L'utilisation des nanoparticules (NPs) métalliques en nanotechnologie entraîne un risque de contamination de l'environnement qui est difficile à évaluer en raison du manque de connaissance toxicologique sur les NPs. La compréhension des mécanismes de toxicité des NPs peut favoriser leur utilisation sécuritaire. Dans cette optique, l'objectif principal de cette thèse est de mieux comprendre la toxicité des NPs métalliques. Le premier objectif visait à évaluer les effets des NPs de CuO sur la photosynthèse à l'aide de bioindicateurs basés sur la fluorescence chlorophylienne. Les NPs de CuO encapsulées dans un polymère, modèle des NPs pouvant être libérées des peintures antisalissures, induisent une inhibition de la photosynthèse du macrophyte aquatique Lemna gibba. L'imagerie de fluorescence chlorophyllienne est montrée comme une approche utile pour évaluer la toxicité des NPs. De plus, en utilisant deux approches complémentaires de fluorescence chlorophyllienne, le cuivre ionique et les NPs de CuO ont montré des effets similaires sur l'activité photosynthétique. La solubilisation des NPs de CuO est donc proposée comme principal mécanisme d'action des NPs de CuO sur la photosynthèse. Le deuxième objectif consistait à déterminer comment l'encapsulation dans un polymère modifie la toxicité des NPs. La toxicité de NPs de CuO nues ou encapsulées a été évaluée chez l'algue Chlamydomonas reinhardtii. L'encapsulation augmente la toxicité des NPs encapsulées en augmentant leur pénétration dans la cellule, ce qui indique que la toxicité des NPs de CuO est associée à des interactions intracellulaires. Les mécanismes cellulaires d'action des NPs ont été étudiés chez L. gibba en évaluant la toxicité en relation avec l'accumulation de cuivre dans l'organisme. Cette relation indique que les NPs de CuO nues et encapsulées n'ont pas le même mode d'action au niveau cellulaire. La modification des propriétés de surface des NPs par l'encapsulation modifie le mécanisme d'action cellulaire en augmentant la formation d'espèces réactives de l'oxygène. Les NPs métalliques peuvent donc avoir des mécanismes d'action différents selon leurs propriétés physico-chimiques. Le dernier objectif était de caractériser la toxicité des NPs métalliques chez différents modèles biologiques. Pour les NPs d'or stabilisées par un dendrimère poly(amidoamine) (PAMAM), la toxicité était liée au changement des propriétés physico-chimiques des NPs dans le milieu. Ces NPs étaient toxiques pour l'algue C. reinhardtii et la bactérie Vibrio fischeri alors que les cellules animales Neuro-2A et Vero n'étaient pas affectées. La différence de sensibilité était liée à l'altération des propriétés des NPs dans le milieu, soulignant ainsi le besoin de caractériser les NPs dans le milieu utilisé pour évaluer la toxicité. Pour les NPs de CuO, la toxicité a été étudiée en conditions in vitro chez la lignée cellulaire Neuro-2A. Les NPs de CuO ont montré des effets cytotoxiques et génotoxiques sur ces cellules. La formation de micronoyaux était l'indicateur de toxicité le plus sensible, ce qui montre que la génotoxicité est un aspect important de la toxicité des NPs de CuO. Cette thèse permet de conclure que l'évaluation du risque toxicologique des NPs métalliques doit être réalisée en considération du changement de leurs propriétés physicochimiques selon le milieu utilisé et les modifications apportés aux NPs. La compréhension des liens entre les propriétés des NPs et leur toxicité peut permettre une utilisation plus sécuritaire des nanomatériaux dans les applications issues de la nanotechnologie. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : nanotoxicologie, génotoxicité, photosynthèse, fluorescence chlorophyllienne.

Les activités militaires sont la source d'une contamination importante des sols par des matériaux énergétiques ou explosifs tels que le HMX, le RDX ou le TNT et par de nombreux métaux. Cette situation se rencontre notamment au Canada. La toxicité individuelle (et même de certains mélanges) de ces contaminants est bien connue et laisse, à priori, présager de risques pour les organismes et les écosystèmes. Cependant, la forme sous laquelle se retrouvent les contaminants porte à croire que leur biodisponibilité pourrait être limitée. Celle-ci constitue donc un facteur clé, comme dans la plupart des cas de pollution. Or, il s'agit d'un paramètre qui résulte de plusieurs processus relevant de plusieurs disciplines différentes d'où la difficulté d'en cerner la notion et la pluralité de définitions qu'on en trouve. Dans cette étude, nous avons considéré la biodisponibilité comme une variable à caractère toxicologique et la bioaccessibilité comme une variable chimique, incorporée à la biodisponibilité. De par sa nature même, la quantification de la biodisponibilité requiert une approche intégrée incluant des indicateurs biologiques et chimiques pertinents. Dans un premier volet, deux sols de texture très différente (l'un prélevé sur une base militaire et l'autre, de type forestier) ont été amendés avec du Pb ou du HMX puis évalués quant à leur toxicité envers Eisenia andrei et leur biodisponibilité respective. Nous avons aussi déterminé l'incidence de la présence de vers sur le pH du sol et sur la bioaccessibilité du Pb et les teneurs de HMX soluble. La présence de vers a fait augmenter significativement le pH du sol de type militaire mais aucun effet n'a été relevé dans le sol forestier. En contrepartie, la bioaccessibilité du Pb à la fin de la période d'exposition était significativement réduite dans le premier cas mais augmentée dans le second. Aucune variation significative de cet ordre n'a été observée avec le HMX. En outre, la bioaccessibilité du Pb et les concentrations en HMX soluble étaient supérieures dans le sol provenant de la base militaire. En termes de toxicité, le Pb et le HMX se sont avérés tous deux significativement plus toxiques dans le sol d'origine militaire que dans le sol forestier (CE₅₀ pour effets sur la reproduction de E. andrei de 81 