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Nouvelle approche de décryptage de la diversité bactérienne environnementale par capture magnétique de populations spécifiques de bactéries au sein de microbiotes complexes / Development of magnetic in situ hybridization technics for labelling and selective capture of bacteria for the study of environmental bacterial biodiversity.Royet, David 16 March 2017 (has links)
Les bactéries, organismes les plus abondants de notre planète, ont un rôle fondamental dans le fonctionnement des écosystèmes. En dépit de leur importance, la caractérisation des communautés bactériennes (microbiotes) demeure encore aujourd’hui très incomplète. Ceci a pour origine l’impossibilité de complètement décrypter taxonomiquement et fonctionnellement les microbiotes de ces écosystèmes et donc à appréhender la diversité bactérienne dans son ensemble que ce soit par des approches culturales (avec seulement 1% de bactéries cultivables) ou par des approches metagénomiques limitées par les biais d’extraction, de séquençage et d’analyse. Les travaux entrepris dans le cadre de cette thèse visent à développer une nouvelle voie exploratoire passant par le fractionnement des microbiotes afin d’en étudier séparément les génomes des différentes populations ou groupes de populations, leur somme devant permettre de reconstituer un metagénome complet. Cet objectif requiert le développement d’un outil pour la sélection spécifique de bactéries (sur des critères taxonomiques ou fonctionnels) et leur isolement du reste des microorganismes non ciblés. Les travaux de thèse ont porté sur le développement d’une approche de marquage magnétique des bactéries basée sur l’hybridation moléculaire (hybridation in situ) complétée par celui d’un outil de tri microfluidique. Deux méthodes ont été développées, MISH et HCR, ciblant le gène de l’ARNr 23S, chacune reposant sur la formation, lors du processus d’hybridation, d’une structure secondaire en arborescence (MISH) ou ordonnée (HCR) permettant le greffage de nanoparticules magnétiques. Les résultats obtenus illustrent le potentiel des deux approches d’abord pour le marquage spécifique de bactéries cibles (E.coli et Pseudomonas putida) en conditions de culture au laboratoire puis dans un second temps dans des échantillons de sol. Le tri microfluidique a également été optimisé par le développement d’un nouveau dispositif de tri magnétique permettant la séparation des cellules marquées sous flux continu faisant appel à l’injection d’un polymère composite magnétique pour intégrer au fond du microcanal une série de bandes parallèles magnétiques. La fonctionnalité du dispositif a été démontrée, sa simplicité de fabrication en faisant un outil de choix pour une application en routine dans les laboratoires d’écologie microbienne. En dépit de résultats prometteurs toute cette nouvelle approche d’étude de la diversité bactérienne environnementale nécessite encore de nombreuses étapes d’optimisation. / Bacteria, the most abundant organisms on our planet, have a fundamental role in ecosystem functioning. Despite their importance, the characterization of bacterial communities is today still incomplete. This is due to the impossibility of completely decomposing taxonomically and functionally the microbial communities of these ecosystems and as a consequence to apprehend the whole bacterial diversity, either by cultural approaches (with only 1% of culturable bacteria) or by metagenomic, a limited approaches cause by biases in extraction, sequencing and analysis. The work undertaken in this thesis aims to develop a new exploratory pathway through the fractionation of microbiota in order to study separately genomes of different populations or groups of populations. Their sum should enable reconstitution of complete metagenome. This objective requires the development of a tool for the specific selection of bacteria (on taxonomic or functional criteria) and their isolation from the rest of the non-target microorganisms. The thesis work focused on the development of a magnetic labeling approach for bacteria based on molecular hybridization (in situ hybridization) complete by development of a microfluidic cell-sorting tool. Two methods have been developed, MISH and HCR, targeting the 23S rRNA gene, each based on the formation, during the hybridization process, of a secondary random structure (MISH) or organized structure (HCR) enabling binding to magnetic nanoparticles. Results obtained illustrate the potential of the two approaches initially for the specific labeling of target bacteria (E.coli and Pseudomonas putida) under laboratory conditions and then in soil samples. The microfluidic sorting was also optimized by the development of a novel magnetic cell-sorting device allowing the separation of the labeled cells under continuous flow using the injection of a magnetic composite polymer to integrate a series of magnetic parallel strips at the bottom of the microchannel. The proper functioning of the sorting device has been demonstrated, its simple production making it a tool of choice for a routine application in laboratories of microbial ecology. Despite promising results all this new approach for studying environmental bacterial diversity is still requiring many optimization steps.
