Orientador: Durvalina Maria Mathias dos Santos / Banca: Márcia Justino Rossini Mutton / Banca: João Atílio Jorge / Resumo: No presente estudo, verificou-se o acúmulo da trealose e da prolina livre e o crescimento inicial de duas cultivares de cana-de-açúcar, IAC91-2195 e IAC91-5155, sensível e tolerante ao estresse hídrico, respectivamente. Inicialmente, as mudas foram cultivadas sem qualquer restrição hídrica. Após 40 dias, foram transferidas para vasos com três níveis de disponibilidade hídrica do solo (DHS): 55% (sem estresse), 40% (estresse moderado) e 25% (estresse severo), mantidos pelo método das pesagens durante 30 e 60 dias. O delineamento experimental foi em blocos ao acaso, com quatro repetições, em arranjo fatorial 2x3x2 (cultivares x deficiência hídrica x épocas de crescimento). O experimento foi conduzido em casa de vegetação climatizada (29ºC e 75% UR). A cultivar IAC91-5155 apresentou maior acúmulo de trealose e de prolina livre nos menores níveis de disponibilidade hídrica do solo, indicando tolerância às condições de estresse hídrico. Aos 30 dias, sob estresse hídrico, houve maior acúmulo de prolina livre apenas na cv. IAC91-5155. Os osmoprotetores, trealose e prolina livre, podem ser indicados como marcadores bioquímico-fisiológicos de tolerância ao estresse hídrico somente para a cv. IAC91-5155. A cv. IAC91-5155 pode ser considerada mais tolerante ao estresse hídrico que a cv. IAC91-2195. / Abstract: In this work, the accumulation of trehalose and free proline and the initial growth were measured in two sugarcane cultivars, IAC91-2591 and IAC91-5155, sensitive and stress tolerant, respectively. Buds, after 40 days old cultivated in soil with no water restriction when were transferred to pots and submitted to three soil water levels: 55% (no stress), 40% (moderate stress) and 25% (severe stress). The experiment was carried out in greenhouse (29ºC and 75% RH). The Weighing Method was used to control the soil water levels for 30 and 60 days. The experimental design was randomized blocks with four replicates in 2x3x2 factorial arrangement (cultivars, water deficit and periods of growth). The cultivar IAC91-5155 showed higher accumulation of the trehalose and free proline under water deficiency. The accumulation of the proline was higher in IAC91-5155 cultivar at 30 days under soil water levels. Trehalose and free proline could only be considered as biochemical-physiological markers to soil water deficits in cultivar IAC91-5155. The cultivar IAC91-5155 may be more tolerant to water stress than IAC91-2195. / Mestre

A humanidade tem aumentado drasticamente o uso de antibióticos, antifúngicos, inseticidas, herbicidas e agentes quimioterápicos para tratar infecções, câncer e obter ganho econômico com a produção agrícola e industrial. O repetido uso destas substâncias leva freqüentemente à sua ineficiência devido à seleção de organismos resistentes ou tolerantes, com graves conseqüências econômicas e sociais. Os mecanismos envolvidos no processo de resistência à antifúngicos são pouco conhecidos. A compreensão destes mecanismos auxiliará no desenvolvimento de estratégias para a identificação de isolados clínicos resistentes, no tratamento de infecções fúngicas, na prevenção do surgimento de isolados resistentes, na definição de novas estratégias de utilização de antifúngicos, na revelação de novos alvos terapêuticos e portanto, no controle dos patógenos. Para o entendimento das bases moleculares da resistência à acriflavina e outros agentes inibidores em fungos nós clonamos, por transformação, um gene que confere esta resistência em Aspergillus nidulans e o caracterizamos molecularmente. Construímos uma biblioteca a partir de uma linhagem duplo-resistente e isolamos um clone que se mostrou capaz de transformar uma linhagem receptora sensível em resistente à acriflavina. A seqüência deste clone proveniente do mutante resistente, e de seu alelo selvagem revelou um gene de aproximadamente 2276 nucleotídeos traduzido em 697 aminoácidos, com alta similaridade com a trealose sintase/fosforilase (glicosiltransferase) de vários organismos. Esta seqüência foi depositada no “GenBanK” (AY102266). As enzimas trealose sintase e fosforilase participam da síntese da trealose que, além de ser fonte de carbono, está relacionada com a proteção das proteínas de membrana e das enzimas, e contra o estresse térmico e oxidativo em fungos filamentosos. As seqüências nucleotídicas dos alelos selvagem e mutante não apresentaram diferenças nas regiões estruturais ou promotoras. No entanto, a seqüência do cDNA da linhagem selvagem apresenta um íntron extra quando comparada com o cDNA da linhagem mutante. Portanto, o mRNA do gene da linhagem mutante não estaria sendo adequadamente processado, provavelmente por uma alteração no mecanismo envolvido neste processamento, inviabilizando a funcionalidade da trealose sintase / fosforilase produzida. O nocaute deste gene e a análise do fenótipo dos mutantes nulos na presença de acriflavina ou brometo de etídio confirmaram que ele não é essencial para o fungo. Através de genética clássica verificou-se que não há interação gênica ou sinergismo entre as mutações acrA1, que confere resistência à acriflavina e a outros inibidores, e tebA1, que confere resistência ao antimicótico terbinafina no fungo A. nidulans. / Mankind has drastically increased the use of antibiotics, antifungals, insecticides, herbicides