Thèse de doctorat : Biochimie. Biologie cellulaire et moléculaire : Paris 12 : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Pagination : 88 f. Bibliogr. f. 76-87.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2003. / Thèse présentée en cotutelle: Programme de biologie cellulaire et moléculaire, Faculté de médecine, Université Laval et L'École doctorale du Muséum National d'Histoire Naturelle, Paris, France. Bibliogr.: f. 147-177. Publié aussi en version électronique.

Mémoire du D.E.S. : Biologie médicale : Nantes : 2008. Reproduction de : Thèse d'exercice : Pharmacie : Nantes : 2008. / Bibliogr.

Thèse doctorat : Chimie Organique : Strasbourg 1 : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 25 p.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. [232-250]. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

En réponse à des signaux environnementaux, la cellule module son programme transcriptionnel afin de mener à une expression spatio-­temporelle adéquate des gènes. L’orchestration d’une telle adaptation repose entre autres sur la séquence primaire du génome, son organisation au sein de la chromatine, ainsi que sa structure tridimensionnelle au sein du noyau. De plus, de nombreux régulateurs permettent d’intégrer ces différents niveaux de régulation afin de contrôler l’activité de l’ARN polymérase II. Dans ce contexte, le complexe cohésine et son facteur de charge sur l’ADN, NIPBL, jouent un rôle clé dans l’interconnexion fonctionnelle entre l’organisation 3D du génome et la transcription. En effet, ces facteurs modulent l’activation de la transcription en rapprochant des régions enhancers de promoteurs et participent à la formation de domaines d’interactions chromosomiques. Par ailleurs, des mutations de NIPBL et du complexe cohésine sont associées au Syndrome de Cornelia de Lange (CdLS), une pathologie caractérisée par une altération de l’expression des gènes. Toutefois, les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de la transcription par NIPBL et cohésine sont encore méconnus. L’objectif général de mon projet de doctorat est de définir le rôle de NIPBL et du complexe cohésine dans la régulation du lien entre la topologie du génome et le contrôle de l’expression des gènes. Dans un premier temps, nous montrons que les gènes dérégulés dans le CdLS sont préférentiellement organisés au sein de communautés de gènes, des structures formées par des interactions d’éléments régulateurs non codants ainsi que de gènes dans l’espace chromosomique tridimensionnel. Au sein de cette organisation, les gènes affectés par des mutations de NIPBL ou de la sous-­unité SMC1A du complexe cohésine sont retrouvés positionnés à portée de régions occupées par cohésine et NIPBL et interagissent par l’intermédiaire de contacts promoteur-­promoteur. Dans un second temps, nous présentons des données suggérant un rôle de cohésine dans la régulation de l’initiation de la transcription et un rôle de NIPBL dans le contrôle de la relâche de la pause. Enfin, nous apportons des évidences d’une fonction de NIPBL et cohésine dans la régulation du niveau basal et de l’activation des gènes dont l’expression est stimulée par des hormones. Dans leur ensemble, ces travaux contribuent à l’amélioration des connaissances sur la contribution de l’architecture des chromosomes aux mécanismes généraux de la régulation de la transcription. / In response to environmental signals, the cell modulates its transcriptional program in order to carry out appropriate spatiotemporal gene expression. The orchestration of this adaptation relies on the primary sequence of the genome, its organization into chromatin, and its tridimensional structure inside the nucleus. Moreover, multiple regulators integrate these different regulation levels in order to control the activity of RNA polymerase II. In this context, the cohesin complex and its DNA loader, NIPBL, play a pivotal role in the functional interconnection between the 3D organization of the genome and transcription. Indeed, these factors modulate the activation of transcription by bringing enhancers and promoters into close proximity and participate in the formation of chromosome interaction domains. Moreover, mutations in NIPBL and the cohesin complex are associated with the Cornelia de Lange Syndrome (CdLS), a pathology characterized by gene expression changes. However, the exact molecular mechanisms involved in the regulation of transcription by NIPBL and cohesin are still not understood. The general aim of my doctoral research is to define the role of the cohesin complex and NIPBL in the regulation of the connection between genome topology and gene expression control. First, we show that genes deregulated in CdLS are preferentially organized into connected gene communities, structures emerging from the interactions of noncoding regulatory elements and genes in the three-­dimensional chromosomal space. Within this organization, genes affected by mutations in NIPBL and the SMC1A subunit of the cohesin complex are positioned within reach of NIPBL-­ and cohesin-­occupied regions through promoter-­ promoter interactions. In addition, we present data suggesting a role of the cohesin complex in the initiation of transcription and a role of NIPBL in the control of pause release. Finally, we show evidence of a function of NIPBL and cohesin in the regulation of the basal level and the activation of genes stimulated by hormones. Ultimately, this work aims to gain insight into the contribution of the architecture of chromosomes to the general mechanisms of transcriptional regulation.

