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Regulação da expressão gênica no patógeno humano Trichophyton rubrum em resposta ao pH ambiente, a variações nutricionais e na interação dermatófito-hospedeiro / Regulation of gene expression in human pathogen Trichophyton rubrum in response to ambient pH, the variations in nutritional and dermatophyte-host interactionSantos, Rodrigo da Silva 09 December 2013 (has links)
O patógeno Trichophyton rubrum é um fungo queratinofílico e o principal agente de micoses cutâneas humanas. O processo de degradação de substratos queratinizados por dermatófitos está relacionado com a alcalinização do ambiente, o que modula a expressão e a secreção de enzimas responsáveis pela captação e utilização dos nutrientes presentes no microambiente hospedeiro. Essa modulação do pH parece determinante para o sucesso do processo infeccioso, quando o fungo se depara com o pH ácido da pele humana. A hipótese deste trabalho foi verificar se há influência do pH e da fonte nutricional na modulação da expressão de genes de T. rubrum que codificam proteínas envolvidas nos processos de autofagia (atg8 e atg15), adesão celular (sowgp) e de alguns fatores de transcrição (pacC, bZIP/cys-3 e nuc-1), e se estes processos estão relacionados à patogenicidade deste dermatófito. De modo a avaliar a modulação da expressão destes genes na patogenicidade e sobrevivência fúngica, T. rubrum foi cultivado em meios de cultura tamponados (pH 5,0 e pH 8,0) e não tamponados, contendo glicose, glicina, glicose com glicina, ou queratina como fonte nutricional. Os genes envolvidos no processo de autofagia também foram avaliados na presença do inibidor de autofagia 3-metiladenina (3-MA). Além disso, o perfil transcricional destes genes de T. rubrum foi avaliado durante a interação ex vivo com unha e pele humana. As análises demonstraram a influência concomitante da fonte nutricional e do pH ambiente na modulação da expressão dos transcritos gênicos estudados nas diferentes linhagens de T. rubrum utilizadas neste trabalho (CBS, H6 e pacC-1). Nossos resultados revelaram que o crescimento destas linhagens é maior na fonte nutricional queratina, quando comparado com as outras fontes nutricionais (glicose e glicina), havendo uma diferença na taxa de crescimento entre as linhagens neste substrato preferencial. Os genes bZIP/cys-3 e nuc-1 apresentaram perfil de expressão semelhante, mais elevada durante cultivos longos, respondendo a condições de estresse nutricional e pH alcalino, sugerindo a participação dos mesmos nos processos de crescimento e sobrevivência do fungo. Além disso, mecanismos regulatórios diferentes destes genes devem ocorrer nas três linhagens de T. rubrum em relação ao crescimento na fonte nutricional queratina. A variação transcricional do gene pacC em resposta às diferentes fontes nutricionais sugere que sua expressão depende das condições nutricionais encontradas por esse fungo, sendo o pH uma resposta secundária. Nossos resultados sugerem ainda que a via de autofagia seja importante para o desenvolvimento e sobrevivência de T. rubrum nestes substratos, e que o FT PacC atue regulando um dos pontos deste processo, visto que o gene atg15 apresenta um perfil semelhante de expressão ao gene pacC, e o gene atg8 tem perfil antagônico de expressão nas linhagens H6 e pacC-1, nas condições avaliadas neste trabalho. 3-MA inibiu a transcrição dos genes atg8 e atg15 em T. rubrum de modo especifico, e por consequência a via de macroautofagia. Os dados de expressão de sowgp sugerem que essa molécula atue durante a privação nutricional e situações de estresse pelo dermatófito, provavelmente desempenhando seu papel na progressão e manutenção do processo infeccioso, permitindo a permanência do fungo em tecidos queratinizados, e auxiliando na fixação do fungo ao epitélio humano. Desta maneira, nossos resultados fornecem informações sobre os eventos moleculares envolvidos na regulação da expressão genica durante a adaptação de T. rubrum ao pH, à variação nutricional, e interação com células e moléculas do microambiente hospedeiro. Os resultados revelam o envolvimento do