mg.kg¯¹ contre 1068 pour le Pb et 9.1 contre 3l pour le HMX). Une différence de biodisponibilité est donc fort vraisemblablement à l'origine de l'écart de toxicité constaté entre les deux sols. Une seconde étude a porté sur la biodisponibilité et la toxicité des contaminants dans les sols d'une base militaire canadienne. Nous y avons mesuré des indicateurs chimiques comme les teneurs en contaminants, des paramètres toxicologiques conventionnels et une batterie de biomarqueurs (enzymes antioxydants, détoxication et paramètres lysosomiaux) chez E. andrei. Nos résultats indiquent que ces sols sont contaminés par du HMX et plusieurs métaux dont les principaux sont le Cu, le Pb, le Zn, le Bi, le Cr, le Ni et le Cd. Les substances les plus accessibles dans les sols étaient le HMX ainsi que le Bi, le Pb, le Zn et le Cd. Tout comme pour le sol militaire témoin utilisé lors des expériences avec ajout de toxique, le pH de la majorité des sols était plus élevé au terme de la période d'exposition. Quant aux concentrations tissulaires des contaminants chez E. andrei, les éléments prépondérants étaient le Cu, le Zn et le Bi. L'accumulation préférentielle de ces substances pourrait s'expliquer en termes de bioaccessibilité, de mécanisme de détoxication ou de compétition entre certains éléments comme le Bi et le Pb. A l'exception d'un sol dans lequel de la létalité a été observée, les résultats de toxicité chez E. andrei étaient de nature sous-létale avec toutefois une inhibition complète de la reproduction dans les échantillons contaminés. Les réponses majeures des biomarqueurs étaient une augmentation de l'activité de la superoxyde dismutase et une réduction du temps de rétention du rouge neutre (fragilisation de la membrane Iysosomiale). La réponse du rouge neutre concorde avec les gradients de métaux dans les sols. Quant à l'effet sur la SOD, nous postulons que le HMX pourrait générer un stress oxydant responsable de son activation. En dernière partie de notre travail, nous avons soumis les résultats rapportés dans la section précédente à une analyse statistique relativement complexe. Au moyen de modèles et d'outils propres à mettre en lumière des associations entre les variables potentiellement impliquées dans la biodisponibilité nous avons tenté de dégager une évaluation synthétique de la biodisponibilité dans ces sols de type militaire. Nous avons exploré les régressions linéaires entre les caractéristiques physico-chimiques du sol et les concentrations de contaminants bioaccessibles, d'une part, ainsi qu'entre ces dernières et les réponses des biomarqueurs ou les concentrations dans les tissus, d'autre part. Une récente procédure de compilation d'un indice global de biomarqueurs a finalement été appliquée sur les sols étudiés afin d'obtenir un indicateur de leur qualité. Les régressions linéaires obtenues confirment l'existence d'une corrélation inverse entre le pH et la disponibilité des métaux d'une part et le potentiel de sorption des argiles, de la matière organique et des oxydes métalliques amorphes d'autre part. Des équations ont même été dérivées pour le Bi et le HMX (composés peu caractérisés jusqu'ici). Une relation marquante est ressortie entre les concentrations de contaminants bioaccessibles et les biomarqueurs, notamment la contribution du HMX à l'activité de la SOD, ce qui corrobore l'hypothèse d'un potentiel prooxydant du HMX. Enfin, les indices intégrés de biomarqueurs quant à la qualité des sols militaires concordent tant avec les niveaux de contamination qu'avec les réponses et la sensibilité des différents biomarqueurs. Globalement, les résultats générés dans la présente étude de la biodisponibilité envoient donc aux gestionnaires de ces sols militaires un signal à l'effet que plusieurs substances délétères pour l'environnement y sont peut-être plus biodisponibles qu'on ne le croyait, ce qui en augmente d'autant les risques pour les organismes vivants. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Approche intégrée, Biodisponibilité, Bioaccessibilité, Biomarqueurs, Eisenia andrei, Explosifs, Métaux, Sols.

Ce travail porte sur l'étude du polyglyoxylate d'ethyle (PGEt) : sa synthèse, sa caractérisation et sa dégradation. Le PGEt a été obtenu par polymérisation anionique. Les conditions optimales font intervenir un amorçage par NE3 dans le CH2Cl2 à une température inférieure à -20°C. L'existence d'une température plafond (Tp = 310K pour [M]0 = 1M) nécessite l'utilisation d'agents de terminaison (phényl isocyanate ou bromure de 2-bromo-2-méthyl propionyle) afin d'obtenir des PGEt stables. La dégradation par hydrolyse in vitro du PGEt a été étudiée par RMN 1H, CES... Le mécanisme fait intervenir des coupures de chaines et des hydrolyses des esters. Les produits ultimes de dégradation identifiés sont l'éthanol et l'hydrate d'acide glyoxylique. Le caractère biodégradable du PGEt a été confirmé par respirométrie. Des études préliminaires de toxicité (sur des hématies, le nématode C. Elegans, et la croissance des plantes) n'ont pas révélé d'effet nocif du PGEt et de ses produits de dégradation. / This work focuses on the study of poly(ethyl glyoxylate) (PRtG), from its synthesis and its characterization to its degradation to some biological applications. The chosen conditions for PEtG's synthesis were initiated by an anionic way (NEt3) in presence of CH2Cl2. Because the ceiling temperature of the monomer (EtG) is low (7°C), it is necessary to block the hydroxyl ended groups generated in situ. The use of PhNCO leads to stables PEtG. The PEtG can be used as a macroinitiator of atom transfer radical polymerization (ATRP if it is wisely done. The copolymerization of styrene is then controlled. The degradation by in vitro hydrolysis of PEtG mainly led to ethanol and glyoxylic acid hydrate release. The biodegradable character of PGEt was assessed by a respirometric test and a preliminary study of toxicity (on red blood cells, worms and plants) revealed no significant effect at the concentrations generally used.

