Au vu de la relative inefficacité des traitements actuels de la douleur cancéreuse osseuse (DCO) il est devenu nécessaire aujourd'hui d'identifier de nouvelles cibles (cellulaires et/ou moléculaires) pour développer de nouveaux outils thérapeutiques. Dans ce contexte, ces dernières années, de nombreuses études ont suggéré que les cellules gliales, principalement les astrocytes et la microglie, pourraient contribuer au développement et au maintien de la douleur chronique. D'autre part, dans des modèles d'études précliniques de la DCO, plusieurs auteurs ont récemment constaté une réactivité astrocytaire importante dans les cornes dorsales de la moelle épinière et ont montré que, si on empêche cette réactivité, les symptômes douloureux sont diminués. Cependant, la relation exacte existant entre la réactivité des cellules gliales et les symptômes douloureux en condition de DCO est inconnue. Afin de décrypter cette relation, nous avons dans un premier temps étudié le décours temporel des comportements douloureux et caractérisé l’état de sensibilisation centrale dans un modèle de DCO chez le rat induit par l'injection de cellules de carcinome glandulaire mammaire (MRMT-1) dans le tibia. Nous montrons par des approches radiologiques, comportementales (tests de douleur évoquée et de distribution pondérale dynamique) et immunohistochimiques (immunodétection de la protéine Fos après palpation non douloureuse de la patte) que les animaux cancéreux MRMT développent graduellement une tumeur osseuse (premiers signes au 10ème jour post-inoculation), une allodynie et une hyperalgésie mécaniques (à partir du 10ème jour) et thermiques (à partir du 14ème jour), un inconfort de la patte injectée (à partir du 14ème jour ) et des phénomènes de sensibilisation centrale. Dans un deuxième temps, nous avons recherché des indices structuraux et fonctionnels de réactivité gliale spinale dans notre modèle de DCO. L'objectif était donc de dater l'apparition de la réactivité gliale, et de déterminer la nature des cellules gliales impliquées : microglie et/ou astrocytes. Nous montrons par des approches immunohistochimiques qu’aucun signe morphologique de réactivité astrocytaire ni microgliale n’est observable pendant l’établissement et le maintien de la DCO alors que ces signes existent dans un modèle de douleur neuropathique (ligature de nerfs spinaux). De plus, par des approches moléculaire (qRT-PCR) et biochimique (technique du Bio-Plex) nous montrons que, parmi les 20 marqueurs structuraux et fonctionnels de réactivité gliale testés, seule l’expression de l’aquaporine 4 (un canal à eau spécifique des astrocytes) est significativement augmentée en condition de DCO. Nos résultats suggèrent donc que les astrocytes et les cellules microgliales jouent des rôles différents dans la douleur cancéreuse et dans la douleur neuropathique. Enfin, dans un troisième temps, nous avons cherché à mettre en évidence une implication des astrocytes dans la pathologie DCO au travers d’une caractérisation des transmissions glutamatergique et glycinergique, qui sont toutes deux fortement modulées par l’environnement astrocytaire. Par la quantification de l’expression de l’ARNm (qRT-PCR) et par dosage des taux d’acides aminés (électrophorèse capillaire), nous montrons que les principaux acteurs (transporteurs, récepteurs, agonistes et co-agonistes) de la transmission glutamatergique et glycinergique spinale ne subissent pas d’altération significative en condition de DCO. En conclusion, nous montrons que des symptômes douloureux chroniques peuvent se développer et se maintenir (1) sans signe d’astrogliose et de réactivité microgliale spinale ; et (2) sans altération de l’expression des principaux acteurs de la transmission spinale glutamatergique et glycinergique. Nos résultats invitent donc à revoir le lien très fort qui est fait actuellement entre douleur chronique et astrogliose. / The relative lack of efficiency of current treatments used to relieve bone cancer pain prompts to the identification of new molecular and/or cellular targets for the development of new therapeutic strategies. In that context, a large number of recent studies have suggested the involvement of glial cells, among which astrocytes and microglial cells, in the onset and maintenance of chronic pain symptoms. In few animal models of bone cancer pain, several authors have recently evidenced an increased glial reactivity in spinal cord dorsal horn, and demonstrated that preventing astrocytic reactivity was sufficient to reduce pain symptoms in these models. However, the exact relationship of glial reactivity with bone cancer pain symptoms remains poorly understood. In order to decipher this link, we have first studied the temporal development of pain symptoms, and characterized the degree of central sensitization in a rat model of bone cancer pain induced by the injection of mammary gland carcinoma cells (MRMT-1) in the tibial bone. Using radiologic assessment of tumor development, behavioral measurements to quantify evoked (von Frey hairs) and spontaneous (dynamic weight bearing) pain and immunodetection of Fos after non nociceptive palpation of cancer bearing limb, we demonstrate that animals injected with MRMT-1 cells gradually develop a