processo de autofagia e de moléculas de adesão no sensoriamento e resposta a variações ambientais, e a modulação dos fatores de transcrição bZIP/Cys-3, Nuc-1 e PacC durante a adaptação de T. rubrum ao pH e à fonte nutricional podem ser importantes na regulação de moléculas necessárias para sua patogenicidade. / The pathogen Trichophyton rubrum is a keratinophylic fungi and the major agent of cutaneous mycosis in humans. The process of degradation of keratinized substrates by dermatophytes is related with environment alkalinization, which modulates the expression and secretion of the enzymes responsible for the acquisition and utilization of nutrients from the host microenvironment. This pH modulation seems to be determinant for the success of the infectious process when the fungus encounters the acidic pH of the human skin. The hypothesis of this study was to determine whether there is influence of ambient pH and nutritional source in the modulation of gene expression of T. rubrum genes coding for proteins involved in the processes of autophagy (atg8 and atg15), cellular adhesion (sowgp) and some transcription factors (pacC, bZIP/cys-3 and nuc-1), and if they are related with the pathogenicity of this dermatophyte. To evaluate the modulation of the expression of these genes in fungal pathogenicity and survival, T. rubrum was cultivated in buffered (pH 5.0 and pH8.0) or non-buffered media, containing glucose, glycine, glucose and glycine, or keratin as nutrient source. The autophagy-related genes were also analyzed in the presence of 3- methyladenine (3-MA) autophagy inhibitor. Moreover, the transcriptional profile of these genes was evaluated during T. rubrum ex vivo interaction with human nail and skin. The analyses demonstrate the simultaneous influence of the nutritional source and environment pH in the modulation of gene transcription in the different T. rubrum strains evaluated here (CBS, H6 and pacC-1). Our results revealed that growth of these strains is higher in keratin source, compared with other nutrient sources (glucose or glycine), and that they present different growth rates in this preferential substrate. The genes bZIP/cys-3 and nuc-1 presented a similar expression profile, which is higher during longer periods of growth, responding to nutritional stress and alkaline pH, suggesting their involvement in fungal growth and survival. Also, different regulatory mechanisms of these genes in these three T. rubrum strains might be implicated during keratin degradation. The transcriptional variation in the pacC gene in response to different nutritional sources, suggests that its expression is dependent on the nutritional conditions, being the ambient pH a secondary response. Furthermore, our results indicate that the autophagy pathway is important for T. rubrum survival and development during nutrient and pH adaptation, and that PacC might regulates some points of this process, since atg15 and pacC genes presented a similar expression profile, and atg8 has antagonistic expression profiles in the H6 and pacC-1 strains, in the conditions evaluated here. 3-MA inhibited the transcription of atg8 and atg15 T. rubrum genes in a specific manner, and thus inhibited the macroautophagy process. The expression profile of the sowgp gene suggests that this molecule is important during nutrient starvation and stress situation, probably having a role in the progression and maintenance of the infectious process, allowing fungal maintenance in the host keratinized tissues, contributing to fungal adherence to human epithelia. Taken together, our results provide insights into the molecular events involved in the regulation of gene expression during T. rubrum adaptation to pH, nutritional variation and interaction with the host cells and molecules. Our data reveals the involvement of the autophagy process and adhesion molecules in sensing and response of environmental changes, and the modulation of the bZIP/Cys-3, Nuc-1 and PacC transcription factors during T. rubrum adaptation to pH and nutrient source might be important in the regulation of molecules required for its pathogenicity.