Les infections par cytomégalovirus sont un problème majeur en transplantation rénale du fait de l’augmentation du risque de perte de greffon et de l’augmentation de la morbi-mortalité des patients. Toutefois la mise en place d’un traitement prophylactique par ganciclovir a significativement fait diminuer l’incidence de ces infections. Cette efficacité est toutefois limitée par une importante hématotoxicité notamment des neutropénies. La survenue de cet évènement indésirable conduit à une réduction des doses voire à un arrêt du traitement, favorisant ainsi l’émergence de résistances virales. Ces résistances sont un problème grandissant chez les personnes transplantées du fait du manque de protocole de prise en charge de celles-ci. Dans ce contexte notre objectif était de mieux comprendre la survenue et le mécanisme de cette toxicité. Dans un premier temps nous avons étudié le métabolisme intracellulaire du ganciclovir chez des patients. Nous avons remarqué qu’il y a une forte corrélation entre l’exposition à la forme active du ganciclovir et la diminution du nombre de neutrophiles au 3ème mois de traitement. Nous avons par la suite étudié l’impact de variations génétiques sur des transporteurs. Nous avons remarqué qu’un polymorphisme était fortement associé à une diminution du nombre de neutrophiles et qu’il entrainait également une augmentation de la concentration intracellulaire de ganciclovir à l’aide d’un modèle in vitro. Cette thèse fournit de nouveaux outils d’exploration du métabolisme et de l’accumulation intracellulaire du ganciclovir qui pourraient être utiles pour la prévention de la survenue de neutropénies sous ganciclovir. / Cytomegalovirus infection is a major issue in transplant patients as it affects the graft survival and contributes to patients’ morbi-mortality. The implementation of ganciclovir prophylaxis has significantly decreased its incidence, however GCV frequently induces neutropenia. This adverse effect leads to a decrease in the ganciclovir dose or to a discontinuation of the therapy, thereby favoring viral resistance. Resistance to ganciclovir is a growing problem in solid organ transplantion because of the lack of proper data to support treatment decisions when it is encountered. In this context we aim at better understanding the factors involved in this toxicity. First we explored the intracellular metabolism of ganciclovir in patients’ white blood cells. We found that the active form of ganciclovir is associated with neutrophil toxicity at month 3 of treatment. Then we explored the effect of targeted polymorphisms among transporter genes in two cohorts of renal transplant patients. We found that a single nucleotide polymorphism is strongly associated with a decrease in the neutrophil count and in ganciclovir intracellular accumulation. This thesis provides relevant tools for a deeper exploration of ganciclovir intracellular metabolism and accumulation which might be useful for the prevention of ganciclovir induced neutropenia.

Les glucocorticoïdes (GCs) présentent un intérêt majeur dans le traitement de nombreuses pathologies. Dans l’œil, ils sont injectés à fortes doses directement dans le globe oculaire pour traiter les inflammations, l’œdème maculaire et la néovascularisation qui menacent la vision. Bien que spectaculaires, les effets anatomiques bénéfiques obtenus par ce traitement ne sont pas toujours corrélés avec les résultats fonctionnels et la récupération d’une acuité visuelle normale. En effet, cette thérapeutique empirique (hors AMM) a montré une corticotoxicité sur les cellules de la rétine et les vaisseaux assurant leur viabilité. Un double effort s’impose pour pallier ces inconvénients. D’une part, les études fondamentales visant à mieux comprendre les mécanismes de toxicité des glucocorticoïdes sont encore nécessaires pour être en mesure deproposer des schémas thérapeutiques rationnels. D’autre part, la mise en œuvre des compétences des laboratoires pharmaceutiques, avec le développement de nouvelles molécules, pour répondre au compromis d’obtenir une efficacité thérapeutique équivalente aux glucocorticoids avec moins d’effets secondaires sur les tissus s’impose. Dans cette optique, l’objectif de mon travail de thèse a été de mieux comprendre les mécanismes de toxicité cellulaire induits par different glucocorticoïdes sur les cellules endothéliales de la microcirculation générale dermique et rétinienne. J’ai montré que la toxicité varie selon le type cellulaire et du type GC, aussi que les mécanismes de mort déclenchés avec ces principes actifs ne sont pas toujours les mêmes. Le second vol et de ma thèse a porté sur la confirmation et l’évaluation de l’efficacité préclinique d’un nouveau traitement anti-inflammatoire, conçu par un laboratoire pharmaceutique suisse, dans le traitement des états inflammatoires en ophtalmologie. Ces travaux améliorent notre connaissance de la toxicité cellulaire des glucocorticoïdes en général et de la cytotoxicité microvasculaire en particulier. / Glucocorticoids (GCs) present a major interest in the treatment of numerous pathologies. In the eye, they are injected directly in high doses to treat inflammation, macular edema, and vision-threatening neovascularization. Although spectacular, the beneficial anatomical effects obtained by this treatmentare not still correlated to the functional resultsand the recovery of a normal visual acuteness. These empirical therapeutics (except AMM) showed a corticotoxicity on the cells of the retina and the vessels that assure their viability. A two-fold effort is imperative to mitigate these inconveniences. First, fundamental studies to better understand the mechanisms of toxicity of glucocorticoids are still necessary to be able to propose rational therapeutic plans. Second, the implementation of the skills of pharmaceutical companies, with the development of new molecules, in order to obtain an equivalently efficient therapy using glucocorticoids with fewer side effects on tissues is imperative. From this perspective, the objective of my work was to understandthe mechanisms of cellular toxicity caused by different glucocorticoids on endothelial cellsof the dermic and retinal general microcirculation. I showed that toxicity varies according to the cellular type and that the mechanisms of cells death activated with these drugs are not always the same. The second part of my thesis concerned the confirmation and the evaluation of the preclinical efficiency of a new anti-inflammatory treatment, conceived by a Swiss pharmaceutical company, in the treatment of the inflammatory states in ophthalmology. These works improve our knowledge of the general cellular toxicity of glucocorticoids and provides further insight to the microvascular cytotoxicity associated with this treatment option.

