em ambas as abordagens é necessário que seja mantida a integridade dos dados replicados, de forma que todos cópias dos arquivos replicados estejam no mesmo estado. Essa integridade pode ser mantida pela escolha correta de uma estratégia de disseminação de escritas. Como os servidores que mantém cópias do mesmo arquivo formam um grupo de replicação, a disseminação de escritas pode ser feita através de comunicação de grupos. Neste trabalho são apresentados os sistemas de comunicação de grupo xAMp, da Universidade de Lisboa; Totem, Universidade da Califórnia; Transis da Universidade de Hebréia de Jerusalém; Horus, da Universidade de Cornell e Newtop da Universidade de Newcastle. Todos os sistemas descritos possuem características de comunicação de grupo e membership que permitem a sua utilização na disseminação de escritas para arquivos replicados. Este trabalho descreve, também, o protótipo PDERM (Protótipo para a Disseminação de Escritas em arquivos Replicados, através de Multicast), implementado para analisar o comportamento de um sistema de comunicação de grupo, o xAMp, na disseminação de escritas em arquivos replicados pela estratégia da cópia primária. Foi analisado o aspecto da manutenção da integridade das réplicas mesmo na ocorrência de falha do servidor primário.

O uso da recuperação de processos para obter sistemas computacionais tolerantes a falhas não é um assunto novo. Entretanto, a discussão de algoritmos para a recuperação em sistemas distribuídos, notadamente aqueles que se enquadram na categoria assíncrona, ainda encontra pontos em aberto. Este é o contexto do presente trabalho. Este trabalho apresenta um novo algoritmo de recuperação por retorno, em sistemas distribuídos. O algoritmo proposto é do tipo coordenado, e seus mecanismos componentes determinam que seja classificado como um algoritmo baseado em índices (index-based coordinated). Desta forma, a tolerância a falhas é obtida através do estabelecimento de linhas de recuperação, o que possibilita um retorno consideravelmente rápido, em caso de falha. Seu desenvolvimento foi feito com o objetivo de minimizar o impacto ao desempenho do sistema, tanto quando este estiver operando livre de falhas como quando ocorrerem as falhas. Além disso, os mecanismos componentes do algoritmo foram escolhidos visando facilitar a futura tarefa de implementação. A satisfação dos objetivos decorre principalmente de uma importante característica assegurada pelos mecanismos propostos no algoritmo: o não bloqueio da aplicação, enquanto é estabelecida uma nova linha de recuperação. Esta característica, associada ao rápido retorno, oferece uma solução promissora, em termos de eficiência, para a recuperação, um vez que o impacto no desempenho tende a ser reduzido, quando o sistema encontra-se operando em ambas condições: livre de erros ou sob falha. Diferentemente da maioria dos algoritmos coordenados encontrados na literatura, o algoritmo proposto neste trabalho trata as mensagens perdidas. A partir da análise das características das aplicações, bem como dos canais de comunicação, quando estes interagem com o algoritmo de recuperação, concluiu-se que os procedimentos usados para recuperação de processos devem prever o tratamento desta categoria de mensagens. Assim, o algoritmo proposto foi incrementado com um mecanismo para tratamento das mensagens que têm o potencial de tornarem-se perdidas, em caso de retorno, ou seja, evita a existência de mensagens perdidas. Uma das decisões tomadas durante o desenvolvimento do algoritmo foi a de permitir um processamento não determinístico. Na realidade, esta escolha visou o aumento do espectro das falhas que poderiam ser tratadas pela recuperação. Tradicionalmente, a recuperação por retorno é empregada para tolerar falhas temporárias. Entretanto, a diversidade de ambiente, freqüente nos SDs, também pode ser usada para tolerar algumas falhas permanentes. Para verificar a correção do algoritmo, decidiu-se empregar um formalismo existente. Assim, a lógica temporal de Lamport (TLA) foi usada na especificação dos mecanismos do algoritmo bem como em sua demonstração de correção. O tratamento referente às mensagens perdidas, atrav´es do uso de mensagens de resposta, associado com o uso de uma lógica temporal, levou à necessidade de rever os critérios de consistência. Esta revisão gerou um conjunto de fórmulas de consistência ajustadas à existência de mensagens de diferentes classes: mensagens da aplicação e mensagens de resposta.

