Evidências acumuladas em diversos estudos tem demonstrado que as Espécies Ativas do Oxigênio (EAO) contribuem para o dano celular decorrente da isquemia e reperfusão de órgãos, principalmernte, em função da propriedade oxidativa das mesmas sobre os constituintes lipídicos das membranas celulares. O alopurinol tem sido sugerido como droga capaz de interferir beneficamente diminuindo o dano celular decorrente da reperfusão de órgãos previamente isquêmicos, tendo em vista o seu potencial de inibir a enzima xantina-oxidase, a mais frequentemente referida como geradora de EAO. Este estudo foi desenvolvido como o objetivo de avaliar os efeitos da isquemia e reperfusão hepática em ratos e também os efeitos do prétratamento com o alopurinol, sobre a função deste órgão, lipoperoxidação das membranas celulares dos hepatócitos e, características histopatológicas decorrentes. Para tanto, ratos Wistar, pesando entre 250 e 300 gramas foram utilizados e divididos em 6 experimentos interdependentes. Experimento 1: realizado para avaliar os efeitos de diferentes procedimentos sobre a função hepática. Os animais foram divididos em 4 grupos de 1 O animais cada: Grupo 1- ratos controle; Grupo 2- ratos submetidos a isquemia troncular total e intermitente durante um tempo de 45 minutos, tendo sido permitida a reperfusão durànte 5 minutos após os dois primeiros intervalos de 15 minutos; Grupo 3- ratos submetidos a hepatectomia parcial (lobo médio e esquerdo); Grupo 4- ratos submetidos a isquemia conforme descrito e, no final do período, a hepatectomia parcial como no grupo anterior. Colheitas de sangue 12, 24, 48, 72, 96, 120 horas e no 14, 21 e 28 dias foram obtidas para determinação da atividade das transaminases oxalo-pirúvicas (AL T), oxaloacética (AST) e fosfatase alcalina (FA). Experimento 2: realizado para avaliar o grau de lipoperoxidação das membranas celulares dos hepatócitos, através dos métodos de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e da Quimiluminescência (QL), em diferentes tempos de reperfusão sanguínea. Para tanto, 40 ratos foram utilizados e divididos em 4 grupos de 1 O animais cada: Grupo 1: ratos controle (submetidos a laparotomia); Grupo 2- ratos submetidos a isquemia total durante 60 minutos não tendo sido permitida a reperfusão; Grupo 3- lsquemia total de 60 minutos e reperfusão por 30 minutos; Grupo 4- lsquemia total de 60 minutos e reperfusão por igual tempo. A ressecção do lobo médio, ao final de cada tempo operatório, foi realizada e, o tecido removido utilizado para medidas do grau de lipoperoxidação pelos métodos do TBARS e QL. Experimento 3: realizado para avaliar os efeitos do alopurinol sobre a função hepática em situações de isquemia e reperfusão. Para tanto 30 ratos foram utilizados, e divididos em 3 grupos de 1 O animais cada: Grupo 1- ratos controle, submetidos ao pré-tratamento com 50 mg/ Kg de peso da suspensão de alopurinol 5 e 1 hora antes da laparatomia, sem nenhum procedimento adicional; Grupo 2- lsquemia seletiva do lobo médio e esquerdo durante 45 minutos, porém em ratos pré-tratados com suspensão de alopurinol nas doses descritas anteriormente; Grupo 3- ratos submetidos a isquemia seletiva conforme descrito anteriormente. Medidas da ALT, AST e FA foram realizadas 12, 24, 48 e 72 horas após os procedimentos. Experimento 4: avaliar o efeito do alopurinol sobre o grau de lipoperoxidação das membranas celulares dos hepatócitos. Para tanto, 30 ratos foram utilizados e divididos em 3 grupos com 1 O animais cada: Grupo 1- ratos controle, submetidosum período de anestesia e laparotomia de 1 hora e 45 minutos; Grupo 2- ratos submetidos a isquemia de 45 minutos e reperfusão de 1 hora porém, pré-tratados com suspensão de alopurinol conforme descrição prévia. Grupo 3- ratos submetidos a isquemia de 45 minutos e reperfusão de 1 hora. Após os respectivos tempos operatórios,os animais foram submetidos a ressecção do lobo médio, utilizado para as medidas da lipoperoxidação pelos métodos do TBARS e QL. Experimento 5: avaliar os efeitos do alopurinol sobre a mortalidade pósoperatória em ratos submetidos a isquemia e reperfusão. Para tanto, 30 ratos foram utilizados e divididos em 3 grupos: Grupo 1- ratos controle, submetidos ao pré-tratamento com 50 mg/ Kg de peso da suspensão de alopurinol 5 e 1 hora antes da laparatomia, sem nenhum procedimento adicional; Grupo 2- ratos submetidos a isquemia seletiva do lobo médio e esquerdo durante 45 minutos, porém com pré-t r~tamento com suspensão de alopurinol nas doses descritas anteriormente. Grupo 3- lsquemia seletiva conforme descrito anteriormente. Experimento 6: avaliar as alterações histopatológicas da isquemia hepática em ratos pré-tratados e não com alopurinol. Para tanto, 60 ratos foram utilizados e divididos em 3 grupos de 20 animais: Grupo 1- ratos controle, submetidos ao pré-tratamento com 50 mg/ Kg de peso da suspensão de alopurinol 5 e 1 hora antes da laparatomia, sem nenhum procedimento adicional; Grupo 2- ratos submetidos a isquemia seletiva do lobo médio e esquerdo, durante 45 minutos, porém em ratos pré-tratados com suspensão de alopurinol nas doses descritas anteriormente. Grupo 3- lsquemia seletiva conforme descrito anteriormente. A cada 24 horas durante 4 dias, 5 animais de cada grupo eram sacrificados e, os lobos médio e esquerdo foram removidos para estudo histopatológico. Experimento 1- Significativa elevação nas concentrações séricas, nas medidas das 12 e 24 horas após o procedimento, das enzimas AL T e AST foram observadas nos Grupos 2 e 3 em relação ao grupo controle (Grupo 1) (p<O.OS). Além disso, naqueles animais do Grupo 4 elevações mais pronunciadas foram eveifenciadas em relação aos demais grupos nas determinações efetuadas 12, 24 e 48 após a cirurgia (p<O.OS). A soma dos valores das medidas individuais dos Grupo 2 e 3 não se distinguiram daquelas obtidas no Grupo 4 (p>O.OS). A concentração sérica da FA foi mais elevada em todas as determinações efetuadas naqueles animais submetidos a hepatectomia (G.3 e 4) em relação aos grupos de animais nos quais este procedimento não foi efetuado (Grupos 1 e 2) (p<O.OS). Experimento 2- Foi observado uma maior formação de malondialdeído (TBARS) nos tecidos hepáticos dos Grupos 3 e 4 em relação aos Grupos 1 e 2 (p<O.OS) e, além disso, ausência de diferença entre os Grupos 3 e 4 e entre os Grupos 1 e 2 (p>O.OS). Resultados semelhantes foram obtidos pelo método da QL. Experimento 3- A concentração sérica da AL Te AST foi superior (p<O.OS) nos Grupos 2 e 3 em relação ao grupo controle (Grupo 1) nas medidas efetuadas 12 e 24 horas após o procedimento e, nas determinações das 48 horas do Grupo 3 em relação aos demais (p<O.OS). A FA foi semelhante em todos os grupos de animais (p>O.OS). Experimento 4- A formação de malondialdeído foi maior nos animais do Grupo 3 em relação aos Grupo 1 e 2 (p<O.OS). Entre estes dois últimos grupos não houve diferença estatisticamente detectável (p>O.OS). Além disso, a QL demonstrou uma maior emissão de energia luminosa no Grupo 3 em relação aos demais (p<0.05) e, entre estes dois últimos os resultados foram semelhantes (p>0.05). Experimento 5- A taxa de mortalidade no grupo de animais submetidos a isquemia sem pré-tratamento como alopurinol (Grupo 3) foi de 40% nas primeiras 24h após o procedimento, estatisticamente distinta quando comparado ao Grupo 1 (cbntrole)(p<0.05). Entretanto, entre os animais do Grupo 2, ou seja, submetidos a isquemia e pré-tratamento com alopurinol, 13.3% foram ao óbito e este valor não se distingue dos animais do Grupo 1 (p>0.05). A avaliação entre os Grupos 2 e 3 não demonstrou diferença estatística (p>0.05). A mortalidade na avaliação das 48 horas foi igual entre os dois grupos (6.6% e 6.6%) (2 e 3) e não distintas, estatisticamente (p>0.05). Os demais animais sobreviveram durante o período de observação. Experimento 6- Congestão vascular hepática e necrose hepatocitária foram significativamente mais pronuncidas nos animais dos Grupos 2 e 3 em relação aos animais do grupo controle na avaliação efetuada 24 e 48 horas após a isquemia (p<0.05) e, além disso, a necrose foi maior nos animais do Grupo 3 em relação aos do Grupo 2 (p<0.05) apenas na avaliação das primeiras 24 horas após o procedimento cirúrgico. Não se observaram diferenças estatisticamente demonstráveis nas avaliações realizadas 72 e 96 horas após a cirurgia(p>0.05). Estes resultados sugerem que a via da xantina oxidase é uma das mais importantes rotas metabólicas envolvidas na geraçãode EAO, elementos quimicamente reativos e com potencial lesivo ao nível das membranas celulares dos hepatócitos e, que pelo menos em parte, são responsáveis pelos danos funcionais do fígado na síndrome da isquemia e reperfusão. Além disso, o alopurinol demonstrou efeitos protetores contra a lipoperoxidação decorrente da injúria reperfusional, embora a análise histopatológica não tenha demonstrado uma diferença estatisticamente significativa, o que pode ser justificado pelo fato das alterações provocadas nesta síndrome ocorram a nível de biomembranas celulares e de organelas não adequadamente visualizáveis pela microscopia óptica. / lt has been demonstrated that the oxygen free radical (EAO) contributes to the cellular damage induced by ischemia/reperfusion, probably mainly due to its lipid-oxidative characteristics. lt has been suggested that allopurinol has beneficiai effects in reducing the injury due to the reperfusion of previously ischemic organs, in this syndrome, as a result of its property of inhibiting the enzyme xanthine oxidase, most frequently referred as responsible for the EAO generation. This study was carried out with the purpose of elucidating the effects of hepatic ischemia-reperfusion in rats, the effects of allopurinol in this syndrome, the development of the assay for lipid peroxidation of hepatocyte membranes and the histopathologic features. To achieve this goal, the functional repercussion and the histopathologic features (analized 24 hours and eight days after surgery) were evaluated in wistar rats weighing 250-300 g. Experíment 1: performed for evaluating the way in which different procedures reflected upon the hepatic function. The animais were divided into 4 groups of 1 O rats each. Group 1- Contrais (sham operation); Group 2- rats submitted to total intermittent hepatic ischemia for 45 minutes: the first two 15-minute periods of ischemia were intercalated with 5 minutes of reperfusion; Group 3- rats which underwent partia! hepatectomy (mediai and left lobes). Group 4- lschemia as described above and at the end of partia! hepatectomy. Blood samples were obtained at 12, 24, 48, 72, 96 and 120 hours and 4, 21 and 28 days after the procedure to determine the leveis of the enzymes oxalopiruvic transaminase (AL T), oxaloacetic transaminase (AST) and alkaline phosphatase (AF). Experiment 2: performed for evaluating the lipoperoxidation of hepatocyte membranes by the methods of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and Chemoluminescence (QL) at different times of reperfusion. The animais were divided into 4 groups of 10 rats each: Group 1- Contrais (sham operation); Group 2- rats submitted to total hepatic ischemia for 60 minutes ; Group 3- total hepatic ischemia for 60 minutes and reperfusion for 30 minutes; Group 4- total hepatic ischemia for 60 minutes and reperfusion for 60 minutes. At the end of each operation time, a resection of the mediai lobe was performed, and hepatic tissue was removed and used for measuring lipid