L'amélioration de la digestion de lactose est une allégation "santé" liée aux ferments viviants du yaourt : Streptococcus thermophilus (S. thermophilus) et Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (L. bulgaricus) validée par l'EFSA en 2010. La physiologie de S. thermophilus et de L. bulgaricus est connue dans le lait et particulièrement le yaourt, alors qu'elle n'a été que peu étudiée dans le tractus digestif (TD). Mon travail de thèse est basé sur l'hypothèse de travail suivante : l'utilisation de modèles animaux gnotobiotiques permet de mieux connaître la physiologie des bactéries lactiques et de proposer des mécanismes d'action de leurs effets "santé". La stratégie a donc été d'obtenir des animaux mono-associés avec chacune des deux bactéries du yaourt ou les deux en même temps. Les principaux résultats obtenus sont : 1/ S. thermophilus colonise le TD en s'adaptant progressivement à l'environnement colique et y induit une glycolyse massive et une production de lactate. La glycolyse est la signature majeure de S. thermophilus dans le TD et le lactate pourrait être est la molécule "signal" qui induit une réponse chez l'hôte par une augmentation des transporteurs de mono-carboxylates (SLC16A1 et SLC5A8) et d'une protéine impliquée dans l'arrêt du cycle cellulaire p27kip1. 2/ L'apport de lactose stimule la colonisation du TD, la glycolyse ainsi que la production de L-lactate par S. thermophilus in vivo. 3/ Contrairement à ce qui est observé pour S. thermophilus, L. bulgaricus ne s'implante pas en absence de lactose. Quand les deux bactéries sont en co-culture, S. thermophilus est toujours avantagé numériquement par rapport à L. bulgaricus aussi bien in vitro qu' in vivo. Au niveau nutritionnel, tous nos résultats sont cohérents avec les allégations "santé" du yaourt avec un effet prébiotique du lactose. L'étude d'animaux gnotobiotiques a permis de proposer des nouvelles voies de régulation du métabolisme des sucres de bactéries lactiques et de nouvelles voies moléculaires (via le lactate) par lesquelles des bactéries lactiques et de nouvelles voies moléculaires (via le lactate) par lesquelles des bactéries lactiques pourraient influencer la physiologie de l'hôte.

L'amélioration de la digestion de lactose est une allégation "santé" liée aux ferments viviants du yaourt : Streptococcus thermophilus (S. thermophilus) et Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (L. bulgaricus) validée par l'EFSA en 2010. La physiologie de S. thermophilus et de L. bulgaricus est connue dans le lait et particulièrement le yaourt, alors qu'elle n'a été que peu étudiée dans le tractus digestif (TD). Mon travail de thèse est basé sur l'hypothèse de travail suivante : l'utilisation de modèles animaux gnotobiotiques permet de mieux connaître la physiologie des bactéries lactiques et de proposer des mécanismes d'action de leurs effets "santé". La stratégie a donc été d'obtenir des animaux mono-associés avec chacune des deux bactéries du yaourt ou les deux en même temps. Les principaux résultats obtenus sont : 1/ S. thermophilus colonise le TD en s'adaptant progressivement à l'environnement colique et y induit une glycolyse massive et une production de lactate. La glycolyse est la signature majeure de S. thermophilus dans le TD et le lactate pourrait être est la molécule "signal" qui induit une réponse chez l'hôte par une augmentation des transporteurs de mono-carboxylates (SLC16A1 et SLC5A8) et d'une protéine impliquée dans l'arrêt du cycle cellulaire p27kip1. 2/ L'apport de lactose stimule la colonisation du TD, la glycolyse ainsi que la production de L-lactate par S. thermophilus in vivo. 3/ Contrairement à ce qui est observé pour S. thermophilus, L. bulgaricus ne s'implante pas en absence de lactose. Quand les deux bactéries sont en co-culture, S. thermophilus est toujours avantagé numériquement par rapport à L. bulgaricus aussi bien in vitro qu' in vivo. Au niveau nutritionnel, tous nos résultats sont cohérents avec les allégations "santé" du yaourt avec un effet prébiotique du lactose. L'étude d'animaux gnotobiotiques a permis de proposer des nouvelles voies de régulation du métabolisme des sucres de bactéries lactiques et de nouvelles voies moléculaires (via le lactate) par lesquelles des bactéries lactiques et de nouvelles voies moléculaires (via le lactate) par lesquelles des bactéries lactiques pourraient influencer la physiologie de l'hôte. / *