bone tumor (first detectable 10 days after inoculation), a mechanical allodynia and hyperalgesia (first noticeable at day 10), and later on a thermal allodynia and hyperalgesia (first detectable at day 14) as well as discomfort of the injected limb (day 14) and finally central sensitization phenomenons. Second, we have investigated the presence of structural and functional markers of spinal glial reactivity in our model of bone cancer pain. Our objectives were to date the onset of spinal glial reactivity, for microglial and astrocytic cells. Using immunohistochemical approaches, we show that none of the classical markers of astrocytic and microglial reactivity can be observed during the onset and the persistent phase of bone cancer pain whereas the markerswere easily identified in a neuropathic pain model (spinal nerve ligation). Furthermore, using molecular (qRT-PCR) as well as biochemical (Bio-Plex) approaches, we show that among the 20 structural and functional markers of glial reactivity tested, only aquaporin-4 displays increased mRNA levels in bone cancer pain model. Hence, our results suggest that astrocytes and microglial cells play different roles in bone cancer and neuropathic pain. Finally, we tried to evidence the involvement of astrocytes in bone cancer pain by characterizing glutamatergic and glycinergic synaptic transmission, both of which are heavily modulated by astrocytic environment. By quantifying mRNA levels (qRT-PCR) and measuring the level of inhibitory and excitatory amino acids (capillary electrophoresis), we show that the main actors (transporters, receptors, agonists and co-agonists) of glutamatergic and glycinergic transmissions in the spinal cord do not undergo any significant alteration in bone cancer pain conditions. We conclude that chronic painful symptoms may develop and persist (1) without any sign of astrogliosis or enhanced microglial reactivity in the spinal cord, and (2) without any alteration in the expression/levels of the main actors involved in glutamatergic and glycinergic transmission. These results therefore question the strong link that is frequently made between astrogliosis and chronic pain.

L'excitotoxicité est un mécanisme pathologique qui résulte généralement du relargage massif de glutamate par les neurones en souffrance et qui conduit à la destruction des réseaux neuronaux ainsi qu'à des pertes cellulaires qui peuvent sévèrement impacter les fonctions cognitives et motrices. Au niveau du système nerveux central la séquence d'évènements qui supportent ce processus a bien été décrite et sert aujourd'hui de base au développement d'approches thérapeutiques ciblés pour limiter les conséquences du phénomène. Au niveau de l'oreille interne, les processus excitotoxiques pourraient également être impliqués dans différents types d'atteintes des fonctions auditives et vestibulaires tels que les traumas acoustiques, les surdités brusques, la neurite vestibulaire ou encore les vertiges d'origines ischémiques. Bien que les mécanismes moléculaires qui supportent ce type d'atteinte aient été bien explorés au niveau cochléaire, ils restent peu documentés au niveau du vestibule. De récentes études réalisées par notre équipe ont mis en évidence la participation des récepteurs du glutamate à la neurotransmission vestibulaire en conditions normales et ont également démontré les conséquences histologiques et fonctionnelles d'une atteinte excitotoxique du vestibule. Elles ont par ailleurs mis en évidence le fort potentiel de réparation spontané des synapses vestibulaires après déafférentation. Dans le présent travail de thèse, nous avons voulu identifier les effecteurs cellulaires qui contrôlent les phénomènes de déafférentation et de réafférentation. Dans ce but, nous avons mis au point un modèle d'étude original, qui permet un suivi histologique et fonctionnel de la séquence des évènements biologiques mis en jeu dans ces processus. En combinant des approches en immunohistochimie, microscopie électronique, électrophysiologie moléculaire et pharmacologie nous démontrons que les récepteurs glutamatergiques de types AMPA et NMDA sont tous deux impliqués dans les processus de déafférentation. Les récepteurs NMDA sont également essentiels au processus de réparation synaptique. Les résultats de ce travail apportent une nouvelle lumière sur le rôle des récepteurs du glutamate dans le processus de lésion/réparation des synapses vestibulaires. Cette nouvelle donne pourrait impacter directement sur les stratégies pharmacologiques de protection en cours de développement dans le domaine de la pathologie vestibulaire, mais également par extension à celui de la pathologie auditive. En outre le modèle de culture organotypique de tranche d'organe vestibulaire pourrait trouver application pour le screening de nouveaux composés à propriétés protectrices ou régénératrices. / Excitotoxicity is a pathological mechanism that usually results from the massive release of glutamate by suffering neurons and that leads to destruction of neural networks as well as cell losses that may severely impact cognitive and motor functions. In the central nervous system the sequence of events that supports this process has been extensively studied and is now the