peroxidation by the methods described above. Experiment 3: performed for evaluating the effects of allopurinol on hepatic function in the setting of ischemia-reperfusion. The animais were divided into 3 groups of 1 O rats each: Group 1- Contrais (sham operation) treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 2- rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes and treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 3- rats submitted to 45 minutes of selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia followed by 5 minutes of reperfusion 22,5 minutes later. Blood samples were obtained 12, 24, 48 and 72 hours after the procedure to determine the activities of the AL T, AST and AF enzymes. Experiment 4: performed for evaluating the effects of allopurinol on hepatocyte membrane lipoperoxidation by the methods of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and Chemoluminescence (QL). The animais were divided into 3 groups of 1 O rats each: Group 1- Contrais (sham operation) treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 2- rats submitted to 45 minutes of selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia followed by 60 minutes of reperfusion and treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 3- rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes and reperfusion during 60 minutes. After the respective surgical times, the left and mediai lobes were removed and used for the lipoperoxidation assay by the TBARS and QL methods. Experiment 5: performed for evaluating the effects of allopurinol on mortality after the ischemia-reperfusion procedure. Forty animais were used and divided into 3 groups: Group 1- 10 control rats (sham operation) treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 2- 15 rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes and treated 5 hours and 1 hour before the procedure wíth two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 3: 15 rats submitted to 45 minutes of selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia followed by 5 minutes of reperfusion 22,5 minutes later. The animais were observed for 7 days after the procedure. Experiment 6: performed for analyzing the hepatic histopathologic features and the effects of the pre-treatment wíth allopurinol in the rats submitted to ischemia-reperfusion. Sixty animais were used and divided into three groups of twenty animais each: Group 1- Contrai rats (sham operation) treated 5 hours and 1 hour before the procedure wíth two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 2- rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes and treated 5 hours and 1 hour before the procedure wíth two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 3- rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes. Twenty-four, 48, 72 and 96 hours after the procedure, 5 rats of each group were sacrificed, and their left and right lobes were removed for histopathologic study (vascular congestion, necrosis and steatosis). Experiment 1: The determination of the AL T and AST leveis, after the procedure, demonstrated that these leveis were significantly higher in the groups 2 and 3 than in group 1 (p<0,05). Besides, among the animais of ali groups, those of group 4 had the highest leveis 12, 24 and 48 hours after the surgery. When the values of group 3 were added to the values of group 2, the results were not different from the values of group 4 (p>0,05). AF was higher in ali determinations, in the animais which underwent hepatectomy (groups 3 and 4) compared to those which were not submitted to this procedure (groups 1 and 2) (p< 0,05). Experiment 2: Malondialdehyde (TBARS) formation was higher in the groups 3 and 4 than in the groups 1 and 2 (p<0,05); besides, no difference was observed between the groups 3 and 4 and between the groups 1 and 2 (p>0,05). Similar results were observed with the QL method. These results suggest that the enzyme xanthine oxidase is one of the most important pathways involved in the generation of the EAbs, chemical reactive elements with injury potential at the levei of the hepatocyte membranes in the ischemia-reperfusion syndrome. At last, the results showed that allopurinol had beneficiai effects on hepatic function and lipid peroxidation and protective effects against hepatic ischemia-reperfusion injury. The histopathologic findings can be explained by the fact that the changes induced by this mechanism occur in organelles and biomembranes which are not visualized by light microscopy.

Introdução: embora a lesão por isquemia e reperfusão (I/R) renal possa ser reduzida por resfriamento, nenhuma análise sistemática in vivo da influência da temperatura foi empregada até o momento para avaliar o efeito de diferentes temperaturas nos danos provocados pela I/R renal. Objetivos: desenvolver um modelo experimental em ratos para avaliar os efeitos da variação local de temperatura (hipotermia renal tópica) nos danos, ou na prevenção destes, provocados por I/R. Além do desenvolvimento do modelo experimental, outro objetivo foi medir o efeito do estresse-oxidativo em diferentes grupos de temperatura no modelo experimental desenvolvido por nós. Métodos: estudo randomizado com ratos Wistar, machos adultos, pesando cerca de 400g, foram randomizados para quatro grupos experimentais com 7 animais em cada grupo. No grupo 1 a temperatura renal tópica foi ambiental; no grupo 2 foi induzida hipotermia local leve (26ºC) através do gotejamento de solução fisiológica resfriada até o alcance da temperatura-alvo; no grupo 3 a hipotermia tópica foi moderada (15ºC); e no grupo 4 a hipotermia profunda (4ºC) foi atingida através da utilização de solução fisiológica congelada (gelo). A temperatura sistêmica foi medida por termômetro retal. Já a temperatura cortical renal foi medida por termômetro com sonda intraparenquimatosa. Após anestesia geral através de injeção intraperitoneal de Ketamina (75mg/Kg) e Xilazina (10mg/Kg), os ratos foram submetidos a canulação retrorbital para obtenção de amostra de sangue antes da laparotomia. A seguir procedeu-se com nefrectomia direita (rim controle, removido logo após a laparotomia e não submetido a I/R ou hipotermia). O rim esquerdo teve interrupção do fluxo arterial ao longo de 40 minutos (isquemia). De acordo com o grupo, o rim era ou não resfriado. O resfriamento era mantido na temperatura alvo até o término dos 40 minutos. O rim era então reperfundido e o abdome era suturado. Os animais permaneciam em gaiola aquecida com água a disposição, mas não alimentos. Após 240 minutos de reperfusão os animais eram reoperados sob nova anestesia geral. O rim esquerdo e o sangue eram coletados, e os ratos eram sacrificados. O rim direito foi considerado o grupo controle, assim como o sangue coletado antes da laparotomia. A avaliação dos desfechos incluiu a medida de catalase (CAT), de superóxido dismutase (SOD), de ácido tiobarbicúrico (TBARS), de nitritos (NO2) e de nitratos (NO3) teciduais, além da medida de F2-isoprostanos (F2IP) plasmáticos. Também foi realizado exame histopatológico renal em hematoxilina-eosina (HE). Resultados: o exame histopatológico revelou que I/R (40’/240’) provocou lesão renal, independentemente da temperatura cortical renal, quando comparado com o grupo controle (P < 0,001). TBARS, um dos produtos da peroxidação lipídica, mostrou aumento em todos os grupos submetidos a I/R, independentemente da temperatura, em relação ao grupo controle. Catalase, enzima protetora contra o estresse oxidativo, mostrou aumento no grupo I/R normotérmico (G1, 37ºC) quando comparado ao grupo controle, indicando mobilização celular de mecanismos protetores intrínsecos. À medida que a temperatura era diminuída no grupo I/R, ocorreu diminuição da catalase em relação ao controle, mas sobretudo em relação ao I/R normotérmico, indicando que a hipotermia foi um mecanismo extrínseco de proteção, dispensando a mobilização da catalase. Foi detectada uma diferença estatisticamente significativa entre o grupo I/R normotérmico (G1, 37ºC) e o grupo submetido à hipotermia profunda (G4, 4ºC), com um P < 0.03. A avaliação dos demais marcadores de desfecho não mostrou diferenças estatisticamente significativas. Conclusões: isquemia renal de 40 minutos seguida de reperfusão por 240 minutos provocou lesão renal com alterações histopatológicas e também em um marcador de estresse oxidativo (TBARS). A avaliação da catalase (CAT) demonstrou que a hipotermia profunda (4ºC) foi provavelmente protetora, embora não tenha havido tradução histopatológica dessa proteção, nesse experimento agudo (240 minutos de reperfusão pós-isquêmica). / Introduction: Hypothermia has been associated with prevention against ischemiareperfusion (I/R) damage, but there is no experimental analysis, in vivo, regarding the role that hypothermia plays on renal injury induced by I/R. Objectives: The aims of this study were to design an animal model and evaluate the impact of predetermined ranges of temperatures on markers of oxidative stress and renal histologic sections. Methods: 28 Wistar male rats, under general anesthesia, undergone laparatomy to collect the right kidney (control group in each animal). The vascular pedicle of the left kidney was clamped during 40 minutes (ischemia). Four temperatures groups were designed, with 7 animals randomized for each group: normothermic (around 37oC), mild local hypothermia (26oC), moderate local hypothermia (15oC) and deep hypothermia (4oC). The systemic body temperature was kept during the operation through the warming of the surgical table. The left kidney cortical temperature was assessed with an intra parenchymal probe connected to a thermometer. For the systemic temperature measurement it was applied a common electronic rectal thermometer. After 40 minutes of ischemia, the left kidney had the vascular clamp removed, and the abdominal wall had been closed in two layers. The animals were kept alive in an incubator for 240 minutes, so they were re-laparotomized, under new anesthesia, and the left kidney was removed. Afterwards it was performed heart puncture in order to collect blood sample for plasmatic f2-isoprostanes. Half of each kidney (right and left, of all animals) had been kept on formalin and sent to pathological evaluation. The tissues stored on the freezer were used to analyze oxidative stress markers: catalase, SOD, TBARS, NO3, and NO2. Results: Core body temperature had not differed significantly between the groups. According to the pathological evaluation, all kidneys that suffered ischemia were significantly more injured than the controls (p < 0.001). No injury was found on the control group (right kidney of each rat). TBARS showed quite similar findings, showing increased levels in all I/R groups compared with the control group (P < 0.001). Concerning the protective enzyme catalase, it was observed an increase of this enzyme on the ischemic normothermic kidney when compared to the control. As the temperature was decreasing, more the catalase was decreasing, reaching a significant statistical difference (P < 0.03) between the ischemic normothermic group (G1, 37ºC) and the deepest hypothermic group (G4, 4ºC). No difference was found on nitrites and nitrates, superoxide dismutase, or on the plasmatic isoprostanes. Conclusion: This model was efficient in produce oxidative stress by I/R. Deep hypothermia has offered protection in this acute experiment (40 min of ischemia followed by 240 min of reperfusion).