and chemotherapeutic agents to treat infections and cancer and to obtain economic gains with agricultural and industrial production. The continuous use of these substances frequently leads to their inefficiency due to the selection of resistant or tolerant organisms, with serious economic and social consequences. The mechanisms involved in the process of antifungal resistance are little known. Understanding these mechanisms will help in the development of strategies for the identification of resistant clinical isolates, the treatment of fungal infections, the prevention of the occurrence of resistant isolates, the definition of new strategies for the use of antifungal agents, and the discovery of new therapeutic targets, and therefore the control of pathogens. To better understand the molecular basis of resistance to acriflavine and other inhibitory agents among fungi we cloned by transformation a gene that confers this resistance to Aspergillus nidulans and characterized it molecularly. We constructed a library from a double-resistant strain and isolated a clone that proved to be able to transform a receptor strain sensitive into an acriflavine-resistant strain. The sequence of this clone obtained from the resistant mutant and of its wild allele revealed a gene of approximately 2276 nucleotides translated into 697 amino acids, with high similarity to the trehalose synthase/phosphorylase (glycosyltransferase) of various organisms. This sequence was deposited in GenBanK (AY102266). The enzymes trehalose synthase and trehalose phosphorylase are related to the synthesis of trehalose, which in addition to being a carbon source is related to protection of the membrane proteins and of the enzymes against thermal and oxidative stress in filamentous fungi. The nucleotide sequences of the wild and mutant alleles did not show differences in the structural or promoter regions. However, the cDNA sequence of the wild strain presents an extra intron compared to the cDNA of the mutant strain. Thus, the mRNA of the gene of the mutant strain may not be adequately processed, probably due to an alteration in the mechanism involved in this processing, leading to inviability of the functionality of the trehalose synthase/phosphorylase produced. Knock out of this gene and analysis of the null mutant phenotypes in the presence of acriflavine or ethidium bromide confirmed that this gene is not essential for the fungus. Using classical Genetics, no gene interaction or synergism was observed between the acrA1 mutation, which confers resistance to acriflavine and to other inhibitors, and the tebA1 mutation, which confers resistance to the antimycotic agent terbinafine in the fungus A. nidulans.

Orientador: Marta Cristina Teixeira Duarte / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-26T04:57:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Matsumura_LauraYumeRodrigues_M.pdf: 1312693 bytes, checksum: 7afc440e71f8e63ffdb4e0f57d78115f (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As leveduras causam deterioração de uma grande variedade de produtos alimentícios e nas indústrias de bebidas, além de serem resistentes a muito conservantes químicos. Os óleos essenciais e extratos de plantas têm surgido como alternativas seguras para substituir conservantes sintéticos. Contudo, os mecanismos de ação de óleos essenciais sobre micro-organismos são complexos e não estão completamente elucidados. Neste trabalho, foi investigada a ação de 14 óleos essenciais e 2 extratos diclorometânicos provenientes de plantas medicinais e aromáticas pertencentes à CPMA (Coleção de Plantas Medicinais e Aromáticas) do CPQBA/UNICAMP sobre leveduras do gênero Candida e sobre Pichia guilliermondii de importância em alimentos. Foi determinada a concentração mínima inibitória (MIC) e os efeitos sobre a lise da membrana celular, sobre os carboidratos de reserva trealose e glicogênio, sobre a depleção de ATP e sobre a biossíntese de ergosterol. Os resultados demonstraram que o óleo essencial de Cinnamomum burmanni foi o que apresentou melhor potencial para controle das leveduras, sendo o cinamaldeído e o acetato de cinamila os compostos majoritários presentes neste óleo. A investigação dos possíveis mecanismos de ação do óleo essencial de C. burmanni sobre Candida albicans ATCC 10231 demonstrou que este afetou a viabilidade da levedura a partir da concentração de 0,5 mg/mL (5MIC), e ocasionou a lise da membrana celular, havendo liberação de proteínas e lipídios para o meio extracelular, além de depleção de ATP. No caso dos carboidratos de reserva, os resultados demonstraram que o óleo essencial de C. burmanni ocasionou acúmulo de trealose, possivelmente pelo estresse ocasionado às células. Nenhum efeito foi observado sobre a reserva de glicogênio e sobre a inibição da síntese de ergosterol. Os resultados indicam a ação inibitória do óleo essencial de C. burmanni e mostram que este apresenta potencial para controle de leveduras de importância em alimentos / Abstract: Yeasts cause deterioration of a wide variety of food and drink industries, besides being very resistant to chemical preservatives. Essential oils and plant extracts have emerged as safe alternatives to synthetic preservatives. However, the mechanisms of action of essential oils on microorganisms are complex and not fully elucidated. In this work, was investigated the action of 14 essential oils