Titre de l'écran-titre (visionné le 12 avril 2024) / 8 vidéos en format .avi . Supplementary video file 1 and 2 represents mitochondrial time-lapse recording of Wt and Gan-/- DRG neurons. Supplementary video file 3 and 4 represents lysosomal time-lapse recording of Wt and Gan-/- DRG neurons. Supplementary video file 5 and 6 represents mitochondrial timelapse recording of vehicle (DMSO) and TubA (1μM) treated Gan-/- DRG neurons. Supplementary video file 7 and 8 represent lysosomes time-lapse recording of vehicle (DMSO) and TubA (1μM) treated Gan-/- DRG neurons. / La neuropathie axonale géante (GAN) est une maladie neurodégénérative autosomique récessive mortelle. Les phénotypes d'apparition de la GAN sont des déficits des voies sensorielles et motrices qui évoluent vers l'aréflexie, la perte de la sensibilité profonde et superficielle, l'altération de la démarche, la perte de déplacement autonome et la mort dans les 10 à 30 ans. La gigaxonine est un adaptateur spécifique de substrat des protéines de la famille Cul3-E3 ligase qui favorise la dégradation des protéines du cytosquelette par médiation protéasomale, notamment des protéines de la famille des filaments intermédiaires (IFs). La perte de fonction de la protéine gigaxonine entraîne l'agrégation des protéines des neurofilaments (NFs) dans le système nerveux central (SNC) et le système nerveux périphérique (SNP). La biopsie du nerf sural de patients atteints de GAN a révélé une accumulation massive de IFs provoquant un gonflement des axones, une caractéristique typique de la maladie de GAN. Des fibroblastes humains et des motoneurones iPSc cultivés in vitro ont présenté une accumulation importante de IFs en l'absence de gigaxonine. En outre, les souris knock-out à la gigaxonine présentaient des niveaux accrus de protéines NFs dans le cerveau, la moelle épinière et le nerf sciatique entre l'âge de 3 et 18 mois. Malgré l'accumulation de NFs, ces souris n'ont pas développé de phénotypes typiques de la maladie de la GAN. De plus, les axones géants étaient absents chez ces animaux. Il est bien établi que les NFs jouent un rôle important dans le SNC et le SNP en maintenant le cytosquelette neuronal, la régulation synaptique et le transport axonal. Cependant, nous ne savons toujours pas dans quelle mesure les accumulations de NFs contribuent à la maladie de la GAN. Des études antérieures ont révélé que la formation d'accumulations de NF est parfois associée à un transport axonal défectueux. Dans la maladie de Charcot-Marie-Tooth, il a été constaté que les mutations du gène *NEFL* encodant la sous-unité légère des neurofilaments (Nefl) provoquaient des accumulations de NFs et des défauts dans le transport axonal. En outre, la cultivation des neurones présentant des NFs désorganisés en raison de la surexpression du gène *PRPH* encodant la périphérine (Prph) dans des cellules portant un knock-out du gène Nefl ont présenté un transport axonal des organelles aberrant. Dans cette étude, nous avons généré une souris double transgénique de la maladie de GAN qui est basée sur le croisement de souris transgéniques surexprimant la périphérine (souris TgPer) dans un contexte de portant un knock-out du gène encodant gigaxonine (GanGan$^\textup{-/-}$). Les souris GanGan$^\textup{-/-}$;TgPer obtenues développent à un jeune âge des accumulations de IFs composées des protéines NFs et Prph provoquant le gonflement des motoneurones. En outre, les souris GanGan$^\textup{-/-}$;TgPer présentent des déficits cognitifs et moteurs à l'âge de 12 mois. La microscopie a révélé une perte substantielle du calibre des neurones et des axones chez ces souris. De manière intéressante, des axones géants (≥160µm²) remplis de IF désorganisés ont également été trouvés chez ces souris, une caractéristique typique de la maladie de le GAN. En outre, nous avons également examiné les effets de l'agrégation des NF sur le transport axonal. L'imagerie de cultures de neurones des ganglions spinaux (neurones DRG) GanGan$^\textup{-/-}$ a montré un transport axonal défectueux des mitochondries et des lysosomes. De plus, le traitement avec la Tubastatine A (TubA) a augmenté les niveaux de tubuline acétylée et a restauré le transport axonal normal des mitochondries et des lysosomes dans ces neurones DRG en culture. Nous avons également testé l'effet du médicament TubA chez les souris GanGan$^\textup{-/-}$ ;TgPer. À l'âge de 12 mois, le traitement au TubA des souris GanGan$^\textup{-/-}$;TgPer