Mecanismos de comunicação entre processos são fundamentais no desenvolvimento de sistemas distribuídos, já que constituem o único meio de compartilhar dados entre processos que não dispõem de memória comum. Um dos principais mecanismos de comunicação utilizados é a troca de mensagens entre os processos componentes do sistema. Existem muitas aplicações que são compostas por um conjunto de processos que cooperam para realizar uma determinada tarefa e que são mais facilmente construídas se o sistema operacional oferecer a possibilidade de se enviar uma mensagem a diversos destinos. Neste caso são necessários mecanismos que permitam a difusão confiável de uma mensagem para um grupo de processos em uma única operação. Tendo em vista esta necessidade, diversos protocolos têm sido apresentados na literatura para permitir a comunicação entre um grupo de processos com diferentes graus de complexidade e de desempenho. Este trabalho apresenta um ambiente para desenvolvimento e utilização de protocolos de comunicação em grupo, denominado FlexGroup. O ambiente divide os protocolos em suas características fundamentais, permitindo que estas características possam ser desenvolvidas separadamente como subprotocolos. Os subprotocolo são interligados através de uma interface comum e gerenciados pelo núcleo do ambiente. A comunicação entre as diversas máquinas da rede é gerenciada pelo FlexGroup, permitindo que o desenvolvedor de um novo subprotocolo possa somente se focar nas características específicas do seu protocolo. Esta modularidade permite, ainda, que apenas as partes de interesse de um novo protocolo precisem ser implementadas, além de também viabilizar a criação de um protocolo baseado nos já existentes no ambiente. Além disso, o ambiente permite que as aplicações de comunicação em grupo possam definir, através de uma biblioteca, o conjunto de subprotocolos que desejam utilizar, em tempo de execução, sem necessidade de conhecer a implementação interna dos subprotocolos.. Da mesma forma, alguém que se proponha a realizar comparações com os protocolos existentes, pode utilizar os diversos subprotocolos e as aplicações existentes, bastando alterar os protocolos utilizados em tempo de execução e avaliando somente as características que deseje analisar.

Las proteínas Ppz1 y Ppz2 de Saccharomyces cerevisiae son Ser/Thr fosfatasas involucradas en diferentes procesos celulares, tales como el mantenimiento de la integridad celular, la tolerancia salina y la regulación del ciclo celular en la transición G1/S. La mayor parte de los fenotipos asociados con la ausencia o la sobreexpresión de las fosfatasas Ppz son la consecuencia de la inhibición que ejercen estas fosfatasas sobre los transportadores de potasio de alta afinidad Trk1/2. En las primeras fases de este trabajo, sólo se había identificado una subunidad reguladora para estas fosfatasas, la proteína Hal3, y aunque el mecanismo mediante el cual ejerce esta inhibición se desconocía, sí se había descrito que esta proteína actúa como inhibidora de Ppz1 y Ppz2 en todas las funciones conocidas de Ppz1 En este trabajo presentamos nuevas dianas biológicas de las fosfatasas Ppz, como son la vía de calcio/calcineurina y el sistema de transporte de potasio de baja afinidad. En primer lugar, describimos que células que carecen de Ppz1 son hipertolerantes a altas concentraciones de sodio o litio debido a un incremento en la expresión del gen ENA1, que codifica el componente principal para la tolerancia salina en la levadura. Este efecto en la expresión de ENA1 es independiente de Trk1/2 pero totalmente dependiente de la vía de señalización de la fosfatasa calcineurina, sugiriendo así que Ppz1 inhibe, directa o indirectamente, la actividad de la calcineurina. Respecto a esta función, demostramos que Ppz1 actúa como un regulador negativo de la entrada de calcio que tiene lugar a través de la membrana plasmática. Por otro lado, células que carecen de Ppz1/2 y Trk1/2 necesitan más potasio para sobrevivir que células que carecen sólo de los transportadores de potasio de alta afinidad, hecho que sugiere que las fosfatasas Ppz son reguladores positivos de la entrada de potasio de baja afinidad Trk-independiente.También hemos identificado una segunda subunidad reguladora de las fosfatasas Ppz, denominada Vhs3. Vhs3 actúa inhibiendo las fosfatasas Ppz de igual modo a como lo hace su homólogo Hal3, aunque este último parece ser más eficiente. Además, demostramos que Hal3/Vhs3 participan en el proceso celular de la floculación. Ambas regulan