and 2 dichloromethane extracts from medicinal and aromatic plants belonging to the Collection of Medicinal and Aromatic Plants - CPMA at CPQBA/ UNICAMP on Candida species and Pichia guilliermondii of importance in foods. The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined and the effects of the essential oil on the cell membrane lysis, the carbohydrate reserves trehalose and glycogen, depletion of ATP and ergosterol biosynthesis were evaluated. The results showed that the essential oil from Cinnamomum burmanni presented the best potential to control the Candida spp. being the cinnamaldehyde and cinnamyl acetate the major compounds present in this oil. The investigation of the possible mechanisms of action of the C. burmanni essential oil on Candida albicans ATCC 10231 showed that the oil affected the viability of the yeast from 0.5 mg/mL (5MIC), and caused lysis of the cell membrane, with release of proteins and lipids into the extracellular environment, as well as ATP depletion. In the case of carbohydrate reserves, the results showed that the essential oil of C. burmanni caused accumulation of trehalose, possibly due to the cellular stress. No effect was observed on the synthesis of glycogen and ergosterol. The results indicate the inhibitory action of the essential oil from C. burmanni and show its potential to control yeasts of importance in foods / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestra em Ciência de Alimentos

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_rafael_tonieto.pdf: 295673 bytes, checksum: cde6d39f839653a9d49de2dfbef8ef62 (MD5) Previous issue date: 2008-10-24 / The low pregnancy rates obtained with artificial insemination using frozen ram semen make its routine use unfeasible. As the cryopreservation process causes injuries in the sperm cells, the development of extenders that include state-of-the art cryoprotectant solutions is justified. This study tested the inclusion of low density lipoprotein (LDL) and trehalose in extenders for freezing ram semen, by evaluating parameters of post-thawing semen quality. In the first experiment, 3 treatments were compared: Tris including 20% egg yolk and 5% glycerol (T1); Tris including 10 mM trehalose (T2); and T1 including 50 mM trehalose (T3). Sperm motility did not differ across treatments (P > 0.05), but T2 presented higher proportion of sperm cells having membrane integrity (P < 0.05). In the second experiment, 4 treatments were compared: Tris including 20% egg yolk (T1); T1 including 5% glycerol (T2); T1 including 100 mM trehalose (T3); and t1 including 100 mM trehalose and 5% glycerol (T4). Sperm motility and membrane integrity were higher for T2, T3 and T4 than for T1 (P < 0.05), but acrossome integrity did not differ among treatments (P > 0.05). In the third experiment, four treatments were compared: Tris including 20% egg yolk and 100 mM trehalose; and T1 with the replacement of egg yolk by LDL including 5% glycerol (T2); 100 mM trehalose (T3); and 100 mM trehalose and 5% glycerol (T4). Sperm motility and membrane integrity were higher for T2 and T3 than for the other treatments (P < 0.05), but there was no further difference among the LDL treatments (P > 0.05). Acrossome integrity did not differ across treatments (P > 0.05). Therefore, the inclusion of LDL and trehalose as cryoprotectants in extenders for frozen ram semen was associated with improvement in post-thawing sperm motility and membrane integrity. / Em ovinos, as baixas taxas de prenhez obtidas com inseminação artificial com sêmen congelado inviabilizam o seu uso como rotina. Provocando o processo de criopreservação lesões nos espermatozóides, o desenvolvimento de diluentes que incluam crioprotetores de excelência se justifica. Este trabalho testou a inclusão da lipoproteína de baixa densidade (LDL) e da trealose em diluentes para congelamento de sêmen ovino, a partir da avaliação de parâmetros de qualidade seminal pós-descongelamento. No primeiro experimento, foram comparados 3 tratamentos: Tris com 20% de gema de ovo e 5% de glicerol (T1); Tris com 100 mM de trealose (T2); e T1 com 50 mM de trealose (T3). A motilidade não diferiu entre os tratamentos (P > 0,05), mas o T2 apresentou maior proporção de gametas com membranas íntegras (P < 0,05). No segundo experimento, foram comparados 4 tratamentos: Tris com 20% de gema de ovo (T1); T1 com 5% de glicerol (T2); T1 com 100 mM de trealose (T3); e T1 com 100 mM de trealose e 5% de glicerol (T4). A motilidade e a integridade da membrana espermática do T2, T3 e T4 foram superiores a do T1 (P > 0,05), mas a integridade do acrossoma não diferiu (P > 0,05) em todos os tratamentos. No terceiro experimento, foram comparados 4 tratamentos: Tris com 20% de gema de ovo e 110 mM de trealose (T1); Tris com 8% de LDL, incluindo 5% de glicerol (T2); Tris com 8% de LDL, incluindo 110 mM de trealose (T3); Tris com 8% de LDL, incluindo 110 mM de trealose e 5% de glicerol (T4). A motilidade dos espermatozóides para o T2 e para o T3 foram superiores aos demais tratamentos (P < 0,05), mas, com relação à integridade de membrana, não houve diferença entre os tratamentos com LDL (P > 0,05). A integridade do acrossoma não diferiu entre os tratamentos (P > 0,05). Portanto, o uso de LDL e trealose como crioprotetores foi associado com melhorias na motilidade e na integridade da membrana espermática, no sêmen ovino, após o descongelamento.