pendant quelques semaines a entraîné une légère amélioration de la fonction motrice, et en particulier une amélioration significative de la démarche. En conclusion, nous avons réussi à générer un modèle murin de la maladie de la GAN présentant une désorganisation des NF, des déficits cognitifs et un dysfonctionnement moteur. De plus, nous avons montré que la déficience en gigaxonine entraîne une désorganisation des NF ainsi qu'une altération du transport axonal antérograde des organelles. Les souris GanGan$^\textup{-/-}$;TgPer devraient être utiles pour étudier les changements pathogéniques associés à la maladie de la GAN et pour tester des médicaments potentiels. / Giant axonal neuropathy (GAN) is a fatal autosomal recessive neurodegenerative disease. Onset phenotypes of GAN are sensory and motor tract deficits which progress into areflexia, loss of deep and superficial sensitivity, gait impairment, loss of ambulance, and death occurs within 10-30 years of the phenotypic onset. Gigaxonin is a substrate-specific adaptor of the Cul3-E3 ligase family proteins that promotes proteasomal-mediated-degradation of cytoskeletal proteins including intermediate filament (IF) family proteins. Loss of function in gigaxonin protein causes the aggregation of neurofilament (NF) proteins in the central nervous system (CNS) and in the peripheral nervous system (PNS). Sural nerve biopsy of GAN patients revealed massive accumulation of IFs causing swelling of axons, a typical characteristic of GAN disease. *In vitro* cultured human fibroblasts and iPSc motor neurons exhibit severe accumulation of IFs in absence of gigaxonin. Further, gigaxonin knockout mice shows increased levels of NF proteins in brain, spinal cord, and sciatic nerve from the age 3 to 18 months. Despite NF accumulations these mice did not develop overt phenotypes of GAN disease. Moreover, giant axons were absent in these animals. It is well established that NFs play an important role in CNS and PNS in maintaining the neuronal cytoskeletal, synaptic regulation, and axonal transport. Yet, it remains unknown to what extent NF accumulations contribute to the GAN disease. Past studies revealed that the formation of NF accumulations is sometimes associated with defective axonal transport. In Charcot-Marie-Tooth disease mutations in the neurofilament, *NEFL* gene were found to cause accumulations of NFs and defects in axonal transport. In addition, cultured neurons with disorganized NFs due to overexpression of *PRPH* gene in the context of *NEFL* knockout exhibited aberrant axonal transport of organelles. In the present study, we have generated a double transgenic mouse model of GAN disease which is based on the crossing of transgenic mice overexpressing peripherin protein (TgPer) in context of gigaxonin knockout (GanGan$^\textup{-/-}$). The resulting GanGan$^\textup{-/-}$;TgPer mice at a young age develop IF accumulations made up of NF and Prph proteins causing the swelling of the spinal neurons. In addition, GanGan$^\textup{-/-}$;TgPer mice exhibited cognitive and sensory-motor deficits at 12 months of age. Microscopy has revealed substantial neuronal and axon caliber loss in these mice. Interestingly, giant axons (≥160µm²) were also found in these mice filled with disorganized IF, a typical characteristic of GAN disease. In addition, we have also examined the effects of NF aggregation on axonal transport. Live cell imaging has shown defective axonal transport of mitochondria and lysosomes in GanGan$^\textup{-/-}$ cultured DRG neurons. Further, the treatment with Tubastatin A (TubA) increased the levels of acetylated tubulin and restored normal axonal transport of mitochondria and lysosomes in these cultured DRG neurons. Furthermore, we also tested the effect of the TubA drug in GanGan$^\textup{-/-}$ ;TgPer mice. At 12 months of age, TubA treatment of GanGan$^\textup{-/-}$;TgPer mice for a few weeks led to a slight amelioration of motor function, and a significant improvement in gait. In conclusion, we have successfully generated a mouse model of GAN disease exhibiting NF disorganization, cognitive deficits, and sensory-motor dysfunction. Furthermore, we have shown that gigaxonin deficiency causes NF disorganization as well as impairment of anterograde axonal transport of organelles The GanGan$^\textup{-/-}$;TgPer mice should be useful to investigate the pathogenic changes associated with GAN disease and for testing potential drugs.