Introdução: O uso de Hipotermia Tópica ou Pré-Condicionamento Isquêmico (PCI) em ressecções hepáticas pode ser útil com o propósito de atenuar os danos de isquemia e reperfusão. Entretanto, até o presente momento, o uso combinado destas técnicas não foi avaliado. Objetivos: Desenvolver um modelo experimental para avaliar os danos de isquemia e reperfusão iniciais e a ocorrência de efeitos sinergísticos quando as duas ferramentas são aplicadas concomitantemente. Métodos: Realizou-se isquemia do fígado por noventa minutos e reperfusão por cento e vinte minutos. Os animais foram divididos nos grupos Controle (C), Isquemia Normotérmica (IN), Pré-condicionamento Isquêmico (PCI), Hipotermia 26ºC (H) e Hipotermia 26ºC + PCI (H+PCI). Foram avaliados a Pressão Arterial Média (PAM), a temperatura corporal e o fluxo biliar a cada 15 minutos, enquanto a ALT, AST, TBARS, SOD, CAT e os danos histopatológicos foram avaliados ao término da reperfusão. Resultados: Não foram observadas alterações na PAM e na temperatura corporal durante todo o experimento. O fluxo biliar retornou a valores semelhantes ao grupo C nos grupos H e H+PCI após 45 minutos de reperfusão, e foi significativamente maior nos grupos H e H+PCI em comparação aos grupos IN e PCI após 105 minutos (P<0,05 e P<0,05) e 120 minutos (P<0,05 e P<0,05) de reperfusão. Os níveis plasmáticos da AST e ALT demonstraram aumento significativo nos grupos IN (P<0,05 e P<0,05) e PCI (P<0,05 e P<0,05) em comparação ao grupo C. Os níveis de TBARS foram significativamente maiores nos grupos IN (P<0.01), PCI e H (P<0,05 e P<0,05) em comparação ao grupo H+PCI e significativamente maiores no grupo IN em comparação ao grupo C (P<0,05). No grupo H houve correlação negativa entre AST e ALT com o fluxo biliar (P<0,05 e P<0,05) e positiva entre AST e ALT com os níveis de TBARS (P<0,05 e P<0,05). Os níveis de CAT demonstraram aumento significativo no grupo PCI em comparação aos grupos C (P<0,01), IN e H+PCI (P<0,05 e p<0,05), enquanto os níveis de SOD foram significativamente maiores no grupo H em comparação ao grupo C (P=0,01), IN, PCI e H+PCI (P<0,05, respectivamente). Os danos histopatológicos foram leves, porém o grupo IN apresentou escores significativamente maiores em comparação ao grupo C (P<0,05). Conclusões: A utilização de hipotermia hepática tópica a 26ºC associada ao PCI promoveu um efeito protetor sinergístico sobre a peroxidação lipídica hepática. Além disso, a indução de hipotermia tópica isoladamente ou em associação com o PCI atenuou os danos hepatocelulares e permitiu uma recuperação precoce da função hepática após a reperfusão, um mecanismo provavelmente relacionado a um efeito da hipotermia sobre o estresse oxidativo e preservação de ATP. / Introduction: The use of Topical Hypothermia or Ischemic Preconditioning (IPC) in hepatic resections can be useful to attenuate ischemia/reperfusion injuries. However, until the present moment, the combination of both techniques was not evaluated. Objectives: Development of an experimental model to assess the initial ischemia/reperfusion injuries and the possible synergistic effects when both tools are applied concomitantly. Methods: Ninety minutes of ischemia and 120 minutes of reperfusion were applied to rat livers. Animals were divided into five groups: Control (C), Normothermic Ischemia (NI), Ischemic Preconditioning (IPC), Hypothermia 26ºC (H) and Hypothermia 26ºC plus IPC (H+IPC). Mean arterial pressure (MAP), body temperature and bile flow were assessed every 15 minutes whereas ALT, AST, TBARS, SOD, CAT and histopathologic injuries were evaluated at the end of reperfusion. Results: No differences were seen in MAP and body temperature throughout the experiment. Bile flow returned to values similar to C group in the H and H+IPC groups after 45 minutes of reperfusion and was significantly higher in the H and H+IPC groups after 105 minutes (P<0.05 and P<0.05) and 120 minutes (P<0.05 and P<0.05) of reperfusion in comparison to the NI and IPC groups. Plasmatic levels of AST and ALT were significantly higher in the NI (P<0.05 and P<0.05) and IPC (P<0.05 and P<0.05) groups in comparison to the C group. TBARS levels were significantly higher in the NI (P<0.01), IPC, and H (P<0.05 and P<0.05) groups in comparison to the H+IPC group and higher in the NI group in comparison to the C group (P<0.05). In the H group there was a negative correlation between ALT and AST to bile flow (P<0.05) and positive correlation between AST and ALT to TBARS (P<0.05 and P<0.05). CAT levels were significantly higher in the PCI group in comparison to the C (P<0.01), NI and H+IPC (P<0.05 and P<0.05) groups whereas SOD levels were significantly higher in the H group in comparison to the C (P=0.01), NI, PCI and H+IPC (P<0.05, respectively) groups. Histopathologic injuries were mild and the NI group showed a significantly greater score in comparison to the C group (P<0.05). Conclusions: The induction of topical liver hypothermia at 26ºC associated to IPC promoted a synergistic protective effect on hepatic lipid peroxidation. In addition, the induction of isolated topical hypothermia or hypothermia associated to IPC attenuated liver injuries and allowed an early recovery of the liver function after reperfusion, a mechanism probably related to an effect of hypothermia on oxidant stress and ATP preservation.

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Evidências acumuladas em diversos estudos tem demonstrado que as Espécies Ativas do Oxigênio (EAO) contribuem para o dano celular decorrente da isquemia e reperfusão de órgãos, principalmernte, em função da propriedade oxidativa das mesmas sobre os constituintes lipídicos das membranas celulares. O alopurinol tem sido sugerido como droga capaz de interferir beneficamente diminuindo o dano celular decorrente da reperfusão de órgãos previamente isquêmicos, tendo em vista o seu potencial de inibir a enzima xantina-oxidase, a mais frequentemente referida como geradora de EAO. Este estudo foi desenvolvido como o objetivo de avaliar os efeitos da isquemia e reperfusão hepática em ratos e também os efeitos do prétratamento com o alopurinol, sobre a função deste órgão, lipoperoxidação das membranas celulares dos hepatócitos e, características histopatológicas decorrentes. Para tanto, ratos Wistar, pesando entre 250 e 300 gramas foram utilizados e divididos em 6 experimentos interdependentes. Experimento 1: realizado para avaliar os efeitos de diferentes procedimentos sobre a função hepática. Os animais foram divididos em 4 grupos de 1 O animais cada: Grupo 1- ratos controle; Grupo 2- ratos submetidos a isquemia troncular total e intermitente durante um tempo de 45 minutos, tendo sido permitida a reperfusão durànte 5 minutos após os dois primeiros intervalos de 15 minutos; Grupo 3- ratos submetidos a hepatectomia parcial (lobo médio e esquerdo); Grupo 4- ratos submetidos a isquemia conforme descrito e, no final do período, a hepatectomia parcial como no grupo anterior. Colheitas de sangue 12, 24, 48, 72, 96, 120 horas e no 14, 21 e 28 dias foram obtidas para determinação da atividade das transaminases oxalo-pirúvicas (AL T), oxaloacética (AST) e fosfatase alcalina (FA). Experimento 2: realizado para avaliar o grau de lipoperoxidação das membranas celulares dos hepatócitos, através dos métodos de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e da Quimiluminescência (QL), em diferentes tempos de reperfusão sanguínea. Para tanto, 40 ratos foram utilizados e divididos em 4 grupos de 1 O animais cada: Grupo 1: ratos controle (submetidos a laparotomia); Grupo 2- ratos submetidos a isquemia total durante 60 minutos não tendo sido permitida a reperfusão; Grupo 3- lsquemia total de 60 minutos e reperfusão por 30 minutos; Grupo 4- lsquemia total de 60 minutos e reperfusão por igual tempo. A ressecção do lobo médio, ao final de cada tempo operatório, foi realizada e, o tecido removido utilizado para medidas do grau de lipoperoxidação pelos métodos do TBARS e QL. Experimento 3: realizado para avaliar os efeitos do alopurinol sobre a função hepática em situações de isquemia e reperfusão. Para tanto 30 ratos foram utilizados, e divididos em 3 grupos de 1 O animais cada: Grupo 1- ratos controle, submetidos ao pré-tratamento com 50 mg/ Kg de peso da suspensão de alopurinol 5 e 1 hora antes da laparatomia, sem nenhum procedimento adicional; Grupo 2- lsquemia seletiva do lobo médio e esquerdo durante 45 minutos, porém em ratos pré-tratados com suspensão de alopurinol nas doses descritas anteriormente; Grupo 3- ratos submetidos a isquemia seletiva conforme descrito anteriormente. Medidas da ALT, AST e FA foram realizadas 12, 24, 48 e 72 horas após os procedimentos. Experimento 4: avaliar o efeito do alopurinol sobre o grau de lipoperoxidação das membranas celulares dos hepatócitos. Para tanto, 30 ratos foram utilizados e divididos em 3 grupos com 1 O animais cada: Grupo 1- ratos controle, submetidosum período de anestesia e laparotomia de 1 hora e 45 minutos; Grupo 2- ratos submetidos a isquemia de 45 minutos e reperfusão de 1 hora porém, pré-tratados com suspensão de alopurinol conforme descrição prévia. Grupo 3- ratos submetidos a isquemia de 45 minutos e reperfusão de 1 hora. Após os respectivos tempos operatórios,os animais foram submetidos a ressecção do lobo médio, utilizado para as medidas da lipoperoxidação pelos métodos do TBARS e QL. Experimento 5: avaliar os efeitos do alopurinol sobre a mortalidade pósoperatória em ratos submetidos a isquemia e reperfusão. Para tanto, 30 ratos foram utilizados e divididos em 3 grupos: Grupo 1- ratos controle, submetidos ao pré-tratamento com 50 mg/ Kg de peso da suspensão de alopurinol 5 e 1 hora antes da laparatomia, sem nenhum procedimento adicional; Grupo 2- ratos submetidos a isquemia seletiva do lobo médio e esquerdo durante 45 minutos, porém com pré-t r~tamento com suspensão de alopurinol nas doses descritas anteriormente. Grupo 3- lsquemia seletiva conforme descrito anteriormente. Experimento 6: avaliar as alterações histopatológicas da isquemia hepática em ratos pré-tratados e não com alopurinol. Para tanto, 60 ratos foram utilizados e divididos em 3 grupos de 20 animais: Grupo 1- ratos controle, submetidos ao pré-tratamento com 50 mg/ Kg de peso da suspensão de alopurinol 5 e 1 hora antes da laparatomia, sem nenhum procedimento adicional; Grupo 2- ratos submetidos a isquemia seletiva do lobo médio e esquerdo, durante 45 minutos, porém em ratos pré-tratados com suspensão de alopurinol nas doses descritas anteriormente. Grupo 3- lsquemia seletiva conforme descrito anteriormente. A cada 24 horas durante 4 dias, 5 animais de cada grupo eram sacrificados e, os lobos médio e esquerdo foram