negativamente la vía de señalización de la PKA que, a través de la activación del factor de transcripción Flo8, induce la expresión de la floculina Flo11 causando la floculación. Este efecto es dependiente de las fosfatasas Ppz y podría ser explicado por la regulación negativa que ejercen éstas sobre los transportadores de potasio Trk1/2.Finalmente, demostramos que Vhs3 y Hal3, que presentan homólogos en plantas y mamíferos, están involucradas en una función esencial que es independiente de su papel sobre Ppz1/2, ya que el doble mutante hal3 vhs3 y el cuádruple mutante hal3 vhs3 ppz1 ppz2 son letales mientras que el mutante ppz1 ppz2 no lo es. Además, la letalidad de la cepa hal3 vhs3 se suprime por la sobreexpresión de otros homólogos de Hal3, como es el caso de AtHal3a de Arabidopsis thaliana, sugiriendo que las funciones de Hal3 y Vhs3 Ppz-independientes están conservadas en otros eucariotas. Experimentos in vitro revelan que la proteína Hal3 de plantas (AtHal3a) cataliza uno de los pasos de la biosíntesis de coenzima A y que para ello requiere de dos residuos: la His90 y la Cys175. Aunque Vhs3 y Hal3 conservan el residuo histidina, no conservan el residuo equivalente a la Cys175, por tanto, no es evidente que esta nueva función sea participar en la síntesis de CoA. / The Saccharomyces cerevisiae Ppz1 and Ppz2 are Ser/Thr protein phosphatases involved in several cell processes, such as maintenance of cell integrity, salt tolerance and regulation of cell cycle at the G1/S transition. Most of the phenotypes associated with the absence or the overexpression of the Ppz phosphatases are the consequence of the inhibition that these phosphatases exert on the Trk1/2 high-affinity potassium transporters. At the early steps of this work, only one regulatory subunit of these phosphatases, Hal3, have been identified and, although its specific mechanism of function is still unknown, it has been described that this protein acts as an inhibitor of Ppz1 and Ppz2 for all the known functions of Ppz1.In this work we report evidences about the existence of other biological targets of the Ppz phosphatases, such as the calcium/calcineurin pathway and the low-affinity potassium uptake. First, we describe that cells lacking Ppz1 are hypertolerant to high concentrations of sodium or lithium due to an increased expression of the ENA1 gene, which codifies the major determinant for salt tolerance in yeast. This effect on ENA1 expression is independent of Trk1/2 but is fully dependent on the calcineurin pathway and suggests that Ppz1 inhibits, either directly or indirectly, the calcineurin activity. Concerning to this function, we reveal that Ppz1 acts as a negative regulator of the calcium import across the plasma membrane. On the other hand, cells lacking Ppz1/2 and Trk1/2 need more potassium than cells lacking only the high-affinity potassium transporters to survive, suggesting that the Ppz phosphatases are positive regulators of the Trk-independent low affinity potassium uptake.We also identify a second regulatory subunit of the Ppz phosphatases, named Vhs3. Vhs3 functions inhibiting the phosphatases Ppz, essentially as its homolog Hal3 does, although the last one seems to work more efficiently. In addition, we demonstrate that Hal3/Vhs3 proteins play a role in the flocculation process. They negatively regulate the PKA signalling pathway which, through the activation of the transcription factor Flo8, induces the expression of the Flo11 flocculine causing the flocculation. This effect is dependent on the Ppz phosphatases and could be explained by their inhibitory activity on Trk1/2. Finally, we demonstrate that Vhs3 and Hal3, which have homologs in both plants and mammals, are involved in an essential function that is independent of their role in regulating Ppz1/2, as the double mutant hal3 vhs3 and the hal3 vhs3 ppz1 ppz2 are lethal whereas the ppz1 ppz2 is not. The lethality of the hal3 vhs3 strain is suppressed by overexpression of other Hal3 homologs, such as the AtHal3a in Arabidopsis thaliana, suggesting that the Ppz-independent functions of Hal3 and Vhs3 are conserved in eukaryotes. In vitro experiments revealed that the plant Hal3 (AtHal3a) is involved in one step of the coenzyme A biosynthesis and that there are two residues completely necessary for this function: His90 and Cys175. Vhs3 and Hal3 have the histidine equivalent to His90, but neither of them possesses the equivalent Cys175 suggesting that the yeast homologs could not be involved in the biosynthesis of CoA.