La cardiomyopathie dilatée est une pathologie affectant la structure du myocarde menant, à terme, à une défaillance cardiaque. Elle constitue la troisième cause la plus importante de défaillance cardiaque. De nombreuses pathologies cardiaques, dont la cardiomyopathie dilatée, résultent de mutations sur le canal sodique voltage-dépendant Nav1.5, responsable de la phase de dépolarisation des potentiels d’action et donc de la contraction. La mutation R219H, sur ce canal, engendre un courant de protons en phase d’hyperpolarisation nommé « courant oméga ». Celui-ci provoquerait une augmentation de la concentration intracellulaire en sodium et en calcium via l’échangeur sodium-calcium à l’origine du remodelage du myocarde dans la cardiomyopathie dilatée. Objectif : La mutation R219H fut détectée chez un patient souffrant de cardiomyopathie dilatée et d’arythmie. Les travaux présentés dans ce mémoire consistèrent à déterminer si le modèle de souris R219H présentait un phénotype cardiaque similaire. Méthode : Une évaluation structurelle des coeurs a été effectuée au moyen de coupes histologiques. La technique de patch clamp servit à caractériser la biophysique de Nav1.5 et à enregistrer le courant oméga. Résultats : Les coupes histologiques permirent de mettre en évidence des dysfonctions structurelles chez les souris hétérozygotes et homozygotes ainsi qu’une désorganisation importante de la structure cellulaire. Les enregistrements d’électrophysiologie montrèrent une activation du canal plus précoce chez les souris hétérozygotes et homozygotes. Une diminution de l’amplitude des potentiels d’action et de la vitesse de conduction fut aussi observée. La présence d’un courant oméga chez les souris portant la mutation fut également confirmée. Les résultats obtenus semblent indiquer que la mutation R219H soit à l’origine du développement de la pathologie, bien que le mécanisme moléculaire sous-jacent reste à déterminer. / Dilated cardiomyopathy is a structural cardiac disorder leading to heart failure. It is the third most common cause of heart failure. Several cardiac pathologies, including dilated cardiomyopathy, result from mutations on the gene encoding the voltage-dependent sodium channel Nav1.5 which is responsible for the upstroke of the action potential and therefore for contraction. The mutation R219H on this channel drives a gating pore current of protons in hyperpolarizing condition called “omega current”. This current ought to induce a rise of the intracellular concentration of sodium and calcium through the sodium-calcium exchanger that might cause the structural remodelling developing in dilated cardiomyopathy. Objective: The mutation R219H has been identified in a patient with a mixed dilated cardiomyopathy and arrhythmia phenotype. In the present study, investigation of heart phenotype and electrophysiology of transgenic R219H mice model was conducted. Method: Histological analysis was used to examine cell structure and tissues. The biophysical properties of the Nav1.5 channel were characterized by means of the patch clamp technique. Results: Histological analysis disclosed structural dysfunctions and loss of structural organization in myocardial cells in both heterozygous and homozygous mice. Finally, a shift of activation in heterozygous and homozygous mice were observed in electrophysiological recordings. A decline of action potential amplitude and conduction velocity was also observed in homozygous mice. The presence of the omega current was confirmed in mice carrying the mutation. Those results suggest that R219H could cause the pathology even if the precise molecular mechanism is not unravelled yet.