removidos para estudo histopatológico. Experimento 1- Significativa elevação nas concentrações séricas, nas medidas das 12 e 24 horas após o procedimento, das enzimas AL T e AST foram observadas nos Grupos 2 e 3 em relação ao grupo controle (Grupo 1) (p<O.OS). Além disso, naqueles animais do Grupo 4 elevações mais pronunciadas foram eveifenciadas em relação aos demais grupos nas determinações efetuadas 12, 24 e 48 após a cirurgia (p<O.OS). A soma dos valores das medidas individuais dos Grupo 2 e 3 não se distinguiram daquelas obtidas no Grupo 4 (p>O.OS). A concentração sérica da FA foi mais elevada em todas as determinações efetuadas naqueles animais submetidos a hepatectomia (G.3 e 4) em relação aos grupos de animais nos quais este procedimento não foi efetuado (Grupos 1 e 2) (p<O.OS). Experimento 2- Foi observado uma maior formação de malondialdeído (TBARS) nos tecidos hepáticos dos Grupos 3 e 4 em relação aos Grupos 1 e 2 (p<O.OS) e, além disso, ausência de diferença entre os Grupos 3 e 4 e entre os Grupos 1 e 2 (p>O.OS). Resultados semelhantes foram obtidos pelo método da QL. Experimento 3- A concentração sérica da AL Te AST foi superior (p<O.OS) nos Grupos 2 e 3 em relação ao grupo controle (Grupo 1) nas medidas efetuadas 12 e 24 horas após o procedimento e, nas determinações das 48 horas do Grupo 3 em relação aos demais (p<O.OS). A FA foi semelhante em todos os grupos de animais (p>O.OS). Experimento 4- A formação de malondialdeído foi maior nos animais do Grupo 3 em relação aos Grupo 1 e 2 (p<O.OS). Entre estes dois últimos grupos não houve diferença estatisticamente detectável (p>O.OS). Além disso, a QL demonstrou uma maior emissão de energia luminosa no Grupo 3 em relação aos demais (p<0.05) e, entre estes dois últimos os resultados foram semelhantes (p>0.05). Experimento 5- A taxa de mortalidade no grupo de animais submetidos a isquemia sem pré-tratamento como alopurinol (Grupo 3) foi de 40% nas primeiras 24h após o procedimento, estatisticamente distinta quando comparado ao Grupo 1 (cbntrole)(p<0.05). Entretanto, entre os animais do Grupo 2, ou seja, submetidos a isquemia e pré-tratamento com alopurinol, 13.3% foram ao óbito e este valor não se distingue dos animais do Grupo 1 (p>0.05). A avaliação entre os Grupos 2 e 3 não demonstrou diferença estatística (p>0.05). A mortalidade na avaliação das 48 horas foi igual entre os dois grupos (6.6% e 6.6%) (2 e 3) e não distintas, estatisticamente (p>0.05). Os demais animais sobreviveram durante o período de observação. Experimento 6- Congestão vascular hepática e necrose hepatocitária foram significativamente mais pronuncidas nos animais dos Grupos 2 e 3 em relação aos animais do grupo controle na avaliação efetuada 24 e 48 horas após a isquemia (p<0.05) e, além disso, a necrose foi maior nos animais do Grupo 3 em relação aos do Grupo 2 (p<0.05) apenas na avaliação das primeiras 24 horas após o procedimento cirúrgico. Não se observaram diferenças estatisticamente demonstráveis nas avaliações realizadas 72 e 96 horas após a cirurgia(p>0.05). Estes resultados sugerem que a via da xantina oxidase é uma das mais importantes rotas metabólicas envolvidas na geraçãode EAO, elementos quimicamente reativos e com potencial lesivo ao nível das membranas celulares dos hepatócitos e, que pelo menos em parte, são responsáveis pelos danos funcionais do fígado na síndrome da isquemia e reperfusão. Além disso, o alopurinol demonstrou efeitos protetores contra a lipoperoxidação decorrente da injúria reperfusional, embora a análise histopatológica não tenha demonstrado uma diferença estatisticamente significativa, o que pode ser justificado pelo fato das alterações provocadas nesta síndrome ocorram a nível de biomembranas celulares e de organelas não adequadamente visualizáveis pela microscopia óptica. / lt has been demonstrated that the oxygen free radical (EAO) contributes to the cellular damage induced by ischemia/reperfusion, probably mainly due to its lipid-oxidative characteristics. lt has been suggested that allopurinol has beneficiai effects in reducing the injury due to the reperfusion of previously ischemic organs, in this syndrome, as a result of its property of inhibiting the enzyme xanthine oxidase, most frequently referred as responsible for the EAO generation. This study was carried out with the purpose of elucidating the effects of hepatic ischemia-reperfusion in rats, the effects of allopurinol in this syndrome, the development of the assay for lipid peroxidation of hepatocyte membranes and the histopathologic features. To achieve this goal, the functional repercussion and the histopathologic features (analized 24 hours and eight days after surgery) were evaluated in wistar rats weighing 250-300 g. Experíment 1: performed for evaluating the way in which different procedures reflected upon the hepatic function. The animais were divided into 4 groups of 1 O rats each. Group 1- Contrais (sham operation); Group 2- rats submitted to total intermittent hepatic ischemia for 45 minutes: the first two 15-minute periods of ischemia were intercalated with 5 minutes of reperfusion; Group 3- rats which underwent partia! hepatectomy (mediai and left lobes). Group 4- lschemia as described above and at the end of partia! hepatectomy. Blood samples were obtained at 12, 24, 48, 72, 96 and 120 hours and 4, 21 and 28 days after the procedure to determine the leveis of the enzymes oxalopiruvic transaminase (AL T), oxaloacetic transaminase (AST) and alkaline phosphatase (AF). Experiment 2: performed for evaluating the lipoperoxidation of hepatocyte membranes by the methods of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and Chemoluminescence (QL) at different times of reperfusion. The animais were divided into 4 groups of 10 rats each: Group 1- Contrais (sham operation); Group 2- rats submitted to total hepatic ischemia for 60 minutes ; Group 3- total hepatic ischemia for 60 minutes and reperfusion for 30 minutes; Group 4- total hepatic ischemia for 60 minutes and reperfusion for 60 minutes. At the end of each operation time, a resection of the mediai lobe was performed, and hepatic tissue was removed and used for measuring lipid peroxidation by the methods described above. Experiment 3: performed for evaluating the effects of allopurinol on hepatic function in the setting of ischemia-reperfusion. The animais were divided into 3 groups of 1 O rats each: Group 1- Contrais (sham operation) treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 2- rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes and treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 3- rats submitted to 45 minutes of selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia followed by 5 minutes of reperfusion 22,5 minutes later. Blood samples were obtained 12, 24, 48 and 72 hours after the procedure to determine the activities of the AL T, AST and AF enzymes. Experiment 4: performed for evaluating the effects of allopurinol on hepatocyte membrane lipoperoxidation by the methods of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and Chemoluminescence (QL). The animais were divided into 3 groups of 1 O rats each: Group 1- Contrais (sham operation) treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 2- rats submitted to 45 minutes of selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia followed by 60 minutes of reperfusion and treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 3- rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes and reperfusion during 60 minutes. After the respective surgical times, the left and mediai lobes were removed and used for the lipoperoxidation assay by the TBARS and QL methods. Experiment 5: performed for evaluating the effects of allopurinol on mortality after the ischemia-reperfusion procedure. Forty animais were used and divided into 3 groups: Group 1- 10 control rats (sham operation) treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 2- 15 rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes and treated 5 hours and 1 hour before the procedure wíth two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 3: 15 rats submitted to 45 minutes of selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia followed by 5 minutes of reperfusion 22,5 minutes later. The animais were observed for 7 days after the procedure. Experiment 6: performed for analyzing the hepatic histopathologic features and the effects of the pre-treatment wíth allopurinol in the rats submitted to ischemia-reperfusion. Sixty animais were used and divided into three groups of twenty animais each: Group 1- Contrai rats (sham operation) treated 5 hours and 1 hour before the procedure wíth two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 2- rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes and treated 5 hours and 1 hour before the procedure wíth two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 3- rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes. Twenty-four, 48, 72 and 96 hours after the procedure, 5 rats of each group were sacrificed, and their left and right lobes were removed for histopathologic study (vascular congestion, necrosis and steatosis). Experiment 1: The determination of the AL T and AST leveis, after the procedure, demonstrated that these leveis were significantly higher in the groups 2 and 3 than in group 1 (p<0,05). Besides, among the animais of ali groups, those of group 4 had the highest leveis 12, 24 and 48 hours after the surgery. When the values of group 3 were added to the values of group 2, the results were not different from the values of group 4 (p>0,05). AF was higher in ali determinations, in the animais which underwent hepatectomy (groups 3 and 4) compared to those which were not submitted to this procedure (groups 1 and 2) (p< 0,05). Experiment 2: Malondialdehyde (TBARS) formation was higher in the groups 3 and 4 than in the groups 1 and 2 (p<0,05); besides, no difference was observed between the groups 3 and 4 and between the groups 1 and 2 (p>0,05). Similar results were observed with the QL method. These results suggest that the enzyme xanthine oxidase is one of the most important pathways involved in the generation of the EAbs, chemical reactive elements with injury potential at the levei of the hepatocyte membranes in the ischemia-reperfusion syndrome. At last, the results showed that allopurinol had beneficiai effects on hepatic function and lipid peroxidation and protective effects against hepatic ischemia-reperfusion injury. The histopathologic findings can be explained by the fact that the changes induced by this mechanism occur in organelles and biomembranes which are not visualized by light microscopy.