The process of fermentation in products of bakery is the most important step and it is, in turn, responsible for the aroma of bread, because during this stage the aromatic and volatile compounds which we identify as the characteristic odor of the product are produced.The development of natural yeast is a difficult methodology and requires several steps of maintenance. Considering this aspect as well as the production that the aim of this work was to produce a lyophilized natural yeast, added different concentrations of trehalose, monitoring the physico-chemical and microbiological aspects involved during its manufacture performing analyzes to study cellular viability, the effects involved in the process of freezing and lyophilization and apply this product in bread type sourdough to evaluate the sensory and shelf life aspects. It was produced three types of lyophilized natural yeast, one without addition (FNL 0) of trehalose, one with the addition of 10% (FNL 10) and other with the addition of 15% (FNL 15). The counts (log CFU.g-1) of lactic acid bacteria and of molds and yeasts acid before and after the lyophilization process showed that trehalose has protected the cells of the microorganisms, enabling the lyophilization process, with significant differences (p<0,05) in the treatments with higher concentrations (10 and 15%) of this compound. From the lyophilized natural yeast, breads of sourdough type were elaborated to evaluate the physico-chemical, microbiological and sensory before a treatment with commercial yeast aspects. The results indicated a microbiological inhibition of bacteria and of fungi in treatments made with lyophilized natural yeast in different concentrations of trehalose, showing averages statistically (p<0,05) lower than in commercial breads with yeast. In the sensory evaluation, the breads with lyophilized natural yeast using 15% trehalose (FNL 15) obtained a reasonable concept by trained panel of tasters. / O processo de fermentação em produtos de padaria é a etapa mais importante e é, por sua vez, responsável pelo aroma do pão, pois durante essa etapa são produzidos os compostos aromáticos e voláteis aos quais identificamos como o odor característico do produto. O desenvolvimento de fermento natural é uma metodologia difícil e necessita de várias etapas de manutenção. Tendo em vista esse aspecto bem como o de produção que o objetivo deste trabalho foi produzir um fermento natural liofilizado, adicionado de diferentes concentrações de trealose, monitorando os aspectos físico-químicos e microbiológicos envolvidos durante sua fabricação realizando análises para estudar a viabilidade celular, os efeito envolvidos no proceso de congelamento e liofilização e aplicar esse produto em pão tipo sourdough para avaliar os aspectos sensoriais e de vida de prateleira. Produziu-se três tipos de fermento natural liofilizado, um sem a adição (FNL 0) de trealose, um com a adição de 10% (FNL 10) e outro com a adição de 15% (FNL 15). As contagens (log UFC.g-1) de bactérias ácido láticas e de bolores e leveduras antes e depois do processo de liofilização mostraram que a trealose protegeu as células dos microrganismos, viabilizando o processo de liofilização, com diferenças significativas (p<0,05) nos tratamentos com maior concentração (10 e 15%) desse composto. A partir dos fermentos naturais liofilizados, pães tipo sourdough foram elaborados para avaliar os aspectos físico-químicos, microbiológicos e sensoriais e comparados com pães fabricados com fermento comercial. Os resultados indicaram uma inibição microbiológica de bactérias e de fungos nos tratamentos fabricados com fermento natural liofilizado nas diferentes concentrações de trealose, apresentando médias estatisticamente (p<0,05) menores que nos pães com fermento comercial. Na avaliação sensorial, os pães com fermento natural liofilizado utilizando 15% de trealose (FNL 15) obtiveram um conceito razoável pelo painel treinado de provadores.

O gene AGT1 do locus mal1g, do sistema de transporte de maltose de S. cerevisiae, codifica uma proteína de 67 kDa, que tem 75% de similaridade e 58% de identidade com o transportador de maltose do locus MAL1. Sua expressão é ativada por genes reguladores constitutivos do sistema MAL, e é reprimida pela glicose. A cepa AP68-7A carrega o gene AGT1, e possivelmente o gene transportador MAL31, e transporta trealose ao final da primeira fase de crescimento anaeróbico. SDS-PAGE comparando proteínas de membranas de células reprimidas pela glicose (taxa de transporte &#60;0,5 U/mg), com aquelas de células induzidas por &#945;-metilglicosídeo (taxa de transporte de ~35 U/mg), verificou-se 2 bandas (PMs 57 e 66 kDa) exclusivas em membranas de células induzidas. As 2 bandas foram isoladas por três métodos diferentes (cromatografia de troca iônica, lavagens da membrana com tampão de alta força iônica e cromatografia de afinidade) e testadas para ligação de 14C-trealose. A ligação foi enriquecida ~3 X após a cromatografia de troca iônica. O transporte de trealose na cepa AP77-4C (que não tem nenhum dos genes transportadores dos loci MAL) foi recuperado após sua transformação com plasmídeo YEp366-AGT1. De membranas plasmáticas destas células (transporte de trealose ~25 U/mg) foram isoladas por cromatografia de afinidade, 2 bandas cujos PMs em SDS-PAGE são idênticos aos das proteínas isoladas das membranas da cepa AP68-7A. Estes resultados permitem concluir que o transportador de trealose de leveduras é codificado pelo gene AGT1. / The AGT1 gene presente in the mal1g locus from S. cerevisiae maltose transport system encodes a 67 kDa protein which shares 75% similarity and 58% identity with the maltose transporter protein encoded in MAL6 locus. The expression of this gene is regulatory genes from MAL system and is repressed by glucose. The strain AP68-7A which harbors the AGT1 gene and probably the MAL31 transporter gene, expresses trehalose transport activity at the end of first anaerobic growth. The comparison from the SDS-PAGE of membrane proteins from glucose repressed cells (trehalose transport activity of &#60;0.5 U/mg), and &#945;-methylglucoside induced cells (trehalose transport activity of ~35 U/mg), revealed 2 bands (Mr 57 and 66 kDa) present only in the induced cells membranes. Those bands were isolated by 3 different methods (ionic exchange chromatography, high strength ionic washes and affinity chromatography, and tested for 14C-trehalose binding. Both bands bind trehalose and this activity was enriched about 3 times after the ionic exchange chromatography. The trehalose transport activity was recovered by strain AP77-4C, (which does not harbor any MAL transporter gene) after its transformation with a plasmid containing the AGT1 gene. From the membranes of these cells (trehalose transport activity of ~25 U/mg) 2 bands were isolated by affinity chromatography with similar Mrs to those isolated from AP68-7A strain. The results permit to conclude that the AGT1 gene encodes the yeast trehalose transporter.