Les éléments LINE-1 (L1) sont les seuls éléments transposables autonomes et actifs, constituant 20% de notre ADN. Ils prolifèrent via un intermédiaire ARN dans un processus appelé rétrotransposition. Les L1s encodent deux protéines, ORF1p et ORF2p, qui s’associent avec l’ARN du L1 pour former une particule ribonucléoprotéique (RNP), constituant l’intermédiaire fonctionnel de la rétrotransposition. Les L1s « sautent » activement dans les cellules germinales, les cellules souches embryonnaires et dans l’embryon précoce, conduisant occasionnellement à des maladies génétiques. Ils sont également exprimés et mobiles dans un certain nombre de cancers. Les sites d’intégration des L1s sont généralement considérés comme aléatoires, les déterminants moléculaires de leur insertion demeurant mal connus. Afin d’éclaircir ce processus, nous avons d’abord exploré les propriétés biochimiques des RNPs du L1, en mesurant leur activité transcriptase inverse in vitro sur une collection variée de substrats d’ADN. Nous avons observé que des substrats, qui diffèrent par leur séquence ou leur structure, ne sont pas tous utilisés efficacement par les RNPs du L1 pour amorcer la transcription inverse. Notre travail suggère que la spécificité et la flexibilité de l’initiation de la transcription inverse du L1 participe aux choix du site d’insertion. Dans un second temps, nous avons recherché des partenaires cellulaires de la RNP du L1 qui pourraient contribuer à la rétrotransposition et/ou la réguler, par des cribles double-hybride chez la levure. Nous avons découvert que la protéine ORF2p interagit avec un groupe de récepteurs nucléaires. Ces derniers possèdent un domaine de liaison à l’ADN qui reconnaît des séquences d’ADN spécifiques réparties dans le génome, et un domaine de liaison du ligand, qui permet d’activer la transcription des gènes cibles. Nos données suggèrent que ces facteurs participent à la rétrotransposition des L1s, possiblement en ciblant leurs RNPs dans certaines régions du génome. Dans leur ensemble, nos travaux ont contribué à améliorer notre compréhension de la relation entre éléments transposables et génome hôte, et de leur impact sur la plasticité du génome humain. / LINE-1 (L1) elements are mobile genetic elements, comprising up to 20% of the contemporary human genome, in which they are the only autonomously active element. They replicate through an RNA intermediate in a process named retrotransposition. Replication-competent L1 copies code for two proteins, ORF1p and ORF2p, that associate in cis with their own RNA to form a ribonucleoprotein complex (RNP), the functional intermediate of retrotransposition. L1s « jump » actively in germ cells, embryonic stem cells and in the early embryo, leading occasionally to genetic diseases. These elements are also expressed and mobile in a number of cancers. L1 insertion sites are generally considered as random. The molecular determinants of L1 insertion, as well as many steps of the retrotransposition cycle, remain uncertain. To get further insight in the molecular mechanisms of L1 retrotransposition, we first explored the biochemical properties of the L1 RNP, by measuring their reverse transcriptase activity in vitro on various DNA substrates. Using this approach, we observed that L1 RNPs do not equally extend DNA substrates, which differ in sequence or structure, to initiate cDNA synthesis. Our work suggests that the specificity and flexibility of L1 reverse transcription priming contribute to the choice of target sites. In a second approach, we performed yeast two-hybrid screens in order to discover cellular partners of the L1 RNP, which could contribute and/or regulate retrotransposition, We found that ORF2p interacts with a group of nuclear receptors. These proteins contain a DNA binding domain, which recognizes specific DNA sequences spread in the genome, and a ligand binding domain, driving transcriptional regulation of target genes. Our data suggest that these factors participate to L1 retrotransposition, potentially by tethering L1 RNPs to specific genomic regions. Altogether, this work has contributed to a better understanding of the relationship between mobile genetic elements and their host genome, and their impact on human genome plasticity.