Il est maintenant bien établi que le microbiote du tractus digestif humain joue un rôle important dans la santé humaine. Pourtant, nous commençons à peine à comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels les bactéries agissent sur les cellules hôtes, des connaissances qui pourraient fournir des nouvelles orientations dans le traitement et la prévention de maladies. Cette dernière décennie a vu un développement rapide des études du microbiote intestinal, et à présent des quantités importantes de données métagénomiques ainsi que des centaines de séquences génomiques de bactéries commensales sont disponibles. Ensemble, ces données fournissent une plateforme pour des approches in silico pour l'identification de molécules bactériennes impliquées dans la communication moléculaire avec l'hôte. Le défi consiste à développer des stratégies efficaces d'exploration de données et de validation, permettant de passer de corrélations et prédictions à des interactions bactérie - hôte fonctionnelles, validées expérimentalement. Le travail présenté dans cette thèse vise à démontrer l'importance d'analyses in silico afin d'élargir nos connaissances sur les interactions bactéries - hôtes. Il montre également comment cette information peut être appliquée dans des études fonctionnelles visant à identifier des molécules effectrices bactériennes fonctionnelles. Les principaux résultats peuvent être divisés en trois parties. La première partie traite de l'élaboration et de la validation d'un système hôte - vecteur pour des études de (méta)génomique fonctionnelle. La deuxième partie décrit une étude fonctionnelle où un certain nombre d'effecteurs candidats ont été identifiés parmi les protéines sécrétées et de surface de bactéries à Gram positif par une approche d'exploration in silico. Il décrit également l'application du nouveau système hôte - vecteur pour l'évaluation du rôle de ces candidats dans l'immuno-modulation. Enfin, dans la troisième partie, nous présentons une étude in silico qui a permis l'identification de fonctions bactériennes sur- ou sous-représentées dans une sélection de bactéries à Gram positif du tractus digestif humain. / It is now well established that the human gastrointestinal tract microbiota plays an intricate role in human health. However, we are only beginning to understand the molecular mechanisms by which bacteria act on the host cells, knowledge that could provide new directions in treating and preventing disease. The last decade has seen a rapid development of the gut microbiota field, and presently abundant metagenome data and hundreds of genome sequences of individual commensal bacteria are available. Together, these data provide a platform for in silico mining approaches to identify bacterial molecules involved in communication with the host. The challenge is to develop efficient mining and validation strategies, in order to move from correlations and predictions to experimentally validated functional bacteria – host relationships. The work presented in this thesis aims to demonstrate the importance of in silico analyses to broaden our knowledge on bacteria - host interactions. It also shows how this information can be applied in functional studies aiming to identify functional bacterial effector molecules. The main results can be divided in three parts. The first part deals with the development and validation of a host - vector system for functional (meta)genomics studies. The second part describes a functional study where a number of candidate effectors were identified among secreted and surface-exposed proteins from Gram-positive bacteria using an in silico mining approach. It also describes the application of the newly developed host - vector system to evaluate the role of these candidates in immune modulation. Finally, in the third part we present an in silico study that identified new bacterial functions over- or under-represented in a selection of Gram-positive human gut bacteria.

Streptococcus thermophilus est la bactérie lactique la plus utilisée après Lactococcus lactis dans l’industrie laitière pour la fabrication de yaourts et de fromages. Il s’agit du seul streptocoque à avoir le statut de bactérie GRAS (Generally Recognized As Safe). Malgré de récentes études montrant sa capacité à survivre dans le tractus digestif humain et des effets santé intéressants, le statut probiotique de S. thermophilus reste l’objet d’interrogations. Ainsi, les objectifs de cette thèse ont été (i) d’approfondir les connaissances sur la capacité de survie de S. thermophilus en conditions digestives humaines simulées, grâce, en particulier, au système dynamique multi-compartimenté TIM (TNO gastro-intestinal model) et (ii) d’identifier des gènes de S. thermophilus spécifiquement activés dans des conditions complexes comme l’environnement digestif, à l’aide de la technologie