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PIEGEAGE ET MANIPULATION D'OBJETS BIOLOGIQUES PAR GUIDES D'ONDES OPTIQUESColas, Guillaume 25 October 2006 (has links) (PDF)
Le piégeage et la manipulation d'objets à la surface d'un guide d'onde est une approche intéressante, qui permet d'envisager des développements nouveaux dans le domaine des microsystèmes intégrés. Mais la mise au point de tels dispositifs, était jusqu'à maintenant limitée par la difficulté à comprendre et à maîtriser les phénomènes physiques mis en jeu dans une expérience. Ces points-clé empêchaient la démonstration de la manipulation d'objets biologiques, comme des cellules, sur ces structures. L'utilisation de guides d'ondes optiques représentatifs de technologies de fabrication différentes nous a ainsi permis de juger expérimentalement des forces et des faiblesses propres à chaque technologie et déterminer les conditions les plus favorables en vue d'un déplacement de matériel biologique. L'utilisation de guides en nitrure de silicium a permis une amélioration significative des performances de piégeage et de manipulation de particules sur ces structures.<br />Ceci nous a ainsi permis de réaliser un démonstrateur de propulsion optique et a rendu possible l'application de cette technologie à des objets de masse ou de taille supérieures ainsi qu'à d'autres domaines scientifiques, comme la chimie ou la biologie. Nous avons effectué la première démonstration expérimentale à notre connaissance de la propulsion d'objets biologiques par ondes évanescentes. En particulier, nous avons réalisé des expériences de tri cellulaire de sous-populations dans un mélange. Ceci démontre la capacité à réaliser, sur une faible surface, des expériences biologiques simples grâce à de tels dispositifs et renforce l'espoir d'utiliser une telle technique dans une approche de type laboratoire-sur-puce.
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Chromatographie cellulaire d'affinité : étude expérimentale des mécanismes de capture spécifique et implications pour un développement industriel / Cell affinity chromatography : experimental study of specific capture mechanisms and implications for industrial developmentBrouchon, Julie 11 September 2015 (has links)
Cette thèse a pour objectif le développement d'une technologie de tri cellulaire reposant sur le principe de la chromatographie d'affinité, pour des applications médicales. Pour cela les mécanismes gouvernant la capture spécifique des cellules dans une colonne chromatographique ont été étudiés. Dans un premier temps une étude sur un système modèle met en évidence le rôle prépondérant de l'étape de transport permettant la rencontre entre les cellules et la surface de capture. Le transport est principalement assuré par la sédimentation des cellules. Cela implique que la vitesse d'écoulement dans la colonne est un paramètre déterminant pour optimiser cette étape de rencontre. La capture de cellules est ensuite étudiée dans son ensemble : la rencontre et la formation du lien spécifique. Selon la vitesse d'écoulement deux régimes se distinguent. Pour des vitesses inférieures à 10-3 m.s-1 la cinétique de capture est gouvernée par la cinétique de rencontre. Pour des vitesses plus élevées toutes les rencontres n'aboutissent pas à une capture spécifique. La cinétique de capture est alors limitée par le transport et par la formation du lien. Cette étude expérimentale permet de dimensionner la technique de tri par chromatographie selon les besoins de l'application considérée. En particulier le tri à grande échelle (jusqu'à 1012 cellules) par chromatographie d'affinité est envisageable en ce qui concerne la durée de séparation et les dimensions de la colonne. / Development of cell sorting system based on affinity chromatography for medical application is the goal of this thesis. We study mechanisms responsible for specific cell capture in chromatographic column. First an experimental study on system model emphasize the importance of the transport step, which allows the encounter between cells and surface of capture. Cell sedimentation in the main way of transport. That means flow velocity is a key parameter to optimize this transport step. Then the whole cell capture is studied : encounter and specific link formation. Depending on the flow velocity, there are two regimens. Until a velocity of 10-3 m.s-1, kinetics of capture is governed by encounter kinetics. For higher velocity, only fraction of encounters leads to cell capture. The capture kinetics depends not only on transport, but also on kinetics of formation of specific link. This experimental study allows us to design cell affinity chromatography depending on the need of each application. Especially, cell sorting at industrial scale is conceivable concerning the separation duration and column dimensions.