Idebenone is an antioxidant, a synthetic derivative of coenzyme Q10, with several applications, such as neuroprotection. However, this drug has low solubility in water, besides is irritant substance and has chemical instability. Hence, idebenone-loaded nano-organized systems have been developed, such as polymeric nanocapsules (NC). Vegetable oils containing antioxidants such as coconut oil and palm oil can be interesting for the composition of these particles. In this way, the aim of this work was to develop NC suspensions containing different oils as core (palm, coconut or medium chain triglycerides) for delivery of neuroprotective agent idebenone in order to compare the behavior of these systems concerning physico-chemical stability, photostability, controlled release, and conversion to redispersible solid dosage forms (lyophilized products). The nanocapsules were prepared by interfacial deposition of preformed polymer. As the results, it was possible to prepare poly(Ɛ-caprolactone) NC suspensions and palm oil (PO/PCL) or Eudragit® RS100 and coconut oil (OC/EUD) containing idebenone (1.0 mg/mL) with appropriate physico-chemical characteristics. Parameters such as the proportion of aqueous phase/organic phase, type of both surfactant (low HLB) and polymer influenced the optimization of these systems. For comparison, corresponding formulations were prepared with medium chain triglycerides (TCM/PCL or TCM/EUD), using the same conditions. The suspensions had an average diameter between 166 and 216nm, low polydispersity index (0.085 to 0.142), positive or negative zeta potential, depending on the characteristics of the polymer, and high encapsulation efficiency. The maintenance of average particle diameter and low polydispersity index have be verified during stability study (room temperature and exposed or not to light) for 75 days. However, the idebenone content significantly decreased in this period, with influence on the type of polymer. Thereafter, photostability study has shown that the suspensions NC OP/PCL (UVC/UVA) and TCM/PCL (UVA) were able to significantly reduce the degradation of idebenone (content: 53,7-76,1%) compared to an aqueous micellar (content: 31,2-63,1%) dispersion containing the drug. In addition, these systems were able to promoting drug controlled release (t1/2 26 h), without burst effect, showing monoexponential profile (t1/2< 3.0 h for free drug). The lyophilization of suspensions, employing trehalose as soluble carbohydrate, resulted in suitable and redispersible products (content of 96-100%, less than 3.6% moisture; 0.8-1.2 index), presenting several spherical structures, including in colloidal range, featuring the presence of NC in these dried products. In the stability study (room temperature/protection from light and moisture), it was observed that the lyophilized products were able to delay or decrease the degradation of idebenone compared to suspensions of origin, regardless of the both type of polymer (PCL/EUD) and oil (OP/OC/TCM). In conclusion, the developed systems are promising for the controlled release of neuroprotective drug idebenone. / A idebenona é um antioxidante, derivado sintético da coenzima Q10, com várias aplicações, como em neuroproteção. No entanto, este fármaco possui baixa solubilidade em água, potencial irritativo e instabilidade química, fato que tem despertado o interesse em sua associação a sistemas nano-organizados. Dentre estes, destacam-se as nanocápsulas poliméricas (NC). Óleos vegetais, contendo compostos antioxidantes, como óleo de coco e de palma, podem ser interessantes para a composição destas partículas. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi desenvolver suspensões de NC contendo diferentes óleos como núcleo (palma, coco ou triglicerídeos de cadeia média), almejando à veiculação do neuroprotetor idebenona, de forma a comparar o comportamento dos sistemas quanto à estabilidade físico-química, fotoestabilidade, controle de liberação, além da conversão em formas farmacêuticas sólidas redispersíveis (liofilizados). As NC foram preparadas pelo método de deposição interfacial de polímero pré-formado. Conforme os resultados, foi possível preparar suspensões de NC de poli(ε-caprolactona) e óleo de palma (OP/PCL) ou de Eudragit® RS100 e óleo de coco (OC/EUD), contendo idebenona (1,0 mg/mL), com características físico-químicas adequadas, sendo que fatores como proporção das fases aquosa/orgânica, tipo de tensoativo de baixo EHL e de polímero influenciaram a otimização dos sistemas. Para fins comparativos, formulações correspondentes foram preparadas com triglicerídeos de cadeia média (TCM/PCL ou TCM/EUD), empregando as mesmas condições. As suspensões apresentaram diâmetros médios entre 166 e 216 nm, baixos índices de polidispersão (0,085-0,142), potencial zeta positivo ou negativo, dependendo das características do polímero e elevada eficiência de encapsulamento. Quando estas suspensões foram submetidas a estudo de estabilidade, à temperatura ambiente e expostas ou não à luz, durante 75 dias, verificou-se manutenção dos diâmetros médios de partículas e baixos índices de polidispersão. Entretanto, o teor de idebenona decaiu significativamente neste período, com influência significativa do tipo de polímero. Após, estudo de fotoestabilidade demonstrou que as suspensões de NC OP/PCL (UVC/UVA) e TCM/PCL (UVA) foram capazes de reduzir significativamente a degradação da idebenona (teor remanescente: 53,7-76,1%) em comparação a uma dispersão micelar aquosa contendo o fármaco (teor remanescente: 31,2-63,1%), além de promoverem liberação controlada da mesma (t1/2 26 h), sem efeito burst, com perfil ajustado ao modelo monoexponencial (t1/2<3,0 h para fármaco livre). A liofilização das suspensões, empregando trealose, um carboidrato solúvel, resultou em produtos adequados (teor entre 96-100 %; umidade inferior a 3,6 %), redispersíveis (índice de ressuspensão entre 0,8-1,2) e com a presença de inúmeras estruturas esféricas, inclusive na faixa coloidal, caracterizando a presença das NC nestes produtos secos. No estudo de estabilidade (temperatura ambiente/proteção da luz e da umidade), observou-se que os produtos liofilizados foram capazes de retardar ou diminuir significativamente a degradação da idebenona em comparação às suspensões de origem, independentemente do tipo de polímero (PCL/EUD) e de óleo (OP/OC/TCM). Sendo assim, os sistemas desenvolvidos são promissores para a liberação controlada do neuroprotetor idebenona.

Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2018-12-03T17:42:10Z No. of bitstreams: 1 ANA HELENA DE CASTRO DAL FORNO.pdf: 1125113 bytes, checksum: bac2174a37c6246d7048e40640b14f02 (MD5) / Approved for entry into archive by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2018-12-03T17:42:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ANA HELENA DE CASTRO DAL FORNO.pdf: 1125113 bytes, checksum: bac2174a37c6246d7048e40640b14f02 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-12-03T17:42:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ANA HELENA DE CASTRO DAL FORNO.pdf: 1125113 bytes, checksum: bac2174a37c6246d7048e40640b14f02 (MD5) Previous issue date: 2017-03-17 / A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença paralisante e fatal caracterizada por degeneração e morte dos neurônios motores que é geralmente fatal dentro de cinco anos após diagnóstico e sem tratamento eficaz atual. Aproximadamente 10% dos casos de ELA são familiares (ELAf) e cerca de 20% de ELAf estão associados a mutações no gene superóxido dismutase 1 (sod1). Em busca de modelos experimentais alternativos que possam substituir e oferecer novas possibilidades de ensaio de toxicidade xenobiótica, o nematóide Caenorhabditis elegans foi considerado favorável como um valioso organismo bioindicador. Utilizando cepas transgênicas de C. elegans como modelo ELA HA2619, HA2622, HA2425, HA2426 testamos diferentes compostos para avaliar sua eficácia nas alterações resultantes da mutação em modelo da ELA. Foram testados trealose (5 mM) com vitamina E (200 μg/mL) e os compostos orgânicos (1 μM) 4-fenilselanil-7-cloroquinolina (PSQ) e 4-feniltellanil-7-cloroquinolina (PTQ). Nenhum dos tratamentos testados apresentou resultados positivos para o aumento da longevidade ou diminuição na paralisia, o que nos levou a questionar se os tratamentos podem ter desencadeado um aumento dos sintomas e consequentemente uma piora nos vermes. Também observamos que o tratamento com os compostos orgânicos contra o dano oxidativo causado pelo peróxido de hidrogênio (0,6 mM) não foi revertido. Em nossas perspectivas, mais estudos são necessários para encontrar terapias que podem prolongar a longevidade e diminuir ou retardar a paralisia. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal paralytic disorder characterized by degeneration of motorneuron which is generally fatal within five years of diagnosis and with no current effective treatment. Approximately 10% of the ALS cases are familial ALS (fALS) and about 20% of fALS are associated with mutations in the superoxide dismutase 1 gene (sod1). Seeking for alternative experimental models that may substitute and offer new possibilities to assay xenobiotics toxicity, the nematode Caenorhabditis elegans has been found favorable as a valuable bioindicator organism. Using C. elegans transgenic strains as ALS model HA2619, HA2622, HA2425, HA2426 we tested compounds to evaluate the efficacy in treatment of ALS. Trehalose (5mM) with vitamin E (200μg/mL) and the organocompounds (1μM) 4-phenylselanyl-7-chloroquinoline (PSQ) and 4-phenyltellanyl-7-chloroquinoline (PTQ) were tested. None of the treatments tested positive for increased longevity or delayed or decreased paralysis, which led us to wonder if the treatments may have triggered an increase in symptoms and worsening of the worms. We also observed the treatment with the organocompounds against the oxidative damage caused by hydrogen peroxide (0.6mM) was not reversed. In our perspectives further studies are needed to find therapies that may prolong longevity and decrease or delay paralysis.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Spray-drying and freeze-drying are dehydration techniques which serve as alternative to increase the stability of formulations which are in aqueous medium. Therefore, this study objectived the development of redispersible dried products prepared from suspensions of polymeric nanocapsules and nanoemulsions using tioconazole, an antifungal. The suspension of nanocapsules, prepared using poli(-caprolactona) - PCL and Eudragit® RS100 polymers, and nanoemulsions containing tioconazole (1.0 mg/ml) were evaluated in relation to mean particles size, drug content, pH and encapsulation efficiency, and after preparation, showed physicochemical characteristics suitable: mean particles size in the nanometer range (110 210 nm), polydispersity index below 0.20, drug content near to theoretical and encapsulation efficiency of approximately 100 % and 86 % for the PCL and Eudragit® RS100 nanocapsules, respectively. Furthermore, the formulations have been stable for 30 days. After, the