Le mélanome uvéal est la tumeur primaire intraoculaire la plus fréquente chez l'adulte. L'un des traitements le plus souvent utilisé afin d'obtenir un contrôle local de la tumeur s'appelle la curiethérapie par plaque. Malgré un faible taux de récidive locale avec cette technique, la grande majorité des patients développeront des complications oculaires secondaires à la radiation cinq ans après le diagnostic initial. Le manque de modèles ex vivo ou in vitro de mélanome uvéal rend difficile la validation de plaques de curiethérapie personnalisées et le calcul des différents profils de dose par les algorithmes Monte-Carlo. Un fantôme dosimétrique bio-imprimé représentant l'œil humain contenant une tumeur uvéale de forme définie serait un modèle in vitro optimal pour l'évaluation de différents profils de dose dans le développement de plaques de curiethérapie personnalisées. Dans cette étude, la viabilité et la prolifération des cellules cancéreuses du mélanome uvéal ainsi que des fibroblastes et mélanocytes choroïdiens en culture dans un environnement tridimensionnel, soit une matrice extracellulaire commerciale (Matrigel®) ou un hydrogel imprimable, ont d'abord été mesurées par microscopie en contraste de phase ou en fluorescence. Ensuite, l'expression de marqueurs de prolifération, d'hypoxie et de dommages à l'ADN a été déterminée dans les cellules cancéreuses du mélanome uvéal cultivées en monocouche ou enrobées dans le Matrigel®, dans l'optique future d'étudier ces marqueurs lors de l'irradiation du modèle bio-imprimé de tumeur uvéale avec une plaque personnalisée. L'évaluation chirurgicale de prototypes de plaques de curiethérapie non radioactives a été faite afin de comparer les différentes itérations entre elles et aux plaques conventionnelles. Enfin, les caractéristiques à améliorer pour le développement d'un modèle biologique contenant une tumeur uvéale ont été discutées et les aspects techniques problématiques des premières plaques imprimées ont été identifiés afin d'optimiser les prochains prototypes de plaques personnalisées. Mes travaux représentent un avancement des connaissances sur les modèles in vitro 3D du mélanome uvéal et le traitement de cette tumeur oculaire par curiethérapie par plaque. Mon mémoire pourra servir de base aux projets subséquents visant soit i) à élucider l'impact des interactions des cellules cancéreuses avec leur microenvironnement sur la résistance thérapeutique de ce cancer ou ii) à tester de nouvelles stratégies thérapeutiques sur un modèle bio-imprimé de mélanome uvéal primaire. / Uveal melanoma is the most common primary intraocular tumor in adults. One of the treatments most often used to achieve local tumor control is called plaque brachytherapy. Despite a low local recurrence rate with this technique, most patients will develop ocular complications secondary to radiation five years after the initial diagnosis. The lack of ex vivo or in vitro models of uveal melanoma makes it difficult to validate personalized brachytherapy plates and to calculate the different dose profiles by Monte-Carlo algorithms. A bioprinted dosimetry phantom representing the human eye containing a defined uveal tumor would be an optimal in vitro model for the evaluation of different dose profiles in the development of personalized brachytherapy plates. In this study, the viability and proliferation of uveal melanoma cells, as well as choroidal fibroblasts and melanocytes in culture in a three-dimensional environment, either a commercial extracellular matrix (Matrigel®) or a printable hydrogel, were first measured by phase contrast or fluorescence microscopy. Then, the expression of markers of proliferation, hypoxia and DNA damage was determined in uveal melanoma cells cultured as monolayer or embedded in Matrigel®, in the future perspective of studying these markers after the irradiation of the bioprinted uveal tumor model using a personalized plate. The surgical evaluation of prototypes of non-radioactive brachytherapy plates was done in order to compare the different iterations with each other and with conventional plates. Finally, the characteristics to be improved for the development of a biological model containing an uveal tumor were discussed, and the problematic technical aspects of the printed plates were identified in order to optimize the next prototypes of personalized plates. My work represents an advancement of knowledge on in vitro 3D models of uveal melanoma and the treatment of this ocular tumor by plaque brachytherapy. My master's thesis could serve as a basis for subsequent projects aiming either i) to elucidate the impact of interactions of cancer cells with their microenvironment on the therapeutic resistance of this cancer or ii) to test new therapeutic strategies on a bioprinted model of primary uveal melanoma.