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Attraction des cellules sur micro-aimants : applications au suivi de l'endocytose et au tri cellulaire .Osman, Osman 25 April 2014 (has links)
De nos jours, la manipulation d’objets à l’aide du champ magnétique se trouve au cœur de nombreuses innovations en nanotechnologies. D’autre part, et du fait de sa capacité d’actionner à très petite échelle, l’utilisation du champ magnétique en biologie et en médecine est en plein essor. En outre, les grandes avancées en matière de fabrication de micro-sources magnétiques ont permis la synthèse d’aimants de tailles micrométriques intégrables dans des microsystèmes microfluidiques comme les laboratoires sur puce, très à la mode à l’heure actuelle. Bien que la séparation de cellules marquées magnétiquement, à l’aide d’un macro-aimant permanent ou d’électroaimant est une tâche aujourd’hui bien maitrisée, le gradient de champ généré par ces sources magnétiques reste insuffisant pour l’isolement de cellules marquées avec une très faible quantité de nanoparticules magnétiques. La réduction de la taille des aimants, évoquée dans cette thèse, constitue une alternative prometteuse, permettant la génération d’énormes gradients de champ magnétique à l’échelle micrométrique. L’objectif de ce travail est donc d’étudier l’attraction de cellules faiblement marquées magnétiquement, sur des réseaux de micro-aimants permanents micro-structurés, dans le but de concevoir un dispositif microfluidique original intégrant des micro-sources magnétiques permanentes, autonomes et passives. / Nowadays, the magnetic field applications at the microscopic scale have been described by an increasing attention as magnetic sources. Moreover, they can be integrated directly in the microchip. Nevertheless, the process of manipulating magnetic micro objects remains a challenge since the generation of magnetic fields and field gradients is strong enough. Previous research has reported the use of microelectromagnets to create magnetic field gradients in order to manipulate biological objects. However, the use of permanent magnetic microstructures permits to avoid Joule heating issues inherent to the electromagnets. In addition, no energy source is required. The aim of this thesis is to study the influence of physico-chemical characteristics of iron oxide nanoparticles on the rate of endocytosis, using an array of micro-magnets. Most probably, the applications of this reserach can be directly related to the gene therapy and can occur in most basic genetic studies. Another part of this work consists of combining microfluidic and magnetic forces in order to develop a cell sorting micro-systems that can be integrated in lab-on-chip or MEMS.