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Análise da expressão gênica no dermatófito Trichophyton rubrum mimetizando a infecção in vitro: pH e diferentes fontes de carbono regulando genes / Analysis of gene expression in the dermatophyte Trichophyton rubrum during the mimetic infection in vitro: pH and carboun sources are regulating genesMaranhão, Fernanda Cristina de Albuquerque 12 December 2008 (has links)
Dermatófitos são fungos filamentosos com a habilidade de invadir substratos queratinizados e causar dermatofitoses em humanos e animais, penetrando profundamente apenas em hospedeiros imunocomprometidos. Trichophyton rubrum é um fungo antropofílico e cosmopolita, o mais comum agente de micoses superficiais, que usa componentes celulares como proteínas e lipídeos após uma específica regulação de sua expressão gênica governada pelo pH ambiente e sensoriamento celular. A virulência de T. rubrum é relacionada com a secreção de enzimas proteolíticas, um importante fator determinante na invasão, utilização e subseqüente disseminação através do estrato córneo. O objetivo desse estudo foi identificar através de Hibridização Subtrativa Supressiva (SSH) genes de T. rubrum preferencialmente expressos durante o crescimento na presença de queratina e lipídeos, quando T. rubrum degrada fontes de carbono tipicamente encontradas em células epidérmicas. Inicialmente, nós avaliamos as mudanças no pH extracelular durante seu crescimento em queratina e lipídeo (depois de 6, 12, 24, 48, 72 h e 7 dias) em pH inicial 5,0, onde foi observado um gradual aumento do pH basal sob ambas as condições de teste, comparado com a condição glicose (controle). Também identificamos 576 transcritos de T. rubrum diferencialmente expressos por SSH usando conídios cultivados por 72 h em queratina como teste e em glicose como controle. Os genes de T. rubrum ativados codificam proteínas putativas que foram validadas por cDNA dot-blot e northern blot, mostrando similaridade com proteínas fúngicas envolvidas no metabolismo básico, crescimento e virulência, p. ex., transportadores ABC-MDR, MFS e ATPase de cobre, permease, NIMA interactive protein, poliproteína Gag-Pol, fatores de virulência subtilisinas serino-proteases (Sub 3 e 5) e metaloproteases (Mep 3 e 4) e Hsp30. Adicionalmente, entre os 762 clones obtidos na biblioteca da condição lipídeo (72 h), 80 transcritos superexpressos foram confirmados por cDNA dot-blot, revelando 14 unigenes similares à proteínas de vários organismos patogênicos, como glicoproteína 43 kD, transportador MDR, proteína G, quitina sintase e serino/treonina fosfatase. Transcritos do gene TruMDR2, codificador de um transportador ABC, foi isolado tanto na presença de queratina quanto em lipídeo, e a análise da linhagem mutante TruMDR2 de T. rubrum mostrou uma redução na atividade infectante, caracterizada pelo baixo crescimento em unhas humanas comparada com o tipo selvagem. A alta expressão de transportadores por T. rubrum em condições que mimetizam a infecção e a redução na virulência de TruMDR2 durante o modelo in vitro sugerem que transportadores estão envolvidos na patogenicidade de T. rubrum. Outro linhagem mutante (pacC-1) com um nocaute no gene pacC que codifica um fator de transcrição regulado pelo pH local, mostrou a expressão de proteases (Sub 3 e 5 e Mep 4) diminuída após o crescimento em queratina em comparação com o tipo selvagem em análises de northern blots. Essas proteases tem uma atividade ótima em pH alcalino, e nossos resultados indicam uma regulação defectiva do gene pacC de T. rubrum na ativação de proteases. Em conclusão, através do uso de SSH foi possível identificar genes de T. rubrum ativados após tratamentos específicos, o que sugere a importância dos mesmos na interação dermatófito-hospedeiro, instalação e manutenção da doença. Esses resultados disponibilizam novos dados sobre T. rubrum que levarão a um melhor entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos no crescimento, metabolismo geral e patogenicidade, e também auxiliar na identificação de novos e efetivos alvos de drogas para dermatófitos. / Dermatophytes are a group of fungi filamentous that have the ability to invade keratinized substrates, causing dermatophytosis in humans and animals and only penetrate deeper if the host is immunocompromised. Trichophyton rubrum is an anthropophilic and cosmopolitan fungi, the most common agent of superficial mycoses, which uses cell components such as proteins and lipids after a specific regulation of its gene expression governed by pH environment and sensing cell. The virulence T. rubrum is related to secretion of proteolytic enzymes, an important factor determinant in the invasion, utilization and subsequently dissemination