liquid formulations were subjected to spray-drying and/or freeze-drying using lactose and trehalose as adjuvants in a proportion of 10 % (w/v). The dried products were characterized in relation to yield, index resuspension in water, drug content, moisture and morphology. Regardless of the method of dehydration and adjuvant, the dried products presented satisfactory physicochemical characteristics: yield 50 100 % (depending on the technique of dehydration), drug content near to theoretical, percentage of moisture of less than 4.2 %, good redispersion in water, is possible to verify the presence of nanometric and micrometric particles (by laser diffraction), and the recovery of nanometer size similar to the original liquid formulation, after filtration (photon correlation spectroscopy). Morphological analysis showed the presence of rounded particles for the powders obtained by spray-drying and irregular to those obtained by freeze-drying. Dried products were stable for 30 days, however, the powders obtained from nanoemulsions and nanocapsules of Eudragit® RS100, by spray-drying and lactose as adjuvant showed a decrease in tioconazole content. The suspensions of nanocapsules and nanoemulsions and their respective dried products containing tioconazole showed antifungal activity against the yeast C. albicans, demonstrating that the dehydration process did not affect the action of the drug. Evaluation of in vitro release of the drug by the technique of dialysis bags showed that dried products prepared from nanocapsules were able to promote the control release of the drug, especially the dried products obtained from nanocapsules of PCL by spray-drying, which showed more tioconazole control release at time of 48 hours. / A secagem por aspersão (spray-drying) e a liofilização são técnicas de desidratação que servem como alternativa para aumentar a estabilidade de formulações que se encontram em meio aquoso. Neste sentido, este trabalho objetivou o desenvolvimento de produtos secos redispersíveis preparados a partir de suspensões de nanocápsulas poliméricas e nanoemulsões utilizando o tioconazol, um fármaco antifúngico. As suspensões de nanocápsulas, preparadas com os polímeros poli(-caprolactona) PCL e Eudragit® RS100, e nanoemulsões contendo tioconazol (1,0 mg/mL) foram avaliadas quanto ao diâmetro médio de partículas, teor de fármaco, pH e eficiência de encapsulamento, as quais, após a preparação, apresentaram características físico-químicas adequadas: diâmetro médio de partículas na faixa nanométrica (110 210 nm), índice de polidispersão abaixo de 0,20, teor de fármaco próximo ao teórico e eficiência de encapsulamentro de, aproximadamente, 100 % e 86 % para as nanocápsulas de PCL e Eudragit® RS100, respectivamente. Além disso, as formulações foram estáveis por 30 dias. Após, as formulações líquidas foram submetidas à secagem por aspersão e/ou a liofilização, utilizando a lactose e a trealose como adjuvantes, na proporção de 10 % (m/v). Os produtos secos foram caracterizados em relação ao rendimento, índice de ressuspensão em água, teor de fármaco, umidade e morfologia. Independente do método de desidratação e do adjuvante, os produtos secos apresentaram características físico-químicas satisfatórias: rendimento de 50 100 % (dependendo da técnica de desidratação), teor de fármaco próximo ao teórico, percentual de umidade inferior a 4,2 %, boa redispersão em água, sendo possível verificar a presença de partículas nanométricas e micrométricas (por difração a laser), e a retomada do tamanho nanométrico semelhante à formulação líquida original, após filtração (espectroscopia de correlação de fótons). Na análise morfológica foi observada a presença de partículas arredondadas para os pós obtidos por spray-drying e irregulares para os obtidos por liofilização. Os produtos secos foram estáveis por 30 dias; todavia, os pós obtidos a partir de nanoemulsões e nanocápsulas de Eudragit® RS100, por spray-drying e lactose como adjuvante, apresentaram um decaimento no teor de tioconazol. As suspensões de nanocápsulas e nanoemulsões e seus respectivos produtos secos contendo tioconazol apresentaram atividade antifúngica frente à levedura de C. albicans, demonstrando que os processos de desidratação não afetaram a ação do fármaco. A avaliação de liberação in vitro do fármaco pela técnica de sacos de diálise demonstrou que os produtos secos preparados a partir de nanocápsulas foram capazes de promover o controle de liberação do fármaco, destacando-se os produtos secos obtidos a partir de nanocápsulas de PCL por spray-drying que apresentaram maior controle na liberação do tioconazol no tempo de 48 horas.