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Conception et modélisation pour le contrôle de trajectoire dans les puces microfluidiques : Application au tri cellulaire par diélectrophorèse / Design and modeling for trajectory control in microfluidic chips : Application to cell sorting by dielectrophoresisGauthier, Vladimir 18 December 2018 (has links)
Cette thèse propose d'intégrer les principes de la micro-robotique dans un laboratoire sur puce afin d'améliorer les performances du tri cellulaire par diélectrophorèse. Contrôler la trajectoire des cellules dans une puce fluidique en temps réel nécessite de reconcevoir la puce, la modéliser et développer des lois de commande dédiées au contrôle en temps réel. Concernant la conception, cette thèse s’intéresse au compromis existant entre la vitesse de tri et les problématiques de suivi des cellules en temps réel. Une architecture originale basée sur deux plans d’électrodes, sur les faces supérieures et inférieures des canaux, est proposée. Des procédés de fabrication dédiés à cette architecture sont développés. En particulier, la fabrication d'électrodes transparentes et l'assemblage des deux réseaux d'électrodes parallèles sont étudiés. Concernant la modélisation, une formulation analytique du champ électrique découplant variables de commande, termes dépendant de la position de l’objet et termes dépendant uniquement de la géométrie de la puce est proposée afin de calculer rapidement et précisément la force de diélectrophorèse. Une analyse de l'anisotropie des forces de frottement présentes à proximité des électrodes vient compléter la modélisation dynamique du comportement des microparticules, et donne lieu à un modèle compatible avec la commande temps réel, validé expérimentalement sur des objets artificiels. Enfin, un contrôleur basé sur des techniques d’optimisation ainsi qu’un planificateur de trajectoires sont proposés pour le tri de cellules. Un simulateur est développé et met en avant les bonnes performances de tri d’un tel système. L’ensemble de ces méthodes permettront de contrôler la trajectoire de cellules biologiques dans des puces de tri afin d’en améliorer la sélectivité et la rapidité. / This thesis proposes to integrate the principles of micro-robotics in a lab-on-a-chip in order to improve the performance of cell sorting by dielectrophoresis. Controlling the trajectory of cells in a fluidic chip in real time requires redesigning the chip, modeling it and developing control laws dedicated to real-time control. Concerning the design, this thesis is interested in the compromise existing between the speed of sorting and the problems of cell tracking in real time. An original architecture based on two electrode planes, on the upper and lower faces of the channels, is proposed. Manufacturing processes dedicated to this architecture are developed. In particular, the manufacture of transparent electrodes and the assembly of the two parallel electrode arrays are studied. Concerning the modeling, an analytical formulation of the electric field uncoupling control variables, terms depending on the position of the object and terms depending solely on the geometry of the chip is proposed in order to quickly and accurately calculate the dielectrophoresis force. An analysis of the anisotropy of the friction forces present near the electrodes completes the dynamic modeling of the behavior of the microparticles, and gives rise to a model compatible with real-time control, validated experimentally on artificial objects. Finally, a controller based on optimization techniques and a trajectory planner are proposed for cell sorting. A simulator is developed and highlights the good sorting performance of such a system. All of these methods will control the trajectory of biological cells in sorting chips to improve selectivity and speed.
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STRATEGIES D'OMOGENEISATION DES POPULATIONS DE PROGENITEURS NERVEUX FOETAUX HUMAINS DANS UNE PERSPECTIVE DE THERAPIE CELLULAIRE DU SYSTEME NERVEUX CENTRALSerre, Angéline 28 June 2007 (has links) (PDF)
Dans une perspective de médecine régénératrice, les cellules souches nerveuses et progénitrices fœtales humaines constituent indéniablement un des outils les plus adaptés au traitement des lésions du SNC et des maladies neurodégénératives. Jusqu'à présent, leur utilisation en thérapie cellulaire a eu recours à des populations hétérogènes composées à la fois de cellules immatures, de cellules en voie de différenciation et de cellules pleinement différenciées. Or des études récentes ont révélé l'intérêt de disposer de populations enrichies en un type cellulaire donné afin d'améliorer l'efficacité des greffes. Pour homogénéiser les populations et mieux cibler les pathologies, nous avons donc mis en œuvre deux stratégies. La première consiste à surexprimer, dans les cellules en culture, les gènes proneuraux à motif bHLH Ngn1, Ngn2, Ngn3 et Mash1 au travers de vecteurs lentiviraux dits « de différenciation ». Cette surexpression a permis d'orienter la différenciation des cellules majoritairement vers le lignage neuronal et également de spécifier des sous-types neuronaux. La seconde méthode utilise des vecteurs lentiviraux traceurs pour exprimer une protéine rapportrice sous le contrôle de promoteurs spécifiques des différents lignages du SNC en vue de leur sélection par tri cellulaire. Nous avons ainsi utilisé le promoteur Nestine pour les cellules immatures, le promoteur Synapsine pour les cellules neuronales et le promoteur GFAP pour les cellules astrocytaires. Si les promoteurs Synapsine et GFAP ont révélé une spécificité contestable, le promoteur Nestine, quant à lui, a permis de sélectionner une population enrichie à 81% en cellules nestine+. Ce travail s'inscrit dans un projet de plus grande envergure, qui a pour but d'évaluer les bénéfices de greffes de ces populations homogénéisées.