Introdução: O uso de Hipotermia Tópica ou Pré-Condicionamento Isquêmico (PCI) em ressecções hepáticas pode ser útil com o propósito de atenuar os danos de isquemia e reperfusão. Entretanto, até o presente momento, o uso combinado destas técnicas não foi avaliado. Objetivos: Desenvolver um modelo experimental para avaliar os danos de isquemia e reperfusão iniciais e a ocorrência de efeitos sinergísticos quando as duas ferramentas são aplicadas concomitantemente. Métodos: Realizou-se isquemia do fígado por noventa minutos e reperfusão por cento e vinte minutos. Os animais foram divididos nos grupos Controle (C), Isquemia Normotérmica (IN), Pré-condicionamento Isquêmico (PCI), Hipotermia 26ºC (H) e Hipotermia 26ºC + PCI (H+PCI). Foram avaliados a Pressão Arterial Média (PAM), a temperatura corporal e o fluxo biliar a cada 15 minutos, enquanto a ALT, AST, TBARS, SOD, CAT e os danos histopatológicos foram avaliados ao término da reperfusão. Resultados: Não foram observadas alterações na PAM e na temperatura corporal durante todo o experimento. O fluxo biliar retornou a valores semelhantes ao grupo C nos grupos H e H+PCI após 45 minutos de reperfusão, e foi significativamente maior nos grupos H e H+PCI em comparação aos grupos IN e PCI após 105 minutos (P<0,05 e P<0,05) e 120 minutos (P<0,05 e P<0,05) de reperfusão. Os níveis plasmáticos da AST e ALT demonstraram aumento significativo nos grupos IN (P<0,05 e P<0,05) e PCI (P<0,05 e P<0,05) em comparação ao grupo C. Os níveis de TBARS foram significativamente maiores nos grupos IN (P<0.01), PCI e H (P<0,05 e P<0,05) em comparação ao grupo H+PCI e significativamente maiores no grupo IN em comparação ao grupo C (P<0,05). No grupo H houve correlação negativa entre AST e ALT com o fluxo biliar (P<0,05 e P<0,05) e positiva entre AST e ALT com os níveis de TBARS (P<0,05 e P<0,05). Os níveis de CAT demonstraram aumento significativo no grupo PCI em comparação aos grupos C (P<0,01), IN e H+PCI (P<0,05 e p<0,05), enquanto os níveis de SOD foram significativamente maiores no grupo H em comparação ao grupo C (P=0,01), IN, PCI e H+PCI (P<0,05, respectivamente). Os danos histopatológicos foram leves, porém o grupo IN apresentou escores significativamente maiores em comparação ao grupo C (P<0,05). Conclusões: A utilização de hipotermia hepática tópica a 26ºC associada ao PCI promoveu um efeito protetor sinergístico sobre a peroxidação lipídica hepática. Além disso, a indução de hipotermia tópica isoladamente ou em associação com o PCI atenuou os danos hepatocelulares e permitiu uma recuperação precoce da função hepática após a reperfusão, um mecanismo provavelmente relacionado a um efeito da hipotermia sobre o estresse oxidativo e preservação de ATP. / Introduction: The use of Topical Hypothermia or Ischemic Preconditioning (IPC) in hepatic resections can be useful to attenuate ischemia/reperfusion injuries. However, until the present moment, the combination of both techniques was not evaluated. Objectives: Development of an experimental model to assess the initial ischemia/reperfusion injuries and the possible synergistic effects when both tools are applied concomitantly. Methods: Ninety minutes of ischemia and 120 minutes of reperfusion were applied to rat livers. Animals were divided into five groups: Control (C), Normothermic Ischemia (NI), Ischemic Preconditioning (IPC), Hypothermia 26ºC (H) and Hypothermia 26ºC plus IPC (H+IPC). Mean arterial pressure (MAP), body temperature and bile flow were assessed every 15 minutes whereas ALT, AST, TBARS, SOD, CAT and histopathologic injuries were evaluated at the end of reperfusion. Results: No differences were seen in MAP and body temperature throughout the experiment. Bile flow returned to values similar to C group in the H and H+IPC groups after 45 minutes of reperfusion and was significantly higher in the H and H+IPC groups after 105 minutes (P<0.05 and P<0.05) and 120 minutes (P<0.05 and P<0.05) of reperfusion in comparison to the NI and IPC groups. Plasmatic levels of AST and ALT were significantly higher in the NI (P<0.05 and P<0.05) and IPC (P<0.05 and P<0.05) groups in comparison to the C group. TBARS levels were significantly higher in the NI (P<0.01), IPC, and H (P<0.05 and P<0.05) groups in comparison to the H+IPC group and higher in the NI group in comparison to the C group (P<0.05). In the H group there was a negative correlation between ALT and AST to bile flow (P<0.05) and positive correlation between AST and ALT to TBARS (P<0.05 and P<0.05). CAT levels were significantly higher in the PCI group in comparison to the C (P<0.01), NI and H+IPC (P<0.05 and P<0.05) groups whereas SOD levels were significantly higher in the H group in comparison to the C (P=0.01), NI, PCI and H+IPC (P<0.05, respectively) groups. Histopathologic injuries were mild and the NI group showed a significantly greater score in comparison to the C group (P<0.05). Conclusions: The induction of topical liver hypothermia at 26ºC associated to IPC promoted a synergistic protective effect on hepatic lipid peroxidation. In addition, the induction of isolated topical hypothermia or hypothermia associated to IPC attenuated liver injuries and allowed an early recovery of the liver function after reperfusion, a mechanism probably related to an effect of hypothermia on oxidant stress and ATP preservation.

Evidências acumuladas em diversos estudos tem demonstrado que as Espécies Ativas do Oxigênio (EAO) contribuem para o dano celular decorrente da isquemia e reperfusão de órgãos, principalmernte, em função da propriedade oxidativa das mesmas sobre os constituintes lipídicos das membranas celulares. O alopurinol tem sido sugerido como droga capaz de interferir beneficamente diminuindo o dano celular decorrente da reperfusão de órgãos previamente isquêmicos, tendo em vista o seu potencial de inibir a enzima xantina-oxidase, a mais frequentemente referida como geradora de EAO. Este estudo foi desenvolvido como o objetivo de avaliar os efeitos da isquemia e reperfusão hepática em ratos e também os efeitos do prétratamento com o alopurinol, sobre a função deste órgão, lipoperoxidação das membranas celulares dos hepatócitos e, características histopatológicas decorrentes. Para tanto, ratos Wistar, pesando entre 250 e 300 gramas foram utilizados e divididos em 6 experimentos interdependentes. Experimento 1: realizado para avaliar os efeitos de diferentes procedimentos sobre a função hepática. Os animais foram divididos em 4 grupos de 1 O animais cada: Grupo 1- ratos controle; Grupo 2- ratos submetidos a isquemia troncular total e intermitente durante um tempo de 45 minutos, tendo sido permitida a reperfusão durànte 5 minutos após os dois primeiros intervalos de 15 minutos; Grupo 3- ratos submetidos a hepatectomia parcial (lobo médio e esquerdo); Grupo 4- ratos submetidos a isquemia conforme descrito e, no final do período, a hepatectomia parcial como no grupo anterior. Colheitas de sangue 12, 24, 48, 72, 96, 120 horas e no 14, 21 e 28 dias foram obtidas para determinação da atividade das transaminases oxalo-pirúvicas (AL T), oxaloacética (AST) e fosfatase alcalina (FA). Experimento 2: realizado para avaliar o grau de lipoperoxidação das membranas celulares dos hepatócitos, através dos métodos de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e da Quimiluminescência (QL), em diferentes tempos de reperfusão sanguínea. Para tanto, 40 ratos foram utilizados e divididos em 4 grupos de 1 O animais cada: Grupo 1: ratos controle (submetidos a laparotomia); Grupo 2- ratos submetidos a isquemia total durante 60 minutos não tendo sido permitida a reperfusão; Grupo 3- lsquemia total de 60 minutos e reperfusão por 30 minutos; Grupo 4- lsquemia total de 60 minutos e reperfusão por igual tempo. A ressecção do lobo médio, ao final de cada tempo operatório, foi realizada e, o tecido removido utilizado para medidas do grau de lipoperoxidação pelos métodos do TBARS e QL. Experimento 3: realizado para avaliar os efeitos do alopurinol sobre a função hepática em situações de isquemia e reperfusão. Para tanto 30 ratos foram utilizados, e divididos em 3 grupos de 1 O animais cada: Grupo 1- ratos controle, submetidos ao pré-tratamento com 50 mg/ Kg de peso da suspensão de alopurinol 5 e 1 hora antes da laparatomia, sem nenhum procedimento adicional; Grupo 2- lsquemia seletiva do lobo médio e esquerdo durante 45 minutos, porém em ratos pré-tratados com suspensão de alopurinol nas doses descritas anteriormente; Grupo 3- ratos submetidos a isquemia seletiva conforme descrito anteriormente. Medidas da ALT, AST e FA foram realizadas 12, 24, 48 e 72 horas após os procedimentos. Experimento 4: avaliar o efeito do alopurinol sobre o grau de lipoperoxidação das membranas celulares dos hepatócitos. Para tanto, 30 ratos foram utilizados e divididos em 3 grupos com 1 O animais cada: Grupo 1- ratos controle, submetidosum período de anestesia e laparotomia de 1 hora e 45 minutos; Grupo 2- ratos submetidos a isquemia de 45 minutos e reperfusão de 1 hora porém, pré-tratados com suspensão de alopurinol conforme descrição prévia. Grupo 3- ratos submetidos a isquemia de 45 minutos e reperfusão de 1 hora. Após os respectivos tempos operatórios,os animais foram submetidos a ressecção do lobo médio, utilizado para as medidas da lipoperoxidação pelos métodos do TBARS e QL. Experimento 5: avaliar os efeitos do alopurinol sobre a mortalidade pósoperatória em ratos submetidos a isquemia e reperfusão. Para tanto, 30 ratos foram utilizados e divididos em 3 grupos: Grupo 1- ratos controle, submetidos ao pré-tratamento com 50 mg/ Kg de peso da suspensão de alopurinol 5 e 1 hora antes da laparatomia, sem nenhum procedimento adicional; Grupo 2- ratos submetidos a isquemia seletiva do lobo médio e esquerdo durante 45 minutos, porém com pré-t r~tamento com suspensão de alopurinol nas doses descritas anteriormente. Grupo 3- lsquemia seletiva conforme descrito anteriormente. Experimento 6: avaliar as alterações histopatológicas da isquemia hepática em ratos pré-tratados e não com alopurinol. Para tanto, 60 ratos foram utilizados e divididos em 3 grupos de 20 animais: Grupo 1- ratos controle, submetidos ao pré-tratamento com 50 mg/ Kg de peso da suspensão de alopurinol 5 e 1 hora antes da laparatomia, sem nenhum procedimento adicional; Grupo 2- ratos submetidos a isquemia seletiva do lobo médio e esquerdo, durante 45 minutos, porém em ratos pré-tratados com suspensão de alopurinol nas doses descritas anteriormente. Grupo 3- lsquemia seletiva conforme descrito anteriormente. A cada 24 horas durante 4 dias, 5 animais de cada grupo eram sacrificados e, os lobos médio e esquerdo foram removidos para estudo