Titre de l'écran-titre (visionné le 11 septembre 2023) / Dans le testicule, il existe deux populations distinctes de cellules de Leydig, les cellules fœtales (FLC) et adultes (ALC). Elles produisent deux hormones, testostérone et INSL3 (Insulin-like 3) essentielles à la différenciation sexuelle masculine, fertilité et santé osseuse. Les mécanismes régulant la différenciation et la fonction des cellules de Leydig demeurent méconnus en raison de l'absence de modèle de souris exprimant la recombinase Cre afin de cibler exclusivement ces cellules. Puisque le gène Insl3 est exprimé uniquement dans les FLC et ALC, l'approche CRISPR/Cas9 a été utilisée pour insérer le transgène Cre recombinase améliorée (iCre) ou le transgène TdTomato dans le locus Insl3. Cependant la caractérisation de ces lignées de souris et l'expression exclusive du transgène dans les cellules de Leydig restaient à démontrer. Mon objectif était de caractériser certaines des nouvelles lignées de souris et en particulier, Insl3[exposant iCre]. Cette lignée a été croisée avec une souris rapporteuse Rosa26[exposant LoxSTOPLox-TdTomato] et la progéniture mâle issue de ces croisements a été sacrifiée à différents âges embryonnaires et postnataux. Les testicules ont été récoltés, congelés et coupés au cryostat. Des expériences d'immunofluorescence ont été réalisées. Chez la progéniture mâle, la protéine fluorescente rouge, TdTomato, a été observée dans les FLC et ALC (colocalisation avec CYP17A1, un marqueur spécifique des cellules de Leydig) aux âges fœtaux et postnataux examinés. La protéine TdTomato a été détectée dans les FLC dès E13.0, et dès P5 dans les ALC, corrélant avec le premier moment de la différenciation fonctionnelle des FLC et ALC, respectivement. Aucune fluorescence n'a été observée dans d'autres tissus examinés. Cette nouvelle lignée iCre exclusive aux cellules de Leydig représente une avancée majeure dans le domaine de l'andrologie et permettra d'aborder des questions fondamentales sur la biologie et la fonction des gènes dans les cellules de Leydig qui sont restées sans réponse pendant des décennies. / In the testis there are two populations of Leydig cells, fetal (FLC) and adult (ALC) Leydig cells. They produce two hormones, testosterone and INSL3 (Insulin-like 3) that are essential for male sex differentiation, fertility, and bone health. Our knowledge of mechanisms regulating differentiation and function of Leydig cells have remained incomplete because of the absence of a mouse model expressing Cre recombinase to exclusively target Leydig cells. Since INSL3 is uniquely expressed in both FLCs and ALCs, a CRISPR/Cas9 approach was used to knock-in the improved Cre recombinase (iCre) or TdTomato transgene into the Insl3 locus. However, the tissue and cell-specific transgene expression of the resulting mouse lines remained to be studied. My objective was therefore to characterize some of the new mice lines, particularly, Insl3[superscript iCre]. This mouse line was crossed with a Rosa26[superscript Lox-STOP-Lox-TdTomato] reporter mouse line and male off spring resulting from these crosses were euthanized at different embryonic and postnatal ages and the testes were harvested, frozen and cut in cryosections. Immunofluorescence experiments were subsequently performed. In male off spring, TdTomato red fluorescence was detected in both FLCs and ALCs at fetal and postnatal ages examined, as confirmed by immunofluorescence for CYP17A1, a marker of Leydig cells. The TdTomato protein was observed in FLCs as early as E13.0 while it was detected as early as P5 in ALCs, correlating with the earliest times of FLC and ALC differentiation, respectively. No fluorescence was observed in any other fetal or adult tissue examined. The Leydig cell-exclusive iCre line will be invaluable for generating Leydig cell-exclusive gene knockouts. These new genetic tools represent a major advance to the field of andrology that will allow us to address fundamental questions about the biology and gene function of Leydig cells that have remained unanswered for decades.

Les virus herpétiques sont des pathogènes ubiquitaires caractérisés, entre autres, par la persistance de leur génome au sein de l'hôte. Parmi ceux-ci, le virus Epstein-Barr (EBV) est associé à la mononucléose infectieuse, au carcinome du nasopharynx et au lymphome de Burkitt. L'homologie génomique qui existe entre certains virus herpétiques, principalement entre le gammaherpèsvirus murin 68 (MHV-68) et EBV, est établie depuis plusieurs années. Cette homologie est d'autant plus importante que ces virus sont reconnus par le système immunitaire de manière similaire chez leurs hôtes respectifs. Ce système se décline en deux volets complémentaires, soit l'immunité innée et l'immunité acquise. Les "Toll-like receptors" (TLRs) composent l'une des principales familles de récepteurs impliquées dans l'immunité innée. C'est donc sur cet aspect que le projet s'est concentré, et plus précisément sur l'activation du récepteur membranaire TLR2 par le virus MHV-68. Dans un premier temps, nous avons démontré que l'activation du TLR2 par MHV-68 mène à une augmentation de l'activité NF-KB. À l'aide de cellules fibroblastiques embryonnaires (MEFs) provenant