Le mélanome uvéal est la tumeur primaire intraoculaire la plus fréquente chez l'adulte. L'un des traitements le plus souvent utilisé afin d'obtenir un contrôle local de la tumeur s'appelle la curiethérapie par plaque. Malgré un faible taux de récidive locale avec cette technique, la grande majorité des patients développeront des complications oculaires secondaires à la radiation cinq ans après le diagnostic initial. Le manque de modèles ex vivo ou in vitro de mélanome uvéal rend difficile la validation de plaques de curiethérapie personnalisées et le calcul des différents profils de dose par les algorithmes Monte-Carlo. Un fantôme dosimétrique bio-imprimé représentant l'œil humain contenant une tumeur uvéale de forme définie serait un modèle in vitro optimal pour l'évaluation de différents profils de dose dans le développement de plaques de curiethérapie personnalisées. Dans cette étude, la viabilité et la prolifération des cellules cancéreuses du mélanome uvéal ainsi que des fibroblastes et mélanocytes choroïdiens en culture dans un environnement tridimensionnel, soit une matrice extracellulaire commerciale (Matrigel®) ou un hydrogel imprimable, ont d'abord été mesurées par microscopie en contraste de phase ou en fluorescence. Ensuite, l'expression de marqueurs de prolifération, d'hypoxie et de dommages à l'ADN a été déterminée dans les cellules cancéreuses du mélanome uvéal cultivées en monocouche ou enrobées dans le Matrigel®, dans l'optique future d'étudier ces marqueurs lors de l'irradiation du modèle bio-imprimé de tumeur uvéale avec une plaque personnalisée. L'évaluation chirurgicale de prototypes de plaques de curiethérapie non radioactives a été faite afin de comparer les différentes itérations entre elles et aux plaques conventionnelles. Enfin, les caractéristiques à améliorer pour le développement d'un modèle biologique contenant une tumeur uvéale ont été discutées et les aspects techniques problématiques des premières plaques imprimées ont été identifiés afin d'optimiser les prochains prototypes de plaques personnalisées. Mes travaux représentent un avancement des connaissances sur les modèles in vitro 3D du mélanome uvéal et le traitement de cette tumeur oculaire par curiethérapie par plaque. Mon mémoire pourra servir de base aux projets subséquents visant soit i) à élucider l'impact des interactions des cellules cancéreuses avec leur microenvironnement sur la résistance thérapeutique de ce cancer ou ii) à tester de nouvelles stratégies thérapeutiques sur un modèle bio-imprimé de mélanome uvéal primaire. / Uveal melanoma is the most common primary intraocular tumor in adults. One of the treatments most often used to achieve local tumor control is called plaque brachytherapy. Despite a low local recurrence rate with this technique, most patients will develop ocular complications secondary to radiation five years after the initial diagnosis. The lack of ex vivo or in vitro models of uveal melanoma makes it difficult to validate personalized brachytherapy plates and to calculate the different dose profiles by Monte-Carlo algorithms. A bioprinted dosimetry phantom representing the human eye containing a defined uveal tumor would be an optimal in vitro model for the evaluation of different dose profiles in the development of personalized brachytherapy plates. In this study, the viability and proliferation of uveal melanoma cells, as well as choroidal fibroblasts and melanocytes in culture in a three-dimensional environment, either a commercial extracellular matrix (Matrigel®) or a printable hydrogel, were first measured by phase contrast or fluorescence microscopy. Then, the expression of markers of proliferation, hypoxia and DNA damage was determined in uveal melanoma cells cultured as monolayer or embedded in Matrigel®, in the future perspective of studying these markers after the irradiation of the bioprinted uveal tumor model using a personalized plate. The surgical evaluation of prototypes of non-radioactive brachytherapy plates was done in order to compare the different iterations with each other and with conventional plates. Finally, the characteristics to be improved for the development of a biological model containing an uveal tumor were discussed, and the problematic technical aspects of the printed plates were identified in order to optimize the next prototypes of personalized plates. My work represents an advancement of knowledge on in vitro 3D models of uveal melanoma and the treatment of this ocular tumor by plaque brachytherapy. My master's thesis could serve as a basis for subsequent projects aiming either i) to elucidate the impact of interactions of cancer cells with their microenvironment on the therapeutic resistance of this cancer or ii) to test new therapeutic strategies on a bioprinted model of primary uveal melanoma.

Au cours des dernières décennies, les antimicrobiens naturels d'origine bactérienne, telles que les bactériocines et la reutérine, ont reçu une attention considérable entant que conservateurs alimentaires ou comme alternatives aux antibiotiques pour les secteurs humain et animal. L'approbation des bactériocines et de la reutérine entant que bio-conservateurs ou assainisseurs par les organismes réglementaires repose non seulement sur les preuves d'efficacité mais également sur des données crédibles de cytotoxicité et de comportement dans l'environnement gastro-intestinal. Bien que les activités antimicrobiennes des bactériocines et de la reutérine soient largement documentées dans la littérature, très peu de données sont disponibles sur leur biodisponibilité dans les matrices biologiques et sur leur toxicité pour les différentes applications. Par conséquent, l'objectif général de cette thèse est d'évaluer, à travers différents modèles in vitro, la stabilité gastro-intestinale, l'activité biologique et la toxicité des bactériocines et de la reutérine en vue de leur utilisation dans différentes applications alimentaire, médicale et vétérinaire. Le premier objectif spécifique était de produire, purifier et évaluer l'activité antimicrobienne des bactériocines et de la reutérine seules et en combinaison contre un large panel de organismes pathogènes et d'altération d'intérêt pour les différents secteurs. Cinq consortia synergiques différents ont été identifiés, dont