L’élément L1 (Long Interspersed Nuclear Element 1 ou L1) est le seul rétrotransposon autonome et actif connu dans notre génome, représentant 17% de celui-ci. Capable de se répliquer grâce à un intermédiaire à ARN et un mécanisme de transcription inverse initiée au site d’intégration, il encode deux protéines ORF1p et ORF2p, qui s’associent à l’ARN L1 pour former une particule ribonucléoprotéique (RNP). L’élément L1 rétrotranspose préférentiellement en cis : un L1 défectif est complémenté en trans par un élément fonctionnel de façon inefficace. Ce travail s'intéresse à deux étapes clefs du cycle réplicatif du L1 : l'assemblage de la RNP L1 en cis ou en trans afin d’explorer le mécanisme de la cis-préférence et la spécificité de l’initiation de la reverse transcription initiée. Nous avons d’abord comparé deux méthodes d’analyse de l’activité RT. Puis, nous avons montré l’importance de la complémentarité entre queue poly(A) de l’ARN L1 et site d’intégration durant l’initiation de la RT, ainsi que l’impact de mésappariements terminaux éventuels. Enfin, nous avons étudié les bases biochimiques de la cis-préférence, à travers la coexpression et la purification de deux éléments distincts étiquetés, ce qui nous a permis de suivre l'assemblage et l'activité de leurs RNPs respectives. Nos données suggèrent que ORF1p et ORF2p peuvent lier en trans l’ARN L1 de façon efficace et que la cis-préférence pourrait nécessiter des quantités limitantes de L1. / The Long Interspersed Nuclear Element 1 (LINE-1 ou L1) is the only known active and autonomous retrotransposon in the human genome and constitutes around 17% of our genomic DNA. The L1 element is able to replicate through an RNA intermediate by a mechanism called target-primed reverse transcription and encodes two proteins ORF1p and ORF2p, which associate with the L1 RNA to form a ribonucleoprotein particle (RNP). L1 preferentially retrotranspose in cis: a defective L1 can only be rescued in trans at low levels by a replication-competent copy. During this work, we focused on two essential steps of the L1 replication cycle: the assembly of the L1 RNP in cis or in trans to explore the mechanism of the cis-preference and the specificity of L1 reverse transcription priming. First, we compared two different methods to detect L1 RT activity. Then, we showed the importance of base-pairing between the poly(A) tail of the L1 RNA and the integration site to prime reverse transcription and the impact of potential mismatches. Finally, we investigated the biochemical basis of the cis-preference through the coexpression and purification of two different tagged L1 elements, which allowed us to follow the assembly and activity of their RNP. Our data suggest that binding of ORF1p and ORF2p in trans is efficient and that the cis-preference might requires limiting L1 levels.

La transcriptase inverse (RT) est un hétéro-dimère p66/p51 avec des activités ADN polymérase et ribonucléase H qui jouent un rôle critique dans le cycle viral du VIH-1. La RT convertit l’ARN génomique viral simple brin en ADN proviral double brin dans le cytoplasme de la cellule infectée. L’efficacité de la RT est augmentée par la protéine de la nucléocapside (NC) grâce à son activité chaperonne vis-à-vis des acides nucléiques et/ou une coopération entre les deux protéines. Dans ce travail, nous avons étudié par la technique de smFRET (single molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer) les effets de la NC sur l’interaction entre la RT et un substrat d’ADN au niveau de deux sites de pause de la synthèse de l’ADN(+). Nous avons d’abord réalisé et validé le montage de smFRET. Lors de la validation du montage avec des fluorophores Cy3 encapsulés dans des vésicules lipidiques, nous avons mis en évidence deux mécanismes différents entrainant le photoblanchiment du Cy3. Ensuite, après avoir déterminé les propriétés de liaison à l’équilibre de la RT et la NC sur différents substrats amorce/matrice à l’aide de mesures d’ensemble en solution, nous avons confirmé par smFRET que la RT adopte plusieurs conformations sur son substrat d’ADN, incluant celle qui conduit à la polymérisation de l’ADN. En présence de la NC, nous n’avons observé qu’une réorganisation modérée des différentes conformations du complexe RT/substrat. Par contre, une réorganisation beaucoup plus importante est induite par la NC en présence du dNTP, avec une très forte exaltation des conformations compétentes pour la polymérisation. Nous avons également montré que la NC augmente l’efficacité de synthèse de l’ADN au niveau de sites de pause en diminuant ou en augmentant le temps de dissociation du complexe RT/substrat/dNTP selon le type de site de pause. L’ensemble de ces données permet de mieux comprendre les mécanismes polyvalents par lesquels NC facilite l’activité de la RT. / The reverse transcriptase (RT) is a p66/p51 hetero-dimer with DNA polymerase and ribonuclease H activities which plays a critical role in the viral cycle of HIV-1. RT converts the viral genomic RNA to proviral DNA in the cytoplasm of infected cells. The efficiency of RT is increased by the nucleocapsid protein (NC) through its nucleic acids chaperone properties and/or via direct interaction with RT. In the present work, we investigated the effects of NC on the interaction between RT and its DNA substrate attwo pause sites during the synthesis of (+)DNA by using the smFRET (single molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer) technique. In a first step, we implemented and validated the smFRET set-up. Within the validation step, using Cy3 fluorophores encapsulated, in lipid vesicles, we monitored the photobleaching of Cy3 dyes and found out that it was governed by two parallel mechanisms. In a second step, we determined the affinity of RT and NC to different primer/template substrates by using steady-state fluorescence. Then, we confirmed by smFRET that RT adopts different conformations on its DNA substrate, including the one that leads to DNA polymerization. In the presence of NC, we observed only a moderate reorganization of the different conformations of RT/substrate complex. However, NC was found to induce a more important reorganization in the presence of dNTP, with a very strong promotion of the polymerization-competent conformations. We also showed that NC increases the efficiency of DNA synthesis at pause sites by either decreasing or increasing the dissociation time of the RT/substrate/dNTP complex, depending on the type of pause site. Together, these data allow us to further elucidate the mechanisms by which NC facilitates the RT.