Orientador: Maria Isabel Rodrigues / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-12T12:57:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Colla_Eliane_D.pdf: 1516516 bytes, checksum: 2ea39d8d8dd66d24b6ec65db5dedeea9 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A trealose é um agente natural de proteção em células de leveduras, fungos, bactérias, insetos e plantas, tendo sido indicada como componente essencial para a manutenção da viabilidade celular sob condições de estresse. Em função das diversas possibilidades de aplicação, especialmente em produtos de alto valor agregado como cosméticos e produtos farmacêuticos, onde pode exercer a função de estabilização e de proteção, a produção da trealose tem motivado inúmeras pesquisas. O objetivo principal deste trabalho foi selecionar leveduras potencialmente produtoras de trealose e otimizar as condições de produção utilizando meios de cultivo alternativos para a redução dos custos do processo. A primeira etapa consistiu na seleção de leveduras potencialmente produtoras de trealose, na qual foram testadas cepas isoladas de flores e frutos coletados no Cerrado (GO), Pantanal (MS), Floresta Amazônica (AM) e Mata Atlântica (SP), e também cepas isoladas de dornas de fermentação alcoólica de usinas produtoras de etanol do estado de São Paulo. A partir da gama de leveduras testadas, foram selecionadas duas cepas potencialmente produtoras de trealose, identificadas como Rhodotorula dairenensis e Rhodosporidium paludigenum, ambas isoladas de flores coletadas no bioma Cerrado. Na segunda etapa do estudo foi realizada a otimização do crescimento celular das leveduras citadas, uma vez que a trealose é um produto intracelular. Utilizou-se uma estratégia seqüencial de planejamento experimental, onde inicialmente foram avaliados os efeitos das concentrações de melaço, água de maceração de milho e extrato de levedura comercial Prodex Lac®, pH e temperatura de cultivo, sobre o crescimento celular de ambas leveduras, através de um planejamento fracionário. Posteriormente, um Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) foi utilizado para a otimização das condições de crescimento celular. Para a levedura Rhodotorula dairenensis estas condições corresponderam a 50g/L de melaço e 50g/L de água de maceração de milho, temperatura de cultivo de 30ºC e pH inicial de 5,5, obtendo-se resultados de massa seca de aproximadamente 19 g/L. Para Rhodosporidium paludigenum a massa seca atingiu 31 g/L em meio de cultivo contendo 50 g/L de melaço e 140 g/L de água de maceração de milho, a 25ºC e pH inicial de 5,5. Nestas condições, realizou-se o estudo da produção da trealose sob condições de estresse térmico onde as variáveis estudadas foram a temperatura (33-47ºC) e o tempo de exposição (60-120 minutos) dos cultivos ao estresse térmico, pela técnica de DCCR. Ambas cepas estudadas foram negativamente afetadas pelo acréscimo da temperatura de estresse térmico dentro da faixa estudada. Em temperaturas superiores a 40ºC houve diminuição do crescimento celular e viabilidade celular e, conseqüentemente, dos resultados de trealose. Para a levedura Rhodotorula dairenensis, o máximo rendimento de trealose intracelular obtido foi de aproximadamente 18% (g trealose/100g massa seca) em condições de temperatura de 34 a 35ºC e 70 - 90 minutos para o tempo de exposição ao estresse térmico. A cepa Rhodosporidium paludigenum apresentou rendimentos de aproximadamente 14 a 16% (g trealose/100g massa seca) na faixa de temperatura entre 35 e 40ºC, em qualquer tempo de exposição na faixa estudada (60 - 120 minutos) / Abstract: Trehalose is a natural cell-protecting agent that has been isolated and characterized from a large variety of plants, insects, fungi and bacteria, and many studies indicate that this disaccharide is an essential component for maintaining cell viability under stress conditions. Due to the potential application of trehalose, especially in cosmetics and pharmaceuticals fields, the interest of many research groups into the development of economically feasible production systems has increased in recent years. The present study reports on the screening for high trehalose production by yeasts and the optimization of the conditions for trehalose production using an industrial medium composed by molasses and corn steep liquor, to reduce costs of the cultivation medium. Initially, a technical screening was applied to select yeasts with a potential for trehalose production; strains isolated from pollen of flowers and fruits collected in different microhabitats in Brazil, and from alcoholic fermentation tanks were tested. Two potentially producing strains were selected and identified as Rhodotorula dairenensis and Rhodosporidium paludigenum, both isolated from flowers collected in Cerrado. Sequentially, a study for the cell growth optimization of the selected yeasts was performed, since trehalose is an intracellular product. A sequential strategy of experimental design was used; initially, the effects of the concentrations of sugar cane molasses, corn steep liquor and a commercial yeast extract Prodex Lac SD®, and of pH and temperature on the biomass were studied using a fractional design, which was followed by a central composite rotatable design (CCRD). For the yeast Rhodotorula dairenensis, the optimum values for cell growth were 50 g/L for the molasses and corn steep liquor concentrations, initial pH of 5.5 and temperature of 30 ºC, with no yeast extract, reaching values around 19 g/L for biomass. For the yeast Rhodosporidium paludigenum, biomass concentration obtained was 31 g/L in cultivation medium containing 50 g/L of molasses and 140g/L of corn steep liquor, initial pH of 5.5 and temperature of 25 ºC, with no yeast extract. Under these conditions, the production of trehalose was studied using a CCRD to optimize the temperature (33 to 47 ºC) and exposition time (60 to 120 minutes) of the cultures to the thermal stress. For both strains studied, the variable temperature presented a negative effect on trehalose accumulation, in the range studied. In conditions of temperature above 40 ºC there was a decrease of the cell growth and cell viability and, consequently, a decrease of trehalose yields. For the yeast Rhodotorula dairenensis the maximum intracellular trehalose content reached was 18% (g trehalose/100g dry cell) at temperatures of 34 and 35 ºC and between 70 and 90 min of exposition time to the thermal stress. For the strain Rhodosporidium paludigenum the statistical methodology led to maximum contents of intracellular trehalose in the range of 14 -16% (g trehalose/100g dry cell) under thermal stress temperatures of 35 - 40 ºC in all exposition time to the thermal stress in the range studied / Doutorado / Doutor em Engenharia de Alimentos