de souris C57BL6 TLR2⁻/⁻ ou MyD88⁻/⁻, nous avons prouvé que la synthèse d'IL-6 et d'IFN-α induit par MHV-68 est partiellement dépendante du TLR2 et entièrement dépendante de MyD88. L'induction du gène TLR2 par MHV-68 a pu être établie in vivo à l'aide de souris transgéniques exprimant le gène de la luciférase sous le contrôle du promoteur du TLR2. L'utilisation de MHV-68 irradiée aux UV a donné des résultats similaires suggérant que la transcription génique et la replication virale ne sont pas essentielles à l'activation ni à l'induction du TLR2. Nous avons par la suite mis en évidence par cytometric de flux que le TLR2 était induit à la suite d'une infection par MHV-68 chez les granulocytes, les monocytes circulants et les monocytes inflammatoires recrutés au poumon. Nous avons finalement observé une diminution de la sécrétion d'IFN-α, d'IFN-β et d'IL-6 dans les poumons et la rate des souris TLR2⁻/⁻ et MyD88⁻/⁻ infectées, comparativement aux témoins (WT), et ce, de façon concomitante avec une augmentation de la charge virale. 11 s'agit de la première étude qui prouve que le virus MHV-68 est reconnu par le récepteur membranaire TLR2 murin.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative incurable, dont le principal facteur de risque génétique est l’isoforme epsilon-4 du gène de l’apolipoprotéine E (APOE4). La littérature rapporte une insulinorésistance cérébrale chez les patients atteints de la MA, associe APOE4 à des particularités dans la signalisation de cette hormone et montre que les patients APOE4 ne bénéficient pas d’un traitement intranasal à l’insuline, contrairement aux autres génotypes APOE. L’hypothèse que nous avons émise est qu’il y aurait des différences dans la réponse cérébrale à l’insuline entre les souris transgéniques APOE3 et APOE4. Nous avons vérifié l’effet d’une injection d’insuline sur leur comportement et sur la concentration de différentes protéines impliquées dans la signalisation de l’hormone et le développement de la MA. Nos résultats suggèrent une altération dans la réponse cérébrale à l’insuline chez les souris APOE4, qui pourrait entraîner l’hyperphosphorylation de la protéine tau, un marqueur neuropathologique de la MA. / Alzheimer’s disease (AD) is a incurable neurodegenerative disorder for which epsilon-4 isoform of apolipoprotein E gene (APOE4) is the main genetic risk factor. Previous studies have shown cerebral insulin resistance in AD patients and an association between APOE4 genotype and insulin brain signaling defects. Intranasal insulin treatment improves cognition in non-carriers of APOE4 but has no beneficial effects on APOE4 carriers. We hypothesized that brain insulin response would differ between APOE3 and APOE4 transgenic mice. We verified the effect of a single acute insulin injection on the behaviour and concentration of different proteins involved in insulin signaling and AD development in these mice. The results of our study suggest an altered cerebral insulin response in transgenic mice expressing the human APOE4 isoform, that could possibly lead to tau hyperphosphorylation, a neuropathological marker for AD.

La culture aisée de la pomme de terre et les vertus nutritionnelles de ses tubercules font de celle-ci une plante dominante en agriculture et une denrée alimentaire appréciée à l'échelle mondiale. Malheureusement, les changements climatiques menacent nos capacités de production de cette culture puisque les variétés modernes de pomme de terre sont vulnérables au stress hydrique en raison de leur système racinaire ténu et peu profond. En réponse à cette problématique, la littérature récente au sujet des cystatines suggère que la surexpression de ces inhibiteurs de protéases à cystéine pourrait contribuer à l'amélioration de la tolérance végétale au déficit hydrique, notamment par l'induction d'effets pléiotropiques bénéfiques dans la plante. Dans cette étude, nous avons examiné les impacts de l'expression constitutive de la cystatine recombinante de tomate SlCYS8 dans le tissu foliaire de lignées de pomme de terre transgéniques. La tolérance au stress hydrique des lignées modifiées a été analysée *in vitro* sur des plantules soumises à un choc osmotique, puis sur des plants acclimatés *ex vitro* cultivés en serre sous différents régimes d'irrigation. Les lignées SlCYS8 ont présenté un ratio 'biomasse racinaire/biomasse aérienne' accru en conditions de déficit hydrique ainsi qu'un meilleur rendement en tubercules cultivés en serre toutes conditions d'irrigation confondues. Ces observations suggérant un effet positif de la cystatine sur la tolérance au stress hydrique et le rendement agronomique des lignées modifiées ont été corroborées par une analyse du profil protéomique foliaire démontrant la mise en place d'effets pléiotropiques sur les sous-protéomes du stress, du métabolisme primaire et de photosynthèse. Ensemble, nos données morphologiques et protéomiques confirment le potentiel de la cystatine de tomate SlCYS8 comme outil éventuel pour l'amélioration du degré de tolérance de la pomme de terre au stress hydrique, et ce, en l'absence d'un compromis entre la croissance et l'activation des défenses de la plante.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.