histopatológico. Experimento 1- Significativa elevação nas concentrações séricas, nas medidas das 12 e 24 horas após o procedimento, das enzimas AL T e AST foram observadas nos Grupos 2 e 3 em relação ao grupo controle (Grupo 1) (p<O.OS). Além disso, naqueles animais do Grupo 4 elevações mais pronunciadas foram eveifenciadas em relação aos demais grupos nas determinações efetuadas 12, 24 e 48 após a cirurgia (p<O.OS). A soma dos valores das medidas individuais dos Grupo 2 e 3 não se distinguiram daquelas obtidas no Grupo 4 (p>O.OS). A concentração sérica da FA foi mais elevada em todas as determinações efetuadas naqueles animais submetidos a hepatectomia (G.3 e 4) em relação aos grupos de animais nos quais este procedimento não foi efetuado (Grupos 1 e 2) (p<O.OS). Experimento 2- Foi observado uma maior formação de malondialdeído (TBARS) nos tecidos hepáticos dos Grupos 3 e 4 em relação aos Grupos 1 e 2 (p<O.OS) e, além disso, ausência de diferença entre os Grupos 3 e 4 e entre os Grupos 1 e 2 (p>O.OS). Resultados semelhantes foram obtidos pelo método da QL. Experimento 3- A concentração sérica da AL Te AST foi superior (p<O.OS) nos Grupos 2 e 3 em relação ao grupo controle (Grupo 1) nas medidas efetuadas 12 e 24 horas após o procedimento e, nas determinações das 48 horas do Grupo 3 em relação aos demais (p<O.OS). A FA foi semelhante em todos os grupos de animais (p>O.OS). Experimento 4- A formação de malondialdeído foi maior nos animais do Grupo 3 em relação aos Grupo 1 e 2 (p<O.OS). Entre estes dois últimos grupos não houve diferença estatisticamente detectável (p>O.OS). Além disso, a QL demonstrou uma maior emissão de energia luminosa no Grupo 3 em relação aos demais (p<0.05) e, entre estes dois últimos os resultados foram semelhantes (p>0.05). Experimento 5- A taxa de mortalidade no grupo de animais submetidos a isquemia sem pré-tratamento como alopurinol (Grupo 3) foi de 40% nas primeiras 24h após o procedimento, estatisticamente distinta quando comparado ao Grupo 1 (cbntrole)(p<0.05). Entretanto, entre os animais do Grupo 2, ou seja, submetidos a isquemia e pré-tratamento com alopurinol, 13.3% foram ao óbito e este valor não se distingue dos animais do Grupo 1 (p>0.05). A avaliação entre os Grupos 2 e 3 não demonstrou diferença estatística (p>0.05). A mortalidade na avaliação das 48 horas foi igual entre os dois grupos (6.6% e 6.6%) (2 e 3) e não distintas, estatisticamente (p>0.05). Os demais animais sobreviveram durante o período de observação. Experimento 6- Congestão vascular hepática e necrose hepatocitária foram significativamente mais pronuncidas nos animais dos Grupos 2 e 3 em relação aos animais do grupo controle na avaliação efetuada 24 e 48 horas após a isquemia (p<0.05) e, além disso, a necrose foi maior nos animais do Grupo 3 em relação aos do Grupo 2 (p<0.05) apenas na avaliação das primeiras 24 horas após o procedimento cirúrgico. Não se observaram diferenças estatisticamente demonstráveis nas avaliações realizadas 72 e 96 horas após a cirurgia(p>0.05). Estes resultados sugerem que a via da xantina oxidase é uma das mais importantes rotas metabólicas envolvidas na geraçãode EAO, elementos quimicamente reativos e com potencial lesivo ao nível das membranas celulares dos hepatócitos e, que pelo menos em parte, são responsáveis pelos danos funcionais do fígado na síndrome da isquemia e reperfusão. Além disso, o alopurinol demonstrou efeitos protetores contra a lipoperoxidação decorrente da injúria reperfusional, embora a análise histopatológica não tenha demonstrado uma diferença estatisticamente significativa, o que pode ser justificado pelo fato das alterações provocadas nesta síndrome ocorram a nível de biomembranas celulares e de organelas não adequadamente visualizáveis pela microscopia óptica. / lt has been demonstrated that the oxygen free radical (EAO) contributes to the cellular damage induced by ischemia/reperfusion, probably mainly due to its lipid-oxidative characteristics. lt has been suggested that allopurinol has beneficiai effects in reducing the injury due to the reperfusion of previously ischemic organs, in this syndrome, as a result of its property of inhibiting the enzyme xanthine oxidase, most frequently referred as responsible for the EAO generation. This study was carried out with the purpose of elucidating the effects of hepatic ischemia-reperfusion in rats, the effects of allopurinol in this syndrome, the development of the assay for lipid peroxidation of hepatocyte membranes and the histopathologic features. To achieve this goal, the functional repercussion and the histopathologic features (analized 24 hours and eight days after surgery) were evaluated in wistar rats weighing 250-300 g. Experíment 1: performed for evaluating the way in which different procedures reflected upon the hepatic function. The animais were divided into 4 groups of 1 O rats each. Group 1- Contrais (sham operation); Group 2- rats submitted to total intermittent hepatic ischemia for 45 minutes: the first two 15-minute periods of ischemia were intercalated with 5 minutes of reperfusion; Group 3- rats which underwent partia! hepatectomy (mediai and left lobes). Group 4- lschemia as described above and at the end of partia! hepatectomy. Blood samples were obtained at 12, 24, 48, 72, 96 and 120 hours and 4, 21 and 28 days after the procedure to determine the leveis of the enzymes oxalopiruvic transaminase (AL T), oxaloacetic transaminase (AST) and alkaline phosphatase (AF). Experiment 2: performed for evaluating the lipoperoxidation of hepatocyte membranes by the methods of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and Chemoluminescence (QL) at different times of reperfusion. The animais were divided into 4 groups of 10 rats each: Group 1- Contrais (sham operation); Group 2- rats submitted to total hepatic ischemia for 60 minutes ; Group 3- total hepatic ischemia for 60 minutes and reperfusion for 30 minutes; Group 4- total hepatic ischemia for 60 minutes and reperfusion for 60 minutes. At the end of each operation time, a resection of the mediai lobe was performed, and hepatic tissue was removed and used for measuring lipid peroxidation by the methods described above. Experiment 3: performed for evaluating the effects of allopurinol on hepatic function in the setting of ischemia-reperfusion. The animais were divided into 3 groups of 1 O rats each: Group 1- Contrais (sham operation) treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 2- rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes and treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 3- rats submitted to 45 minutes of selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia followed by 5 minutes of reperfusion 22,5 minutes later. Blood samples were obtained 12, 24, 48 and 72 hours after the procedure to determine the activities of the AL T, AST and AF enzymes. Experiment 4: performed for evaluating the effects of allopurinol on hepatocyte membrane lipoperoxidation by the methods of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and Chemoluminescence (QL). The animais were divided into 3 groups of 1 O rats each: Group 1- Contrais (sham operation) treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 2- rats submitted to 45 minutes of selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia followed by 60 minutes of reperfusion and treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 3- rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes and reperfusion during 60 minutes. After the respective surgical times, the left and mediai lobes were removed and used for the lipoperoxidation assay by the TBARS and QL methods. Experiment 5: performed for evaluating the effects of allopurinol on mortality after the ischemia-reperfusion procedure. Forty animais were used and divided into 3 groups: Group 1- 10 control rats (sham operation) treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 2- 15 rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes and treated 5 hours and 1 hour before the procedure wíth two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 3: 15 rats submitted to 45 minutes of selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia followed by 5 minutes of reperfusion 22,5 minutes later. The animais were observed for 7 days after the procedure. Experiment 6: performed for analyzing the hepatic histopathologic features and the effects of the pre-treatment wíth allopurinol in the rats submitted to ischemia-reperfusion. Sixty animais were used and divided into three groups of twenty animais each: Group 1- Contrai rats (sham operation) treated 5 hours and 1 hour before the procedure wíth two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 2- rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes and treated 5 hours and 1 hour before the procedure wíth two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 3- rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes. Twenty-four, 48, 72 and 96 hours after the procedure, 5 rats of each group were sacrificed, and their left and right lobes were removed for histopathologic study (vascular congestion, necrosis and steatosis). Experiment 1: The determination of the AL T and AST leveis, after the procedure, demonstrated that these leveis were significantly higher in the groups 2 and 3 than in group 1 (p<0,05). Besides, among the animais of ali groups, those of group 4 had the highest leveis 12, 24 and 48 hours after the surgery. When the values of group 3 were added to the values of group 2, the results were not different from the values of group 4 (p>0,05). AF was higher in ali determinations, in the animais which underwent hepatectomy (groups 3 and 4) compared to those which were not submitted to this procedure (groups 1 and 2) (p< 0,05). Experiment 2: Malondialdehyde (TBARS) formation was higher in the groups 3 and 4 than in the groups 1 and 2 (p<0,05); besides, no difference was observed between the groups 3 and 4 and between the groups 1 and 2 (p>0,05). Similar results were observed with the QL method. These results suggest that the enzyme xanthine oxidase is one of the most important pathways involved in the generation of the EAbs, chemical reactive elements with injury potential at the levei of the hepatocyte membranes in the ischemia-reperfusion syndrome. At last, the results showed that allopurinol had beneficiai effects on hepatic function and lipid peroxidation and protective effects against hepatic ischemia-reperfusion injury. The histopathologic findings can be explained by the fact that the changes induced by this mechanism occur in organelles and biomembranes which are not visualized by light microscopy.