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Microfluidique 3D et actionneurs magnétiques : de leur intégration à la préparation d'échantillons biologiques / 3D microfluidics and magnetic actuators : from their integration to the preparation of biological samplesFouet, Marc 20 April 2016 (has links)
Les puces microfluidiques sont des éléments clés pour la manipulation et l'analyse de solutions et d'échantillons biologiques. Elles facilitent les études aux échelles microscopiques et sont le fondement du concept de laboratoire sur puce, à la pointe des diagnostics médicaux. L'objectif de ces travaux de thèse a été d'explorer les possibilités fonctionnelles offertes par les architectures microfluidiques 3D, dans le cadre du développement d'outils diagnostiques reposant sur le tri, le marquage et la manipulation de cellules. Ces fonctions ont été validées sur des sous-populations de monocytes, qui sont des marqueurs de maladies inflammatoires. Afin de couvrir une chaîne cohérente d'étapes nécessaires au prétraitement des échantillons biologiques complexes, trois fonctions complémentaires ont été étudiées : le tri par taille par filtration hydrodynamique, le tri immunologique par séparation magnétique et le marquage sur puce par microparticules magnétiques. En vue d'effectuer des réactions de marquage (sondes fluorescentes ou microbilles magnétiques), un micro-mélangeur reposant sur la séparation et recombinaison de flux (transformation du boulanger) a été fabriqué et caractérisé. Des expériences de test des dispositifs pour les mélanges fluorescéine/eau et cellules/microbilles sont proposées, ainsi que les modèles analytiques et numériques associés. De nouvelles approches de tri par taille par filtration hydrodynamique ont été étudiées, en réalisant des structures 3D en "bypass", qui rendent possible une stratégie de mélange adaptée aux cellules et particules. Un modèle analytique des écoulements et de l'efficacité de tri et de mélange est proposé, ainsi qu'une caractérisation des dispositifs. Il a été de plus démontré que cette approche permettait également de réaliser la séparation d'espèces sub-micrométriques comme les microparticules sanguines. Tous les systèmes microfluidiques 3D ont été obtenus par une technique originale d'empilement (laminage) de films secs photosensibles, réduisant nettement le temps de micro-fabrication et compatibles avec les procédés standards. Cette technique de fabrication permet également l'intégration de micro-sources magnétiques dans les laboratoires sur puce par la réalisation de micro-bobines planaires sous des canaux microfluidiques. En couplant les effets des micro-bobines intégrées aux champs générés par des aimants extérieurs, nous apportons la preuve de concept de systèmes pour la séparation, la déviation et le piégeage de microbilles magnétiques. Les modèles (champs et force magnétiques) et la caractérisation des dispositifs seront présentés. Nous aborderons également la réalisation d'instrumentation spécifique (source de courant) pour l'actionnement des bobines, permettant le contrôle (temporel et en intensité) des champs magnétiques appliqués. / Microfluidic chips are key elements for solutions and biological samples handling and analysis. They are enablers for micro-scale studies and are the cornerstone of lab on chips, at the cutting edge of medical diagnostics. The aim of this thesis work was to explore functional possibilities offered by 3D microfluidic architectures for the development of diagnostic tools relying on cell sorting, tagging and handling. These functions were investigated on monocytes sub-populations, which are markers for many inflammatory diseases. In order to cover a consistent series of necessary steps for complex biological samples pretreatment, three additional functions were studied: size sorting with hydrodynamic filtration, immuno-isolation by magnetic separation, and on-chip tagging with magnetic microparticles. To perform tagging reactions, a micromixer based on diffusion and flow split and recombination (baker's transform) was fabricated and characterized. Analytical (diffusion) and numerical (diffusion-advection) models are showed, together with test experiments on the devices for mixing reactions of fluorescein/water and cells/microbeads. New approaches of hydrodynamic filtration based size sorting were investigated by devising 3D bypass structures, that allow developing a mixing strategy (tagging reactions) suited to cells and particles. An analytical model for flows and sorting efficiency is introduced and compared to the devices