Las especificidades del repertorio T se generan mediante la recombinación de segmentos génicos al azar por lo que un porcentaje de células son autoreactivas. La tolerancia del repertorio T hacia las moléculas propias se consigue en primera instancia mediante la selección tímica. El fenómeno de la expresión promiscua consiste en la expresión intratímica de autoantígenos periféricos propios de otros tejidos. Las células medulares tímicas, principalmente, serían las células encargadas de expresar estos autoantígenos. El gen AIRE es un factor de transcripción que se expresa principalmente en las celulas epiteliales medulares y que es responsable de regular la expresión promiscua en el timo. Este gen codifica para una proteina con dedos de zinc que ejerce su función regulando el nivel de transcripcion de los genes expresados promiscuamente, aunque todavía no está bien establecido el modelo de actuación. Otro nivel de regulación de la expresión génica se daría a nivel post-transcripcional donde la labilidad del tránscrito jugaría un papel importante de control. Los motivos AU son elementos de inestabilidad del tránscrito localizados en la zona 3' no traducida del gen y son signo de alto recambio y vida media corta del mensajero. Los genes que contienen motivos AU son de gran interés biológico ya que frecuentemente se encuentran en factores de transcripción, citocinas y oncogenes. Los objetivos de la tesis son: Diseñar un método para identificar genes con motivos AU en el timo con expresión diferencial en activación. Caracterizar un gen identificado mediante el objetivo anterior, ZNF304, a nivel de secuencia y análisis inicial en activación linfocitaria. Comprobar la expresión promiscua del gen de la insulina en el timo humano y el papel de los polimorfismos VNTR de su región promotora como locus de susceptibilidad establecido. Analizar la expresión del gen AIRE relacionándolo con la expresión del gen de la insulina como ejemplo de autoantígeno regulado por él y relacionar la influencia de AIRE y de los polimorfismos de insulina en la cantidad de mensajero final. Diseñamos un método llamado AU-DD válido para identificar genes con motivos AU y de ensayar la expresión diferencial de los mismos bajo diferentes estímulos. Secuenciamos el gen ZNF304, un gen con motivos dedos de zinc y caja KRAB. La caja KRAB está relacionada con represión transcripcional. El gen se expresaba principalmente en tejidos linfoides y la caracterización inicial a nivel de expresión en activación en mononucleares de sangre periférica daba como resultado una activación de modulación bifásica, con rápida respuesta a los 30 minutos de inducción y otro pico a las 6 horas que coincidía con el pico de activación de las citocinas. Detectamos mensajero de insulina en todas las muestras de timo total analizadas. Tipamos las muestras en función al polimorfismo VNTR que está en desequilibrio de unión con el polimorfismo PstI, fácilmente analizable mediante restricción de la zona no traducida del gen de la insulina. El alelo VNTR clase III, protector dominante de la diabetes tipo 1, producía mayor cantidad de insulina que el alelo que predispone, el de clase I. El nivel de insulina en el timo era variable de forma interindividual y ello correlacionaba con el nivel de expresión del gen AIRE dentro de la misma muestra analizada. / The diversity of the T cell receptor repertoire is generated by random recombination of genomic segments and so some cells bear autoreactive receptors. The T cell repertoire tolerance against self-molecules is accomplished first by thymic selection. The promiscuous expression consists in the intrathymic expression of peripheric autoantigens that are characteristics of other tissues. Thymic medullar cells are the main cell type that can express these autoantigens. AIRE gene is a transcription factor that is expressed mainly in the medullar epithelial cells and that is the most important regulator of this promiscuous expression of the thymus. This gene codes for a zinc finger protein that exerts its function modulating the level of transcription of the promiscuously expressed genes, although the mechanism of action is not precisely described. Another level of gene expression regulation is the post-transcription level where the lability of the transcripts plays an important role in the control. The AU motifs are elements of transcript lability localised in the 3'UTR of the genes and they are sign of high turnover and short half live of the messenger RNA. Genes containing AREs are of potentialbiological and pharmacological interest, as they often code for inflammatory mediators, cytokines, proto-oncoproteins, and transcription factors.The objectives of the thesis are:The design of a method to identify genes with AU motifs in the thymus with differential expression in activation.To characterise a gene identified by the method described in the objective number 1, ZNF304, sequence and initial analysis in lymphocyte activation.To analyse the promiscuous expression of the insulin gene in the human thymus and the role of the VNTR polymorphisms of the promoter region as susceptibility locus established.To analyse the AIRE gene expression and to relate it to the insulin gene expression as an example of autoantigen that is modulated by AIRE and to investigate the influence of AIRE and the insulin polymorphism in the final amount of message.We designed a method that we called AU-DD useful to identify AU containing genes and to assay the differential expression of them under different stimulations.We cloned and sequenced the ZNF304 gene, a zinc finger containing gene and KRAB box. The KRAB box is involved in the repression of the transcription. The gene is expressed mainly in lymphoid tissues and the initial characterisation in the expression in peripheral blood mononuclear cells activation results in biphasic activation and a rapid response at 30 minutes post-induction and another peak at the 6 hours that was coincident with the peak of the cytokines studied.We detect insulin mRNA in all the thymic samples analysed. We typed the samples for the VNTR polymorphism that is in linkage desequilibrium with the PstI polymorphism that is easy to analyse by RFLP analysis of the 3' UTR of the insulin gene. Class III VNTR alleles that confer a dominant protection, produces more insulin that class I predisposing allele. Insulin levels in the thymus show interindividual variable expression that correlate with the level expression of AIRE gene in the samples analysed.