Introdução: embora a lesão por isquemia e reperfusão (I/R) renal possa ser reduzida por resfriamento, nenhuma análise sistemática in vivo da influência da temperatura foi empregada até o momento para avaliar o efeito de diferentes temperaturas nos danos provocados pela I/R renal. Objetivos: desenvolver um modelo experimental em ratos para avaliar os efeitos da variação local de temperatura (hipotermia renal tópica) nos danos, ou na prevenção destes, provocados por I/R. Além do desenvolvimento do modelo experimental, outro objetivo foi medir o efeito do estresse-oxidativo em diferentes grupos de temperatura no modelo experimental desenvolvido por nós. Métodos: estudo randomizado com ratos Wistar, machos adultos, pesando cerca de 400g, foram randomizados para quatro grupos experimentais com 7 animais em cada grupo. No grupo 1 a temperatura renal tópica foi ambiental; no grupo 2 foi induzida hipotermia local leve (26ºC) através do gotejamento de solução fisiológica resfriada até o alcance da temperatura-alvo; no grupo 3 a hipotermia tópica foi moderada (15ºC); e no grupo 4 a hipotermia profunda (4ºC) foi atingida através da utilização de solução fisiológica congelada (gelo). A temperatura sistêmica foi medida por termômetro retal. Já a temperatura cortical renal foi medida por termômetro com sonda intraparenquimatosa. Após anestesia geral através de injeção intraperitoneal de Ketamina (75mg/Kg) e Xilazina (10mg/Kg), os ratos foram submetidos a canulação retrorbital para obtenção de amostra de sangue antes da laparotomia. A seguir procedeu-se com nefrectomia direita (rim controle, removido logo após a laparotomia e não submetido a I/R ou hipotermia). O rim esquerdo teve interrupção do fluxo arterial ao longo de 40 minutos (isquemia). De acordo com o grupo, o rim era ou não resfriado. O resfriamento era mantido na temperatura alvo até o término dos 40 minutos. O rim era então reperfundido e o abdome era suturado. Os animais permaneciam em gaiola aquecida com água a disposição, mas não alimentos. Após 240 minutos de reperfusão os animais eram reoperados sob nova anestesia geral. O rim esquerdo e o sangue eram coletados, e os ratos eram sacrificados. O rim direito foi considerado o grupo controle, assim como o sangue coletado antes da laparotomia. A avaliação dos desfechos incluiu a medida de catalase (CAT), de superóxido dismutase (SOD), de ácido tiobarbicúrico (TBARS), de nitritos (NO2) e de nitratos (NO3) teciduais, além da medida de F2-isoprostanos (F2IP) plasmáticos. Também foi realizado exame histopatológico renal em hematoxilina-eosina (HE). Resultados: o exame histopatológico revelou que I/R (40’/240’) provocou lesão renal, independentemente da temperatura cortical renal, quando comparado com o grupo controle (P < 0,001). TBARS, um dos produtos da peroxidação lipídica, mostrou aumento em todos os grupos submetidos a I/R, independentemente da temperatura, em relação ao grupo controle. Catalase, enzima protetora contra o estresse oxidativo, mostrou aumento no grupo I/R normotérmico (G1, 37ºC) quando comparado ao grupo controle, indicando mobilização celular de mecanismos protetores intrínsecos. À medida que a temperatura era diminuída no grupo I/R, ocorreu diminuição da catalase em relação ao controle, mas sobretudo em relação ao I/R normotérmico, indicando que a hipotermia foi um mecanismo extrínseco de proteção, dispensando a mobilização da catalase. Foi detectada uma diferença estatisticamente significativa entre o grupo I/R normotérmico (G1, 37ºC) e o grupo submetido à hipotermia profunda (G4, 4ºC), com um P < 0.03. A avaliação dos demais marcadores de desfecho não mostrou diferenças estatisticamente significativas. Conclusões: isquemia renal de 40 minutos seguida de reperfusão por 240 minutos provocou lesão renal com alterações histopatológicas e também em um marcador de estresse oxidativo (TBARS). A avaliação da catalase (CAT) demonstrou que a hipotermia profunda (4ºC) foi provavelmente protetora, embora não tenha havido tradução histopatológica dessa proteção, nesse experimento agudo (240 minutos de reperfusão pós-isquêmica). / Introduction: Hypothermia has been associated with prevention against ischemiareperfusion (I/R) damage, but there is no experimental analysis, in vivo, regarding the role that hypothermia plays on renal injury induced by I/R. Objectives: The aims of this study were to design an animal model and evaluate the impact of predetermined ranges of temperatures on markers of oxidative stress and renal histologic sections. Methods: 28 Wistar male rats, under general anesthesia, undergone laparatomy to collect the right kidney (control group in each animal). The vascular pedicle of the left kidney was clamped during 40 minutes (ischemia). Four temperatures groups were designed, with 7 animals randomized for each group: normothermic (around 37oC), mild local hypothermia (26oC), moderate local hypothermia (15oC) and deep hypothermia (4oC). The systemic body temperature was kept during the operation through the warming of the surgical table. The left kidney cortical temperature was assessed with an intra parenchymal probe connected to a thermometer. For the systemic temperature measurement it was applied a common electronic rectal thermometer. After 40 minutes of ischemia, the left kidney had the vascular clamp removed, and the abdominal wall had been closed in two layers. The animals were kept alive in an incubator for 240 minutes, so they were re-laparotomized, under new anesthesia, and the left kidney was removed. Afterwards it was performed heart puncture in order to collect blood sample for plasmatic f2-isoprostanes. Half of each kidney (right and left, of all animals) had been kept on formalin and sent to pathological evaluation. The tissues stored on the freezer were used to analyze oxidative stress markers: catalase, SOD, TBARS, NO3, and NO2. Results: Core body temperature had not differed significantly between the groups. According to the pathological evaluation, all kidneys that suffered ischemia were significantly more injured than the controls (p < 0.001). No injury was found on the control group (right kidney of each rat). TBARS showed quite similar findings, showing increased levels in all I/R groups compared with the control group (P < 0.001). Concerning the protective enzyme catalase, it was observed an increase of this enzyme on the ischemic normothermic kidney when compared to the control. As the temperature was decreasing, more the catalase was decreasing, reaching a significant statistical difference (P < 0.03) between the ischemic normothermic group (G1, 37ºC) and the deepest hypothermic group (G4, 4ºC). No difference was found on nitrites and nitrates, superoxide dismutase, or on the plasmatic isoprostanes. Conclusion: This model was efficient in produce oxidative stress by I/R. Deep hypothermia has offered protection in this acute experiment (40 min of ischemia followed by 240 min of reperfusion).