characterization. Furthermore, it was shown that this approach also enables sorting of sub-micron particles (like blood microparticles). All 3D microfluidic systems were obtained thanks to an original dry film photoresist stacking (lamination) technique, dramatically reducing micro-fabrication time, even though compatible with standard process. This fabrication technique also enables magnetic micro-sources integration in lab on chips by realizing planar micro-coils underneath microfluidic channels. By coupling the effects of integrated micro-coils to the fields generated by external magnets, we brought the proof of concept of systems dedicated to trapping, focusing and separating (in flow) magnetic microbeads. Models (magnetic fields and forces) are described along with devices characterization. Conception of specific instrumentation (current source) for micro-coils actuation is also shown, as it allows time and intensity control over applied magnetic fields.
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Développement de biopuces dédiées au tri d'échantillons cellulaires / Development of biochips for blood cell sortingBombera, Radoslaw 05 December 2011 (has links)
Le présent travail de thèse repose sur la conception d'un système miniaturisé de type biopuce capable d'assurer la capture et le relargage contrôlé de différentes populations des cellules sanguines (e.g. lymphocytes). Ce projet a pour objectif la construction d'un outil potentiel de recherche dans le domaine de l'immunologie ainsi que du diagnostic qui permettrait non seulement de réaliser des essais à partir d'une faible quantité d'échantillon, mais aussi de réduire le temps d'analyse. L'approche consiste plus précisément en la fabrication d'une matrice d'oligonucléotides et l'immobilisation de cellules via une molécule hybride composée d'un anticorps IgG couplé à une séquence d'oligonucléotide complémentaire. La synthèse du produit conjugué est mise en place et conduit à l'assemblage functionnel sur biopuce. Une fois les cellules spécifiquement capturées sur la surface, deux voies de rélargage contrôlé sont explorées. Ainsi, les lymphocytes sont libérées de façon contrôlée et séquentielle par clivage enzymatique d'ADN ou alors par désorption physique possible grâce au chauffage localisé. La détection se fait en temps réel par l'imagerie de la résonance plasmonique de surface (Surface Plasmon Resonance Imaging, SPRi) qui présente l'avantage de pouvoir suivre les phénomènes biomoléculaires en absence de marquage et d'apporter une réponse simultanée d'un échantillon biologique sur un grand nombre des sondes. Accessoirement, une approche instrumentale particulière nous permet d'observer les étapes de capture/relargage par microscopie optique classique. La construction de la biopuce permet également l'élargissement à plusieurs cibles et ouvre ainsi la voie à de nombreuses possibilités d'exploration en termes d'application pour l'analyse d'échantillons biologiques plus complexes tels que du sang. / This PhD thesis is devoted to conception of a miniaturized system of biochip type able to realize a controlled capture and release of different populations of the blood cells (e.g. lymphocytes). The main objective of the project is to create a potential tool of research, especially in the field of immunology, and medical diagnostics as well, that could perform short-time analyses by using a small sample amount. The approach relies more precisely on fabrication of a DNA matrix and further immobilization of cells through a hybrid molecule composed of an IgG antibody covalently coupled with short oligonucleotide sequence. Synthesis of the conjugated product is developed and demonstrates functional assembly on the micro-platform. Lymphocytes are specifically addressed onto biochip surface and once they are captured, two independent strategies of selective release are proposed. Therefore, immobilized cells are specifically detached either upon enzymatic cleavage of oligonucleotide substrate or physically desorbed by local heating and denaturation of double stranded DNA. The system makes use of Surface Plasmon Resonance Imaging (SPRi) to enable real time detection of different biomolecular phenomena in a label-free and high-throughput manner. Accessorily, a particular instrumental approach is developed in order to observe cell capture-release steps directly under optical microscopy. The biochip construction permits to extend its performance to many targets and may be further explored in terms of application to analysis of complex biological samples such as blood.