R-IVET (Recombinase-based In Vivo Expression Technology) basée sur l’excision d’un gène rapporteur. Le système R-IVET est composé d’un vecteur plasmidique portant la recombinase cre démunie de son promoteur et d’une cassette chromosomique composée d’un gène marqueur entouré de sites loxP reconnus par Cre. Ainsi, dans un premier temps, nous avons implanté la technologie R-IVET chez S. thermophilus LMD-9. Sa fonctionnalité a été testée et validée in vitro et dans le tractus digestif de la souris. Puis, l’étude de la survie de quatre souches de S. thermophilus dans le système TIM a montré que trois d’entre elles étaient plus résistantes que la quatrième, très sensible aux stress gastro-intestinaux. Ces résultats confirment donc que la survie de S. thermophilus dans l’environnement digestif est souche-dépendante. Ils montrent également que la survie de S. thermophilus est influencée par la matrice alimentaire, celle-ci étant plus importante en lait fermenté qu’en lait liquide. Enfin, dans un troisième temps, nous avons construit une première banque génomique R-IVET, en clonant en amont de cre des fragments d’ADN génomiques provenant de LMD-9. Cette banque a été testée uniquement en conditions gastriques simulées dans le TIM. Puis, après avoir optimisé notre outil chez S. thermophilus en améliorant la méthode d’identification des gènes activés, une seconde banque R-IVET a été testée dans l’ensemble du tractus gastro-intestinal (TIM) et en système batch en présence du microbiote intestinal. Ces expériences nous ont permis de mettre en évidence, pour la première fois, des gènes de S. thermophilus spécifiquement activés dans les différents compartiments digestifs de l’homme. Ce travail de thèse contribue ainsi à approfondir les connaissances sur le comportement de cette bactérie dans le tractus gastro-intestinal humain. A moyen terme, ces travaux devraient permettre d’identifier des marqueurs de survie de S. thermophilus et de mieux comprendre son activité métabolique dans l’environnement digestif, facilitant la sélection de souches dans la perspective de développement d’aliments fonctionnels. / Streptococcus thermophilus is the lactic acid bacterium most commonly used after Lactococcus lactis in the dairy industry for the production of yogurt and cheese. It is the only streptococcus strain to have the GRAS status (Generally Recognized As Safe). Despite recent studies showing its ability to survive through the human digestive tract and valuable health effects, the probiotic status of S. thermophilus remains questioned. Thus, the objectives of this pHD work were (i) to increase knowledge on the survival of S. thermophilus in human digestive environment, by using the dynamic multi-compartmental TIM system (TNO gastro-intestinal model) and (ii) to identify the genes from S. thermophilus that are specifically activated in complex digestive environment using the R-IVET technology (Recombinase-based In Vivo Expression Technology). R-IVET is based on the excision of a reporter gene and consists of a plasmid vector carrying the promoterless recombinase cre and a chromosomal cassette composed of a marker gene flanked by loxP recognized by Cre. First, we introduced the R-IVET technology in S. thermophilus LMD-9. Its functionality was tested and validated in vitro and in the mice digestive tract. Then, the survival of four S. thermophilus strains was investigated in the TIM system and we showed that 3 of these strains were more resistant than the other one, very sensitive to gastrointestinal stresses. These results strengthen the idea that the survival of S. thermophilus is strain-dependent. We also highlighted that the survival of S. thermophilus was influenced by the food matrix, being higher in fermented compared to liquid milk. Lastly, we constructed a first genomic R-IVET library, by cloning upstream of cre genomic DNA fragments from LMD-9. This library was tested only in gastric condition (TIM). After optimization of our tool in S. thermophilus (improvement of the method allowing identification of the activated genes), a second R-IVET library was tested throughout the gastrointestinal system (TIM) and in batch system including intestinal microbiota. By identifying bacterial genes specifically activated in human digestive conditions, this work contributes to extend our knowledge on the behavior of S. thermophilus in the human gastrointestinal tract. This could open up opportunities in determining survival markers for S. thermophilus and better describing its metabolic activity in the human gut, then facilitating the selection of strains that can be included in functional foods.