Introdução: embora a lesão por isquemia e reperfusão (I/R) renal possa ser reduzida por resfriamento, nenhuma análise sistemática in vivo da influência da temperatura foi empregada até o momento para avaliar o efeito de diferentes temperaturas nos danos provocados pela I/R renal. Objetivos: desenvolver um modelo experimental em ratos para avaliar os efeitos da variação local de temperatura (hipotermia renal tópica) nos danos, ou na prevenção destes, provocados por I/R. Além do desenvolvimento do modelo experimental, outro objetivo foi medir o efeito do estresse-oxidativo em diferentes grupos de temperatura no modelo experimental desenvolvido por nós. Métodos: estudo randomizado com ratos Wistar, machos adultos, pesando cerca de 400g, foram randomizados para quatro grupos experimentais com 7 animais em cada grupo. No grupo 1 a temperatura renal tópica foi ambiental; no grupo 2 foi induzida hipotermia local leve (26ºC) através do gotejamento de solução fisiológica resfriada até o alcance da temperatura-alvo; no grupo 3 a hipotermia tópica foi moderada (15ºC); e no grupo 4 a hipotermia profunda (4ºC) foi atingida através da utilização de solução fisiológica congelada (gelo). A temperatura sistêmica foi medida por termômetro retal. Já a temperatura cortical renal foi medida por termômetro com sonda intraparenquimatosa. Após anestesia geral através de injeção intraperitoneal de Ketamina (75mg/Kg) e Xilazina (10mg/Kg), os ratos foram submetidos a canulação retrorbital para obtenção de amostra de sangue antes da laparotomia. A seguir procedeu-se com nefrectomia direita (rim controle, removido logo após a laparotomia e não submetido a I/R ou hipotermia). O rim esquerdo teve interrupção do fluxo arterial ao longo de 40 minutos (isquemia). De acordo com o grupo, o rim era ou não resfriado. O resfriamento era mantido na temperatura alvo até o término dos 40 minutos. O rim era então reperfundido e o abdome era suturado. Os animais permaneciam em gaiola aquecida com água a disposição, mas não alimentos. Após 240 minutos de reperfusão os animais eram reoperados sob nova anestesia geral. O rim esquerdo e o sangue eram coletados, e os ratos eram sacrificados. O rim direito foi considerado o grupo controle, assim como o sangue coletado antes da laparotomia. A avaliação dos desfechos incluiu a medida de catalase (CAT), de superóxido dismutase (SOD), de ácido tiobarbicúrico (TBARS), de nitritos (NO2) e de nitratos (NO3) teciduais, além da medida de F2-isoprostanos (F2IP) plasmáticos. Também foi realizado exame histopatológico renal em hematoxilina-eosina (HE). Resultados: o exame histopatológico revelou que I/R (40’/240’) provocou lesão renal, independentemente da temperatura cortical renal, quando comparado com o grupo controle (P < 0,001). TBARS, um dos produtos da peroxidação lipídica, mostrou aumento em todos os grupos submetidos a I/R, independentemente da temperatura, em relação ao grupo controle. Catalase, enzima protetora contra o estresse oxidativo, mostrou aumento no grupo I/R normotérmico (G1, 37ºC) quando comparado ao grupo controle, indicando mobilização celular de mecanismos protetores intrínsecos. À medida que a temperatura era diminuída no grupo I/R, ocorreu diminuição da catalase em relação ao controle, mas sobretudo em relação ao I/R normotérmico, indicando que a hipotermia foi um mecanismo extrínseco de proteção, dispensando a mobilização da catalase. Foi detectada uma diferença estatisticamente significativa entre o grupo I/R normotérmico (G1, 37ºC) e o grupo submetido à hipotermia profunda (G4, 4ºC), com um P < 0.03. A avaliação dos demais marcadores de desfecho não mostrou diferenças estatisticamente significativas. Conclusões: isquemia renal de 40 minutos seguida de reperfusão por 240 minutos provocou lesão renal com alterações histopatológicas e também em um marcador de estresse oxidativo (TBARS). A avaliação da catalase (CAT) demonstrou que a hipotermia profunda (4ºC) foi provavelmente protetora, embora não tenha havido tradução histopatológica dessa proteção, nesse experimento agudo (240 minutos de reperfusão pós-isquêmica). / Introduction: Hypothermia has been associated with prevention against ischemiareperfusion (I/R) damage, but there is no experimental analysis, in vivo, regarding the role that hypothermia plays on renal injury induced by I/R. Objectives: The aims of this study were to design an animal model and evaluate the impact of predetermined ranges of temperatures on markers of oxidative stress and renal histologic sections. Methods: 28 Wistar male rats, under general anesthesia, undergone laparatomy to collect the right kidney (control group in each animal). The vascular pedicle of the left kidney was clamped during 40 minutes (ischemia). Four temperatures groups were designed, with 7 animals randomized for each group: normothermic (around 37oC), mild local hypothermia (26oC), moderate local hypothermia (15oC) and deep hypothermia (4oC). The systemic body temperature was kept during the operation through the warming of the surgical table. The left kidney cortical temperature was assessed with an intra parenchymal probe connected to a thermometer. For the systemic temperature measurement it was applied a common electronic rectal thermometer. After 40 minutes of ischemia, the left kidney had the vascular clamp removed, and the abdominal wall had been closed in two layers. The animals were kept alive in an incubator for 240 minutes, so they were re-laparotomized, under new anesthesia, and the left kidney was removed. Afterwards it was performed heart puncture in order to collect blood sample for plasmatic f2-isoprostanes. Half of each kidney (right and left, of all animals) had been kept on formalin and sent to pathological evaluation. The tissues stored on the freezer were used to analyze oxidative stress markers: catalase, SOD, TBARS, NO3, and NO2. Results: Core body temperature had not differed significantly between the groups. According to the pathological evaluation, all kidneys that suffered ischemia were significantly more injured than the controls (p < 0.001). No injury was found on the control group (right kidney of each rat). TBARS showed quite similar findings, showing increased levels in all I/R groups compared with the control group (P < 0.001). Concerning the protective enzyme catalase, it was observed an increase of this enzyme on the ischemic normothermic kidney when compared to the control. As the temperature was decreasing, more the catalase was decreasing, reaching a significant statistical difference (P < 0.03) between the ischemic normothermic group (G1, 37ºC) and the deepest hypothermic group (G4, 4ºC). No difference was found on nitrites and nitrates, superoxide dismutase, or on the plasmatic isoprostanes. Conclusion: This model was efficient in produce oxidative stress by I/R. Deep hypothermia has offered protection in this acute experiment (40 min of ischemia followed by 240 min of reperfusion).

Introdução: O uso de Hipotermia Tópica ou Pré-Condicionamento Isquêmico (PCI) em ressecções hepáticas pode ser útil com o propósito de atenuar os danos de isquemia e reperfusão. Entretanto, até o presente momento, o uso combinado destas técnicas não foi avaliado. Objetivos: Desenvolver um modelo experimental para avaliar os danos de isquemia e reperfusão iniciais e a ocorrência de efeitos sinergísticos quando as duas ferramentas são aplicadas concomitantemente. Métodos: Realizou-se isquemia do fígado por noventa minutos e reperfusão por cento e vinte minutos. Os animais foram divididos nos grupos Controle (C), Isquemia Normotérmica (IN), Pré-condicionamento Isquêmico (PCI), Hipotermia 26ºC (H) e Hipotermia 26ºC + PCI (H+PCI). Foram avaliados a Pressão Arterial Média (PAM), a temperatura corporal e o fluxo biliar a cada 15 minutos, enquanto a ALT, AST, TBARS, SOD, CAT e os danos histopatológicos foram avaliados ao término da reperfusão. Resultados: Não foram observadas alterações na PAM e na temperatura corporal durante todo o experimento. O fluxo biliar retornou a valores semelhantes ao grupo C nos grupos H e H+PCI após 45 minutos de reperfusão, e foi significativamente maior nos grupos H e H+PCI em comparação aos grupos IN e PCI após 105 minutos (P<0,05 e P<0,05) e 120 minutos (P<0,05 e P<0,05) de reperfusão. Os níveis plasmáticos da AST e ALT demonstraram aumento significativo nos grupos IN (P<0,05 e P<0,05) e PCI (P<0,05 e P<0,05) em comparação ao grupo C. Os níveis de TBARS foram significativamente maiores nos grupos IN (P<0.01), PCI e H (P<0,05 e P<0,05) em comparação ao grupo H+PCI e significativamente maiores no grupo IN em comparação ao grupo C (P<0,05). No grupo H houve correlação negativa entre AST e ALT com o fluxo biliar (P<0,05 e P<0,05) e positiva entre AST e ALT com os níveis de TBARS (P<0,05 e P<0,05). Os níveis de CAT demonstraram aumento significativo no grupo PCI em comparação aos grupos C (P<0,01), IN e H+PCI (P<0,05 e p<0,05), enquanto os níveis de SOD foram significativamente maiores no grupo H em comparação ao grupo C (P=0,01), IN, PCI e H+PCI (P<0,05, respectivamente). Os danos histopatológicos foram leves, porém o grupo IN apresentou escores significativamente maiores em comparação ao grupo C (P<0,05). Conclusões: A utilização de hipotermia hepática tópica a 26ºC associada ao PCI promoveu um efeito protetor sinergístico sobre a peroxidação lipídica hepática. Além disso, a indução de hipotermia tópica isoladamente ou em associação com o PCI atenuou os danos hepatocelulares e permitiu uma recuperação precoce da função hepática após a reperfusão, um mecanismo provavelmente relacionado a um efeito da hipotermia sobre o estresse oxidativo e preservação de ATP. / Introduction: The use of Topical Hypothermia or Ischemic Preconditioning (IPC) in hepatic resections can be useful to attenuate ischemia/reperfusion injuries. However, until the present moment, the combination of both techniques was not evaluated. Objectives: Development of an experimental model to assess the initial ischemia/reperfusion injuries and the possible synergistic effects when both tools are applied concomitantly. Methods: Ninety minutes of ischemia and 120 minutes of reperfusion were applied to rat livers. Animals were divided into five groups: Control (C), Normothermic Ischemia (NI), Ischemic Preconditioning (IPC), Hypothermia 26ºC (H) and Hypothermia 26ºC plus IPC (H+IPC). Mean arterial pressure (MAP), body temperature and bile flow were assessed every 15 minutes whereas ALT, AST, TBARS, SOD, CAT and histopathologic injuries were evaluated at the end of reperfusion. Results: No differences were seen in MAP and body temperature throughout the experiment. Bile flow returned to values similar to C group in the H and H+IPC groups after 45 minutes of reperfusion and was significantly higher in the H and H+IPC groups after 105 minutes (P<0.05 and P<0.05) and 120 minutes (P<0.05 and P<0.05) of reperfusion in comparison to the NI and IPC groups. Plasmatic levels of AST and ALT were significantly higher in the NI (P<0.05 and P<0.05) and IPC (P<0.05 and P<0.05) groups in comparison to the C group. TBARS levels were significantly higher in the NI (P<0.01), IPC, and H (P<0.05 and P<0.05) groups in comparison to the H+IPC group and higher in the NI group in comparison to the C group (P<0.05). In the H group there was a negative correlation between ALT and AST to bile flow (P<0.05) and positive correlation between AST and ALT to TBARS (P<0.05 and P<0.05). CAT levels were significantly higher in the PCI group in comparison to the C (P<0.01), NI and H+IPC (P<0.05 and P<0.05) groups whereas SOD levels were significantly higher in the H group in comparison to the C (P=0.01), NI, PCI and H+IPC (P<0.05, respectively) groups. Histopathologic injuries were mild and the NI group showed a significantly greater score in comparison to the C group (P<0.05). Conclusions: The induction of topical liver hypothermia at 26ºC associated to IPC promoted a synergistic protective effect on hepatic lipid peroxidation. In addition, the induction of isolated topical hypothermia or hypothermia associated to IPC attenuated liver injuries and allowed an early recovery of the liver function after reperfusion, a mechanism probably related to an effect of hypothermia on oxidant stress and ATP preservation.