through the stratum corneum. The aim of this study was to indentify by Suppression Subtractive Hybridization (SSH) T. rubrum genes preferentially expressed during growth in the presence of keratin and lipids, upregulated when this fungus degrades carbon source typically found at epidemic cells. Initially, this work evaluated the changes in the extracellular pH during its growth in keratin and lipid (after 6, 12, 24, 48, 72 h and 7 days) at initial pH 5.0, where we observed a gradual increase of basal pH under both tests when compared to glucose condition (control). Also, we identified 576 T. rubrum transcripts differentially expressed by SSH using conidia cultivated for 72 h in keratin as tester, and in glucose as driver. The T. rubrum genes upregulated encode putative proteins that were validated by cDNA dot-blot and northern blot, showing similarity to fungi proteins involved in basic metabolism, growth and virulence, i.e., transporters ABC-MDR, MFS and ATPase of copper, permease, NIMA interactive protein, Gag-Pol polyprotein, virulence factors serine-protease subtilisins (Sub 3 and 5) and metalloproteases (Mep 3 and 4) and Hsp30. Additionally, among the 762 clones obtained in a library of lipid condition (72 h), 80 over-expressed transcripts were confirmed by cDNA dot-blot, revealing 14 unigenes similar to proteins of several pathogenic organisms, like glicoprotein 43 kD, MDR transporters, G protein, chitin synthase and serine/threonine-protein phosphatase. Transcripts of TruMDR2 gene, encoding an ABC transporter in T. rubrum, were isolated in the presence of keratin and lipid, and the examination of TruMDR2 mutant T. rubrum showed a reduction in infecting activity, characterized by low growth in human nails compared to wild-strain. The high expression of transporter by T. rubrum in conditions that mimetize the infection and the virulence reduction of TruMDR2 in an in vitro model suggests that transporters are involved in T. rubrum pathogenicity. Another mutant, pacC-1 with a knockout in PacC gene that encodes a transcription factor regulated by local pH, showed the expression of proteases (Sub 3, Sub 5 and Mep 4) decreased after growth in keratin (72 h) in comparison to wild-strain in northern blot analyzes. These proteases have an optimal activity in alkaline pH, and our results indicate a defective regulation of T. rubrum pacC gene in the activation of proteases. In conclusion, by means of SSH to identify genes upregulated in T. rubrum after specific treatments, their importance in the dermatophyte-host interaction, installation and maintenance in the disease is suggested. These results provide new insights about T. rubrum that will contribute to a better understanding of molecular mechanisms about the growth, metabolism and pathogenicity, and may also aid in the identification of novel effective drug targets for dermathophytes.
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Análise da resposta imunológica celular da via Th17 em pacientes portadores de dermatofitose extensa e/ou persistente causada pelo Trichophyton rubrum / Analysis of the cellular immune response of the Th17 pathway in patients presenting extensive ando r persistente dermatophytosis caused by Trichophyton rubrumGrazielle Barbosa Santana 01 September 2016 (has links)
Em países tropicais como o Brasil, as micoses superficiais (dermatofitoses) são comumente encontradas. O Dermatófito mais comum é o Trichophyton rubrum (Tr). Mananas e galactomananas na parede do Tr podem suprimir a resposta celular ao fungo. Quanto à resposta imune antifúngica, sabe-se a importância da via Th17. Algumas lectinas do tipo C (CLRs) como o receptor de manose e/ou receptores similares a Toll (TLRs) regulam o equilíbrio entre as vias Th1 e Th17. Nossos objetivos foram obter um extrato antigênico de Tr que induza resposta imune celular; quantificar e qualificar a resposta imune de indivíduos controles com lesão branda e de pacientes com dermatofitose extensa e/ou persistente causadas pelo Tr e por fim, avaliar a expressão de CLRs em monócitos do sangue periférico nos mesmos grupos. Para tanto, produzimos 11 extratos antigênicos de Tr. Pudemos observar na eletroforese em gel de poliacrilamida proteínas com pesos moleculares de aproximadamente 70 kDa e 38 kDa para os extratos fúngicos: Extrato TCA - Meta 1, Extrato tindalizado G1 e Extrato Coca 1. Avaliamos a resposta linfoproliferativa de células mononucleares por incorporação de timidina triciada em controles e pacientes ao peptídeo YIIDTGIDID do fungo Tr (Tri R2) e aos extratos antigênicos produzidos em nosso laboratório. Utilizamos como estímulos: PWM, CMA, Tri R2, PMA/Ionomicina. Para os ensaios funcionais avaliamos quatro pacientes e 6 