trois -microcine J25 + l'acide citrique + l'acide lactique, microcine J25 + reutérine + acide citrique, et microcine J25 + reutérine + acide lactique- ont montré une activité significative contre Salmonella enterica subsp. enterica serovar Newport ATCC6962 (indice FIC = 0,5). Deux autres combinaisons- pédiocine PA-1 + acide citrique+ acide lactique, et reutérine + acide citrique + acide lactique- ont montré des effets partiellement synergiques contre Listeria ivanovii HPB28 (indice FIC = 0,75). Le deuxième objectif spécifique était d'évaluer la stabilité gastro-intestinale de la reutérine à l'aide d'un modèl simulant des conditions digestives chez l'humain ainsi que l'activité hémolytique et la cytotoxicité in vitro de la reutérine par dosage au rouge neutre et dosage colorimétrique à la lactate déshydrogénase (LDH) en utilisant la lignée cellulaire Caco-2. La reutérine s'est révélée biologiquement très stable los du transit gastro-intestinal. L'exposition des cellules Caco-2 à différentes concentrations de réutérine n'a montré aucun effet négatif sur la viabilité ni sur l'intégrité des cellules à des concentrations allant jusqu'à 1080 mM. De plus, aucune hémolyse n'a été observée sur les cellules sanguines exposées à des concentrations allant jusqu'à 270 mM de reutérine. En conséquence, cette étude nous a permis de démontrer que la réutérine peut être utilisée de façon très sécuritaire à des concentrations n'excédant pas 270 mM, dans différentes applications. Le troisième objectif était d'évaluer la stabilité gastro-intestinale et l'activité de la microcine J25, de la pédiocine PA-1, de la bactofencine A et de la nisine à l'aide de modèles in vitro. De plus, la cytotoxicité et l'activité hémolytique de ces bactériocine sont été étudiées sur des cellules Caco-2 et des érythrocytes de rat, respectivement. Nos résultats ont montré que la pédiocine PA-1, la bactofencine A et la nisine sont dégradées à différents niveaux lors du transit gastro-intestinal, tandis que la microcine J25 n'est que partiellement dégradée. D'autre part, les études réalisées sur les cellules Caco-2 n'ont montré aucun effet cytotoxique jusqu'à des concentrations de 400 µg/mL. L'étude sur les érythrocytes de rat a montré un effet, hémolytique significatif lorsque la pédiocine PA-1, la bactofencine A et la nisine sont utilisées à des concentrations supérieures à 50 µg/mL, tandis que la microcine J25 n'a montré aucun effet hémolytique Dans le quatrième objectif, la toxicité cutanée de la reutérine, de la microcine J25, de la pédiocine PA-1, de la bactofencine A et de la nisine Z a été étudiée in vitro en utilisant des tests de libération de rouge neutre et de LDH sur des cellules NHEK. Les potentiels de sensibilisation et d'irritation cutanée de ces mêmes bactériocine sont également été déterminés en utilisant respectivement le test h-CLAT et le modèle épidermique humain EpiDerm™. Les essais réalisés sur les cellules NHEK ont montré que l'exposition de ces cellules aux bactériocines et à la reutérine à des concentrations allant à 400 µg/mL et 80 mg/mL respectivement, n'a entrainé aucun effet cytoxique. De plus, la microcine J25 et la reutérine n'ont montré aucune sensibilisation cutanée à des concentrations allant à 100 µg/mL et 40 mg/mL, respectivement, tandis que la pédiocine PA-1, la bactofencine A et la nisine Z ontprovoqué une sensibilisation à des concentrations supérieures à 100 µg/mL. La viabilité des tissus n'a pas été affectée en présence de bactériocines et de reutérine à des concentrations allant jusqu'à 200 µg/mL et 40 mg/mL, respectivement. L'ensemble de ces résultats montre que certaines bactériocines et la reutérine pourraient être incorporées en toute sécurité comme ingrédient antimicrobien dans différentes préparations topiques destinées à des applications humaines et animales Finalement, le dernier chapitre de la thèse a été consacré au développement et à la caractérisation de différents hydrogels à activité antimicrobienne et ayant comme principe actif des bactériocines ou de la réutérine. La reutérine, la pédiocine PA-1 et la microcine J25 ont été incorporées dans des formules d'hydrogel développées à partir de biopolymères à base de chitosan (1,5% , 2,5%) ou de carboxymethle cellulose (CMC 3% , 5%). Les hydrogels développés ont été caractérisés en termes d'aspect général, de viscosité, d'activité antimicrobienne et de stabilité pendant lors de l'entreposage à température ambiante. Les résultats obtenus ont montré que le chitosane à 1,5 % et 2,5 % contenant de la microcine J25 ou de la pédiocine PA-1demontré une activité inhibitrice significative durant toute la période d'entreposage. L'effet inhibiteur de la microcine J25 et de la reutérine dans les hydrogels CMC 3% et 5% est resté inchangé tandis que la pédiocine ajouté aux hydrogels de CMC 3% et 5% a perdu son activité dès la première semaine. En termes de viscosité, l'ajout d'antimicrobiens aux hydrogels n'a pas affecté leur viscosité et toutes les formules sont restées stables pendant les quatre semaines d'entreposage. Les résultats obtenus montrent que les formules développées présentent un fort potentiel d'application dans les secteurs alimentaire, médical et vétérinaire. En conclusion, le travail décrit dans cette thèse a permis de générer des résultats uniques sur le comportement, l'activité biologique, la stabilité et la toxicité de plusieurs composés antimicrobiens d'origine bactérienne incluant différentes bactériocines et la reutérine. Différents modèles in vitro récents et protocoles expérimentaux ont alors été utilisés et adoptés pour notre étude. Les résultats obtenus sont très pertinents et sont indispensable dans les démarches d'homologation de ces composés naturels par les différents organismes règlementaires pour différentes applications que ce soit pour le secteur alimentaire, médicale et/ou vétérinaire. En conclusion, le travail décrit dans cette these a permis de générer des résultats uniques sur le comportement, l'activité biologique, la stabilité et la toxicité de plusieurs composés antimicrobiens d'origine bactérienne incluant différentes bactériocines et la reutérine. Différents modèles in vitro récents et protocoles expérimentaux ont alors été utilisés et adoptés pour notre étude. Les résultats obtenus sont très pertinents et