basis for the development of targeted therapeutic approaches to limit the consequences of the phenomenon. In the inner ear, excitotoxic damages may also support in different types of auditory and vestibular disorders such as acoustic traumas, sudden hearing loss, vestibular neuritis or dizziness of ischemic origin. Though the molecular mechanisms that support this type of injury have been well explored at cochlear level, they remain poorly documented in the vestibule. Recent studies by our team have confirmed the involvement of glutamate receptors in the vestibular calyx neurotransmission in normal conditions and also showed histological and functional consequences of excitotoxic damage in the vestibule. They also revealed the potential for spontaneous repair of the vestibular synapses after deafferentation. In present thesis, we aimed at identifying the cellular effectors that control the phenomena of deafferentation and reafferentation. For this purpose, we developed an original study model, which allows tracking histological and functional assessment of biological events involved in these processes. By combining approaches in immunohistochemistry, electron microscopy, molecular electrophysiology and pharmacology we demonstrate that both AMPA and NMDA type glutamate receptors are mainly involved in the process of deafferentation. NMDA receptors are also essential for synaptic repair process. The results of this work provide a new light on the role of glutamate receptors in the process of injury / repair of vestibular synapses. The novel observations could directly impact on the ongoing pharmacological protection strategies in the field of the vestibular pathology, and by extension to that of the hearing pathology. In addition, the organotypic culture model of vestibular organ slices may find application for screening new compounds with protective or regenerative properties.

L'étude de la dynamique des circuits neuronaux est primordiale pour la compréhension des troubles neurologiques et psychiatriques. Ces processus, classiquement étudiés in vivo ou ex vivo, peuvent être appréhender in vitro grâce à des micro-technologies. Les technologies microfluidiques offrent la possibilité de reconstruire des réseaux de neurones orientés et de manipuler indépendamment les deux populations neuronales ainsi connectées. Dans cette étude, une caractérisation de la mise en place et de la rythmogénèse des réseaux cortico-striataux a été entreprise par imagerie calcique. Par la suite, nous avons démontré que des modifications chroniques des rythmes pré-synaptiques corticaux conduisaient à des phénomènes d¿excitotoxicité trans-synaptique. L'avancée des recherches a montré que les maladies neurodégénératives et psychiatriques pouvaient partager des points communs, notamment des altérations de la transmission synaptique et de l'activité des réseaux de neurones. Pour évaluer ces effets, une modulation de l'expression de Disrupted-In-Schizophrenia-1 a été réalisée dans nos réseaux cortico-striataux. Une altération de la différenciation des neurones striataux a été objectivée mais sans impact sur l'activité rythmique des réseaux neuronaux. Cependant, les expériences de surexpression ont montré la capacité de DISC-1 à participer à la formation des granules de stress, et à recruter dans celles-ci des protéines impliquées dans la transmission synaptique. Au final, ce projet démontre que les réseaux reconstruits in vitro possèdent des caractéristiques similaires aux réseaux in vivo et permettent l'étude de pathologies du système nerveux central. / Neural circuit dynamics need to be elucidated for understanding neurological and psychiatric disorders such as Parkinson's disease and schizophrenia. While this is classically studied in vivo or ex vivo, micro-technological approaches permit “brain-on-chip” models recapitulating some intrinsic neuronal network properties. In this study, parameters of cortico-striatal connection were monitored. Glutamatergic neuronal network activity was monitored using calcium imaging. Dopamine and Dopaminergic receptor 2 agonist decreased firing frequency and disrupted striato-striatal synchrony. Then, we demonstrated that both acute and chronic alterations of cortical neurons activity led to impairment of striatal survival through trans-synaptic degeneration. In psychiatric diseases, network rhythm alterations do not lead to neuronal death but to behavior disorders. To study how those alterations appeared, we investigated the impact of DISC-1 expression modulation on the establishment of cortico-striatal network and its activity. Alteration of DISC-1 expression led to deficits in striatal differentiation processes and seemingly did not drive network rhythms variation. Interestingly, DISC-1 overexpression experiments showed its aggregation in stress granules concomitant with an ability to recruit others proteins involved in synaptic transmission and neuronal plasticity. These results seem to show that DISC-1 could be involved in degenerative processes and not only in psychiatric diseases. The present data demonstrate that cortico-striatal networks reconstructed in a microfluidic environment present characteristics similar to in vivo cortico-striatal networks.