indivíduos controles. Para a fenotipagem das células Th17, Th17MEM, Tc17 e Tc17MEM por citometria de fluxo, utilizamos a análise Booleana no software FlowJo X. A avaliação da expressão dos CLRs: CD206 (Receptor de Manose), Dectin 1 e Dectin 2 em monócitos do sangue periférico de controles e pacientes foi efetuada por citometria de fluxo. Dos 11 extratos produzidos de Tr, 7 se mostraram bons estimuladores para pelo menos um dos controles analisados, expressos como ponto máximo de índice de estimulação (p.m.I.E.). Dentre eles destacamos: Extrato TCA - Meta 1 (p.m. I.E. = 14,49 em 5 ug/mL), Extrato Tindalizado G1 (p.m.I.E. = 23,00 em 2,5 ug/mL) e Extrato Coca 1 (p.m.I.E. = 173,36 em 0,31 ug/mL). Na avaliação da expressão dos receptores das células Th17 e Tc17 (Th17R e Tc17R, respectivamente) após seis dias de estímulo por: Tri R2, extrato Coca 1 e o extrato TCA - Meta 1, o extrato Coca se mostrou o melhor estimulador para as populações Th17, com a frequência de 8,40% (controle) e 12,30% (paciente 1). Na avaliação da expressão de Th17R e Tc17R por 6 horas ao estímulo por PMA/Iono, todos os controles (n=3) se mostraram responsivos e no grupo de pacientes (n=3) pudemos observar maior frequência para o paciente 1 nas populações Th17 (1,64%) e Th17MEM (3,27%), e para as células Tc17 (10,70%) e Tc17MEM (3,58%). Observamos redução da expressão de CLRs nos pacientes: CD206: média 60,24% (controles) e 21,27% (pacientes), Dectin 1: 22,42% (controles) e 12,06% (pacientes) e Dectin 2: 20,26% (controles) e 4,99% (pacientes). Controles (n=6) e pacientes (n=3). A inovação na produção de extrato antigênico Extrato TCA - Meta 1 encoraja o estudo dos extratos fúngicos, para se obter melhores condições de avaliações imunológicas em pacientes com dermatofitose. Caracterizamos e qualificamos a resposta imune celular frente ao peptídeo TriR2 e aos extratos antigênicos, além de avaliarmos a expressão dos CLRs nesse grupo especial de pacientes / In tropical countries like Brazil, superficial fungal infections (dermatophytosis) are commonly found. The most common dermatophyte is Trichophyton rubrum (Tr). Mannans and galactomannans of Tr cell wall can suppress cellular responses to the fungus. Regarding the antifungal immune response, the importance of Th17 pathway is warranted. Some C-type lectins (CLRs) as the mannose receptor and / or Toll-like receptors (TLRs) regulate the balance between Th1 and Th17 pathways. Our objectives were to obtain an antigenic extract of Tr to induce cellular immune response; to quantify and classify the immune response of control subjects with mild injury and patients with extensive and / or persistent dermatophytosis caused by Tr, and finally evaluating the expression of CLRs in peripheral blood monocytes in the same groups. Therefore, we produced 11 antigenic extracts of Tr. Proteins with molecular weights of approximately 70 kDa and 38 kDa were evidenced in polyacrylamide gel electrophoresis for the following fungal extracts: extract TCA - Target 1, Tindalized extract G1 and extract Coca 1. We assessed the lymphoproliferative response of mononuclear cells by tritiated thymidine incorporation in the controls and patients, stimulated by YIIDTGIDID peptide fungus Tr (Tri R2) and the antigenic extracts produced in our laboratory. We used as stimuli: PWM, CMA, Tri R2, and PMA/Iono. For functional assays we evaluated four patients and 6 control individuals. For the phenotyping of Th17 cells, Th17MEM, Tc17 and Tc17MEM by flow cytometry, we used a Boolean analysis performed by FlowJo X software. Evaluation of the expression of CLRs: CD206 (mannose receptor), Dectin 1 and Dectin 2 in peripheral blood monocytes from patients and controls was performed by flow cytometry. Of the 11 extracts produced from Tr, seven proved to be able to stimulate proliferation of peripheral blood mononuclear cells of at least one of the analyzed controls, expressed as peak stimulation index (p.m.I.E.). Among them, were included: extract TCA - Target 1 (pmIE = 14.49 at 5 ug /mL), Tindalized G1 Extract (pmIE = 23,00 at 2.5 ug /mL) and extract Coca 1 (pmIE = 173.36 at 0.31 ug /mL). In the evaluation of the expression of receptors of Th17 cells and Tc17 (Th17R and Tc17R, respectively) after six days of stimulation by: Tri R2, Coca extract and the extract TCA 1 - Meta 1, Coca extract showed to be the best stimulator for Th17 populations, with the frequency of 8.40% (control) and 12.30% (patient 1). In the evaluation of the expression of Th17R and Tc17R after 6 hours of stimulation by PMA / Iono, all controls (n = 3) responded and in the group of patients (n = 3) we observed response more frequently for the patient #1, in Th17 populations (1.64%), Th17MEM (3.27%), Tc17 cells (10.70%) and Tc17MEM (3.58%). We observed a reduction of expression of CLRs in patients: CD206: average 60.24% (controls) and 21.27% (patients), Dectin 1: 22.42% (controls) and 12.06% (patients) and Dectin2: 26% (controls) and 4.99% (patients). Controls (n = 6) and patients (n = 3). Innovation in the production of antigenic extract extract TCA - Target 1 encourages the study of fungal extracts to obtain better conditions of evaluation of the immune response in patients with dermatophytosis. We characterized and qualified the cellular immune response to the TriR2 peptide, to antigen extracts, and evaluated the expression of CLRs in this special group of patients