sont indispensable dans les démarches d'homologation de ces composés naturels par les différents organismes règlementaires pour différentes applications que ce soit pour le secteur alimentaire, médicale et/ou vétérinaire. / In recent decades, natural antimicrobials produced by bacteria, such as bacteriocins and reuterin, have received considerable attention as food preservatives or as alternatives to antibiotics for the human and animal sectors. Approval of bacteriocins and reuterin as bio-preservatives or sanitizers by regulatory agencies is based not only on evidence of efficacy but also on sufficient data on cytotoxicity and behavior in the gastrointestinal conditions. Although the antimicrobial activities of bacteriocins and reuterin have been widely studied, very little data is available on their behavior in biological matrices and their toxicity for different applications. Therefore, the general objective of this thesis was to evaluate the gastrointestinal stability, the biological activity, and the toxicity of bacteriocins and reuterin using different in vitro models for their intended use in food, medical, and veterinary applications. The first specific objective was to produce, purify and evaluate the antimicrobial activity of bacteriocins and reuterin alone and in combination against a wide range of pathogenic and spoilage organisms of interest to different sectors. Five different synergistic consortia were identified, of which three of them (microcin J25 + citric acid + lactic acid, microcin J25 + reuterin + citric acid, and microcine J25 + reuterin + lactic acid) showed significant activity against Salmonella enterica subsp. enterica serovar Newport ATCC 6962 (FIC index = 0.5). Two other combinations (pediocin PA-1 + citric acid + lactic acid, and reuterin + citric acid + lactic acid) showed partially synergistic effect against Listeria ivanovii HPB28 (FIC index = 0.75). The second specific objective was to evaluate the gastrointestinal stability of reuterin using an in vitro simulated digestion conditions in humans. Furthermore, the hemolytic activity, and in vitro cytotoxicity of reuterin using neutral red assay and lactate dehydrogenase (LDH) release assays were determined on assay on the Caco-2 cell line. Reuterin was observed to be very stable biologically during gastrointestinal transit. Moreover, exposure of Caco-2 cells to different concentrations of reuterin showed no negative effect on cell viability or membrane integrity at concentrations up to 1080 mM. In addition, no hemolysis was observed on erythrocytes exposed to concentrations up to 270 mM of reuterin. As a result, this study demonstrated that reuterin can be safely used at concentrations up to 270 mM, in various applications. The third objective was to assess the gastrointestinal stability and activity of microcin J25, pediocin PA-1, bactofencin A and nisin using in vitro models. In addition, the cytotoxicity and hemolytic activity of these bacteriocins were studied on Caco-2 cells and rat erythrocytes, respectively. According to the results, pediocin PA-1, bactofencin A and nisin were degraded at different levels during gastrointestinal transit, while microcin J25 was only partially degraded. Moreover, bacteriocins did not show cytotoxic effects on Caco-2 cells at concentrations up to 400 µg/mL. Finally, pediocin PA-1, bactofencin A, and nisin at concentrations higher than 50 µg/mL showed hemolytic potential, while microcin J25 did not cause hemolysis. In the fourth objective, the dermal toxicity of reuterin, microcin J25, pediocin PA-1, bactofencin A and nisin Z was studied in vitro using neutral red and LDH release assays on NHEK cells. The skin sensitization and irritation potentials of these bacteriocins and reuterin were also determined using the h-CLAT test and the human epidermal model EpiDerm ™, respectively. The results demonstrated that exposure of NHEK cells to these bacteriocins and reuterin at concentrations up to 400 µg/mL and 80 mg/mL, respectively, did not induce any cytotoxic effect. Inaddition, microcin J25 and reuterin showed no skin sensitization at concentrations up to 100 µg/mL and 40 mg/mL, respectively, while pediocin PA-1, bactofencin A and nisin Z caused sensitization at concentrations higher than 100 µg/mL. Tissue viability was not affected in the presence of bacteriocins and reuterin at concentrations up to 200 µg/mL and 40 mg/mL, respectively. Taken together, these results showed that certain bacteriocins and reuterin could be safely incorporated as an antimicrobial ingredient in various topical preparations intended for human and animal applications. Finally, the last chapter of the thesis was devoted to the development and characterization of different antimicrobial hydrogels based on bacteriocins or reuterin. Reuterin, pediocin PA-1, microcin J25 were incorporated into hydrogel formulations developed from biopolymers; chitosan (1.5%, 2.5%) or carboxymethyl cellulose (CMC, 3, 5%). The developed hydrogels were characterized in terms of general appearance, viscosity, antimicrobial activity, and stability during storage at room temperature. The results showed that the 1.5% and 2.5% chitosan containing microcin J25 or pediocin PA-1 have significant inhibitory activity throughout the storage period. The inhibitory effect of microcin J25 and reuterin in the 3% and 5% CMC hydrogels remained unchanged while the pediocin PA-1 added to the 3% and 5% CMC hydrogels totally lost its activity after one week. In terms of viscosity, the addition of antimicrobials to the hydrogels did not affect their viscosity and all formulations remained stable during the four weeks of storage. The results suggested that the formulas developed have great potential for application as sanitizer in the food, medical and veterinary sectors. In conclusion, this thesis has generated unique results on the gastrointestinal behavior, biological activity, stability, and toxicity of several bacterial drived antimicrobials including different bacteriocins and reuterin. Different in vitro models were adopted for this study. The results obtained are very relevant and are essential for the approval process of these natural compounds by the various regulatory agencies for different applications in food, medical or veterinary sector.