Les virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1 et 2 (HIV-1 et HIV-2) et de l'Hépatite B (HBV) représentent un intérêt particulier en santé publique. En effet, on estime à plus de 33 millions le nombre de personnes infectées par le virus HIV dans le monde et 360 millions par HBV. La transcriptase inverse (RT) est une enzyme nécessaire à leur réplication et constitue donc une cible majeure des drogues antivirales. Parmi les NRTI commercialisés, les analogues de nucleotides de type phosphonates acyclique, comme l'Adefovir (HEPSERA®, Gilead) et le Tenofovir (VIREAD®, Gilead) sous forme prodrogue, ont révolutionné les traitements contre les virus HBV et HIV. Devant l'emmergence de virus résistants, il est urgent de développer de nouveaux antiviraux plus puissants et surtout actifs sur ces souches afin d'optimiser les multithérapies antivirales. Dans ce but, nous avons conçu des analogues thiophosphonates dérivés de l'Adefovir (PMEA) et du Tenofovir (PMPA), non toxiques pour la cellules et actifs contre HIV-1, HIV-2 et HBV en culture de cellules infectées. Ces composés, baptisés Adethiovir et Tenothiovir, ont été synthétisés selon une méthode originale et ont fait l'objet d'un dépôt de brevet. Nous avons synthétisé les formes diphosphates correspondantes : incorporés par la RT, terminateurs de chaîne, ils contournent la résistance associée au mutant K65R. Notre objectif est donc de les pousser plus loin dans le « pipe-line » du développement de médicaments antiviraux. / The Human Immunodeficiency Virus type 1 and type 2 (HIV-1 and HIV-2) and Hepatitis B (HBV) constitue a special interest in public health. Indeed, it is estimated that more than 33 million people infected with HIV worldwide and 360 million with HBV. Reverse transcriptase (RT) is an enzyme required for their replication and is therefore a key target for antiviral drugs. Among the NRTI marketed, nucleotide analogues like acyclic phosphonates, such as adefovir (Hepsera ®, Gilead) and Tenofovir (VIREAD ®, Gilead) as a prodrug form, have revolutionized the treatment against HBV and HIV. With the emmergence of resistant virus, there is a need to develop new antiviral compounds that are targetting especially these to optimize antiviral combination therapies. For this purpose, we designed analogues thiophosphonates derivatives Adefovir (PMEA) and tenofovir (PMPA), that are non-toxic in cells and active against HIV-1, HBV and HIV-2 infected cell cultures. These compounds, named Adethiovir Tenothiovir, were synthesized according to an original method and were the subject of a patent. We synthesized the corresponding diphosphates forms: incorporated by RT, chain terminators, they bypass the resistance associated with the K65R mutant. Our goal is to push them further in the "pipeline" development of antiviral drugs.