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Colloïdes magnétiques: auto-organisation et applications biologiquesGoubault, Cécile 23 March 2004 (has links) (PDF)
Ce manuscrit pr´esente l'´etude de latex magn´etiques auto-organis´es. Dans un premier temps, l'obtention de filaments magn´etiques, compos´es d'assemblages lin´eaires et permanents de particules magn´etiques, est pr´esent´ee. Ces objets nouveaux introduisent une m´ethode originale pour sonder la flexibilit´e `a l'´echelle mol´eculaire. Sous champ, ils adoptent une configuration m´etastable : ils se plient en forme d'´epingle`a cheveux. A partir de la mesure macroscopique de leur rayon de courbure, corr´el´ee `a la mesure par diusion de la lumi`ere de la longueur du lien, la rigidit´e de flexion de ce dernier peut ˆetre d´eduite. La mod´elisation de ce ph´enom`ene est aussi d´ecrite. Enfin, l'organisation de ces filaments, dans des microcanaux, constitue une nouvelle matrice de s´eparation que l'on a cherch´e `a appliquer, ici, au tri cellulaire. L'obtention d'un r´eseau de pas contrˆol´e, l'accrochage des filaments `a la paroi, leur d´ecoration par des anticorps sp´ecifiques sont d´etaill´es. Enfin la possibilit´e de proc´eder `a une chromatographie des cellules est introduite. Ces nouveaux objets ouvrent un champ d'applications dans le domaine des laboratoires sur puce.
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Développement de biopuces dédiées au tri d'échantillons cellulairesBombera, Radoslaw 05 December 2011 (has links) (PDF)
Le présent travail de thèse repose sur la conception d'un système miniaturisé de type biopuce capable d'assurer la capture et le relargage contrôlé de différentes populations des cellules sanguines (e.g. lymphocytes). Ce projet a pour objectif la construction d'un outil potentiel de recherche dans le domaine de l'immunologie ainsi que du diagnostic qui permettrait non seulement de réaliser des essais à partir d'une faible quantité d'échantillon, mais aussi de réduire le temps d'analyse. L'approche consiste plus précisément en la fabrication d'une matrice d'oligonucléotides et l'immobilisation de cellules via une molécule hybride composée d'un anticorps IgG couplé à une séquence d'oligonucléotide complémentaire. La synthèse du produit conjugué est mise en place et conduit à l'assemblage functionnel sur biopuce. Une fois les cellules spécifiquement capturées sur la surface, deux voies de rélargage contrôlé sont explorées. Ainsi, les lymphocytes sont libérées de façon contrôlée et séquentielle par clivage enzymatique d'ADN ou alors par désorption physique possible grâce au chauffage localisé. La détection se fait en temps réel par l'imagerie de la résonance plasmonique de surface (Surface Plasmon Resonance Imaging, SPRi) qui présente l'avantage de pouvoir suivre les phénomènes biomoléculaires en absence de marquage et d'apporter une réponse simultanée d'un échantillon biologique sur un grand nombre des sondes. Accessoirement, une approche instrumentale particulière nous permet d'observer les étapes de capture/relargage par microscopie optique classique. La construction de la biopuce permet également l'élargissement à plusieurs cibles et ouvre ainsi la voie à de nombreuses possibilités d'exploration en termes d'application pour l'analyse d'échantillons biologiques plus complexes tels que du sang.
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