Dans cette étude, les effets toxiques de la nicotine, seule et en combinaison avec le lipopolysaccharide de bactéries parodontopathogènes, sur les cellules épithéliales et les fibroblastes d'origine buccale ont été déterminés. La capacité de polyphenols à neutraliser les effets cytotoxiques et inflammatoires de la nicotine a également été évaluée. Les cellules mucosales buccales ont été traitées avec la nicotine (± lipopolysaccharide), en présence et en absence de polyphenols. La viabilité cellulaire a été évaluée à l'aide d'un test colorimétrique mesurant la respiration cellulaire alors que la sécrétion de cytokines a été déterminée par un test immuno-enzymatique. Il a été démontré que la nicotine cause une perte de viabilité cellulaire de manière dose-dépendante. Une combinaison de nicotine et de lipopolysaccharide a entraîné des effets cytotoxiques additifs. Certaines anthocyanines pures ou présentes dans un extrait de cassis de même que l'épigallocatéchine-3-gallate ont permis de neutraliser les effets cytotoxiques et inflammatoires induits par la nicotine. Les résultats de cette étude supportent le potentiel thérapeutique des polyphenols pour la maladie parodontale.

Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida est une bactérie à Gram négatif causant la furonculose, une infection opportuniste des salmonidés d'élevage. Les méthodes actuelles de traitement contre la furonculose reposent fortement sur l'antibiothérapie. Cependant, une proportion importante des souches de cet agent pathogène opportuniste des poissons possède des gènes de résistance aux principaux antibiotiques utilisés pour guérir la furonculose. La présente thèse discute en détail de l'importance des interactions hôte-microbiote chez les salmonidés d'élevage et des mesures pouvant améliorer la résistance aux infections chez les salmonidés. Ces mesures peuvent être à large échelle (p. ex. la mise à place d'un système de recirculation de l'eau) ou à petite échelle (p. ex. l'administration de bactéries mutualistes aux poissons). Il y est également illustré comment des symbiontes endogènes de l'Omble de fontaine (ML11A et TM18) et une bactérie à acide lactique exogène (Bactocell) peuvent être mis à profit pour inhiber A. salmonicida subsp. salmonicida, augmenter la croissance et l'immunité innée d'Omble de fontaine et rétablir l'interaction fonctionnelle hôte-microbiote chez l'Omble de fontaine infecté à la furonculose. Lorsqu'ils sont administrés quotidiennement à des alevins vivants d'omble de fontaine, ML11A, TM18 et Bactocell ont contribué à améliorer plusieurs paramètres de leur état physiologique tels que le poids corporel moyen, le facteur de condition de Fulton et l'activité du lysozyme plasmatique (un indicateur de l'activité immunitaire innée). En contexte d'infection expérimentale de furonculose, les Ombles qui ont reçu des doses quotidiennes de TM18 et de Bactocell avaient deux fois moins de mortalité que le groupe témoin « infecté-non traité », mais seulement dans de l'eau à 13,6 °C. Dans l'eau à 15,6 °C, il n'y a pas eu de réduction significative de la mortalité. ML11A n'a pas réduit de manière significative la mortalité à l'une ou l'autre de ces deux températures. L'Omble de fontaine infecté traité avec Bactocell avait un transcriptome microbien intestinal extrêmement différent des poissons non infectés et infectés. Bactocell semble favoriser la restauration de l'expression génique nominale de l'hôte, mais en remodelant le transcriptome microbien intestinal dans un état d'eubiose différent de celui des ombles sains (non infectés). ML11A et TM18 semblent agir selon un mécanisme opposé à celui du Bactocell, c'est-à-dire en modulant l'expression des gènes de l'hôte impliqués dans la réponse à l'infection, sans altérer le transcriptome du microbiote (tous tissus confondus). Des perspectives intéressantes aux travaux de la présente thèse, par exemple combiner des souches probiotiques en un ou plusieurs traitements, vérifier la réactivité croisée de ces derniers avec d'autres traitements (conventionnels ou expérimentaux), considérer l'apport de différentes conditions environnementales sur le système Omble de fontaine - microbiote, sont également explorées. / Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida is a gram-negative bacterium that causes furunculosis, an opportunistic infection of farmed salmonids. Current treatment methods for furunculosis rely heavily on antibiotic therapy. However, a large proportion of strains of this opportunistic pathogen possesses genes for resistance to the main antibiotics used to cure furunculosis. This thesis discusses in detail the importance of host-microbiota interactions in farmed salmonids and discusses measures that can improve resistance to infections in salmonids. These measures can be large-scale (e.g. setting up a water recirculation system) or small-scale (e.g. administering mutualistic bacteria to fish). It is also illustrated how endogenous brook trout symbionts (ML11Aand TM18) and an exogenous lactic acid bacterium (Bactocell) can be used to inhibit A. salmonicida subsp. salmonicida, stimulate the growth and innate immunity of brook trout, and re-establishing the host-microbiota functional interaction in brook trout infected with furunculosis. When administered daily to live brook trout fry, ML11A, TM18 and Bactocell helped improve several parameters of their physiological state such as mean body weight, Fulton condition factor and plasma lysozyme activity (an indicator of innate immune activity). In the context of an experimental furunculosis infection, brook charr that received daily doses of TM18 and Bactocell had twice less mortality than the "infected-untreated" control group, but only in 13.6 °C water. In water at 15.6 °C, there was no significant reduction in mortality. ML11A did not significantly reduce mortality at either of these two temperatures. Infected brook trout treated with Bactocell had an extremely different gut microbial transcriptome from uninfected and infected fish. Bactocell appears to promote the restoration of nominal host gene expression, but by remodeling the gut microbial transcriptome into a different eubiotic state from that of healthy (uninfected) charr. The brook trout probionts ML11A and TM18 appear to act according to a mechanism opposite to that of Bactocell, i.e. by modulating the expression of the host genes involved in the response to infection, without altering the microbiota transcriptome (for all tissues combined). Interesting perspectives for the work of this thesis are also explored like combining probiotic strains in one or more treatments, assessing the cross-reactivity of these with other treatments (conventional or experimental), or considering the contribution of different environmental conditions to the brook charr-microbiota system.