Les Attines ou fourmis champignonnistes sont d'importants ravageurs des cultures du monde néotropical. L'indispensable effet retard, à conférer aux insecticides chimiques ou biologiques pour une lutte efficace pourrait être obtenu par une encapsulation dans une enveloppe digestible par les sécrétions des fourmis. Quelques aspects de la physiologie digestive d'une Attine, Acromyrmex octospinosus (Reich), ont été étudiés dans ce but. 1- L'étude morphologique du tube buccal et l'observation de la prise de nourriture ont permis de localiser, de décrire et de comprendre le mécanisme du filtre infrabuccal. La poche infrabuccale, remplie pendant l'alimentation et lors des différents comportements de nettoyage, se vide en moyenne une fois par jour en raison de la gêne causée par sa distension. Cette fréquence ne permet pas à la microflore de digérer les déchets organiques, mais peut être suffisante pour certaines hydrolyses salivaires. 2- Après une étude anatomique du tractus digestif des adultes et des larves, les enzymes digestives des sécrétions stomacales et glandulaires sont mises en évidence par une microméthode semi-quantitative. Les glandes labiales des adultes possèdent une activité béta-N-acétylglucosaminidasique et alpha-1-4-glucosadique. En plus de cette dernière, l'estomac sécrète des exopeptidases et lipases. Les autres glandes reliées au tractus alimentaire ne produisent pas d'enzymes digestives. Aucune endopeptidase n'est révélée chez l'adulte, par contre l'estomac des larves possède une activité chymotrypsique. 3- Une béta-N-acétylglucosaminidase, une chitobiase et une chitinase sont présentes dans les glandes labiales. Les caractéristiques (pH optimum, température optimale, Km) de ces enzymes permettent de les différentier nettement de celles qui sont décrites à ce jour. Ceci peut être lié au fait que ces fonctions digestives restent exceptionnelles chez les insectes. Pour A. octospinosus, les activités béta-N-acétylglucosaminidasique et chitobiasique sont le fait de deux enzymes différentes. L'action chitinolytique n'est pas liée à une microflore endosymbiotique. 4- L'activité alpha-1-4-glucosadique des glandes labiales et de l'estomac est précisée. Les glandes ne possèdent que l'amylase et l'estomac sécrète maltase et tréhalase. Les caractéristiques de ces enzymes sont étudiées. Amylase et tréhalase paraissent être des enzymes inductibles. 5- Suite à ces travaux, un schéma catabolique, tenant compte de l'association avec un champignon symbiotique, est proposé pour A. octospinosus. Les données sur la filtration buccale et l'enzymologie de la partie antérieure du tube digestif permettent de définir la taille des microcapsules et la nature des polymères digestibles à utiliser pour induire un effet retard des insecticides.

La tuberculose est l’une des maladies infectieuses mortelles les plus fréquentes, causée par des mycobactéries tuberculeuses dont principalement M. tuberculosis. Notre thèse a porté sur Mycobacterium canettii caractérisée par un morphotype lisse et un temps de génération plus court que M. tuberculosis. Notre revue de la littérature a montré que moins d'une centaine de cas d’infection à M. canettii ont été rapportés majoritairement à Djibouti située dans la Corne de l’Afrique. Ensuite, notre étude prospective de la tuberculose pulmonaire à Djibouti a mesuré une prévalence d’infections à M. canettii de 4%. A travers un modèle murin d’infection par gavage, nous avons observé la translocation de M. canettii des intestins vers la circulation lymphatique et sanguine ; suivie par une dissémination principalement vers les poumons et les ganglions lymphatiques. Cette étude a alors démontré que M. canettii peut infecter les individus par voie orale et a révélé que M. canettii peut interagir avec le tissu adipeux brun. Ensuite, à travers des modèles cellulaires d’infection, nous avons montré que les pré-adipocytes bruns pourraient constituer une cible potentielle des mycobactéries tuberculeuses et que M. canettii ne persiste pas dans les adipocytes matures contrairement à M. tuberculosis. En conclusion, nous avons apporté des connaissances nouvelles sur l’infection à M. canettii : sa prévalence, son mode de transmission ainsi que de nouvelles pistes sur de possibles réservoirs environnementaux. L’ensemble de ces données suggèrent que l’infection à M. canettii doit être considérée comme une entité clinique distincte de la tuberculose que nous proposons de nommer « Canettose ». / Tuberculosis is one of the most frequent deadly infectious diseases worldwide, caused by tuberculous mycobacteria including mainly M. tuberculosis. Our thesis focused on Mycobacterium canettii characterized by a smooth morphotype and a shorter generation time than M. tuberculosis. Our review of the literature showed that less than one hundred cases of M. canettii infection have been reported in Djibouti situated in the Horn of Africa. Then, our prospective microbiological study of pulmonary tuberculosis in Djibouti measured a prevalence of M. canettii lung infections of 4%. Through a mouse model by gavage, we observed the translocation of M. canettii from the intestines to the lymphatic and blood circulation; followed by dissemination mainly to the lungs and lymph nodes. In conclusion, this study demonstrated that M. canettii can follow the digestive tract to infect individuals and revealed also that M. canettii can interact with brown adipose tissue. Then, through cell infection models, we have shown that brown pre-adipocytes may be a potential target for tuberculous mycobacteria and that M. does not persist in mature adipocytes contrary to M. tuberculosis. In conclusion, this work allowed to bring new knowledge about M. canettii infection: its prevalence, its mode of transmission as well as new avenues on possible environmental reservoirs. All of these data suggest that M. canettii infection should be considered as a distinct clinical entity from tuberculosis. We propose to name "Canettosis" the M. canettii infection.