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Análise da expressão gênica no dermatófito Trichophyton rubrum mimetizando a infecção in vitro: pH e diferentes fontes de carbono regulando genes / Analysis of gene expression in the dermatophyte Trichophyton rubrum during the mimetic infection in vitro: pH and carboun sources are regulating genesFernanda Cristina de Albuquerque Maranhão 12 December 2008 (has links)
Dermatófitos são fungos filamentosos com a habilidade de invadir substratos queratinizados e causar dermatofitoses em humanos e animais, penetrando profundamente apenas em hospedeiros imunocomprometidos. Trichophyton rubrum é um fungo antropofílico e cosmopolita, o mais comum agente de micoses superficiais, que usa componentes celulares como proteínas e lipídeos após uma específica regulação de sua expressão gênica governada pelo pH ambiente e sensoriamento celular. A virulência de T. rubrum é relacionada com a secreção de enzimas proteolíticas, um importante fator determinante na invasão, utilização e subseqüente disseminação através do estrato córneo. O objetivo desse estudo foi identificar através de Hibridização Subtrativa Supressiva (SSH) genes de T. rubrum preferencialmente expressos durante o crescimento na presença de queratina e lipídeos, quando T. rubrum degrada fontes de carbono tipicamente encontradas em células epidérmicas. Inicialmente, nós avaliamos as mudanças no pH extracelular durante seu crescimento em queratina e lipídeo (depois de 6, 12, 24, 48, 72 h e 7 dias) em pH inicial 5,0, onde foi observado um gradual aumento do pH basal sob ambas as condições de teste, comparado com a condição glicose (controle). Também identificamos 576 transcritos de T. rubrum diferencialmente expressos por SSH usando conídios cultivados por 72 h em queratina como teste e em glicose como controle. Os genes de T. rubrum ativados codificam proteínas putativas que foram validadas por cDNA dot-blot e northern blot, mostrando similaridade com proteínas fúngicas envolvidas no metabolismo básico, crescimento e virulência, p. ex., transportadores ABC-MDR, MFS e ATPase de cobre, permease, NIMA interactive protein, poliproteína Gag-Pol, fatores de virulência subtilisinas serino-proteases (Sub 3 e 5) e metaloproteases (Mep 3 e 4) e Hsp30. Adicionalmente, entre os 762 clones obtidos na biblioteca da condição lipídeo (72 h), 80 transcritos superexpressos foram confirmados por cDNA dot-blot, revelando 14 unigenes similares à proteínas de vários organismos patogênicos, como glicoproteína 43 kD, transportador MDR, proteína G, quitina sintase e serino/treonina fosfatase. Transcritos do gene TruMDR2, codificador de um transportador ABC, foi isolado tanto na presença de queratina quanto em lipídeo, e a análise da linhagem mutante TruMDR2 de T. rubrum mostrou uma redução na atividade infectante, caracterizada pelo baixo crescimento em unhas humanas comparada com o tipo selvagem. A alta expressão de transportadores por T. rubrum em condições que mimetizam a infecção e a redução na virulência de TruMDR2 durante o modelo in vitro sugerem que transportadores estão envolvidos na patogenicidade de T. rubrum. Outro linhagem mutante (pacC-1) com um nocaute no gene pacC que codifica um fator de transcrição regulado pelo pH local, mostrou a expressão de proteases (Sub 3 e 5 e Mep 4) diminuída após o crescimento em queratina em comparação com o tipo selvagem em análises de northern blots. Essas proteases tem uma atividade ótima em pH alcalino, e nossos resultados indicam uma regulação defectiva do gene pacC de T. rubrum na ativação de proteases. Em conclusão, através do uso de SSH foi possível identificar genes de T. rubrum ativados após tratamentos específicos, o que sugere a importância dos mesmos na interação dermatófito-hospedeiro, instalação e manutenção da doença. Esses resultados disponibilizam novos dados sobre T. rubrum que levarão a um melhor entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos no crescimento, metabolismo geral e patogenicidade, e também auxiliar na identificação de novos e efetivos alvos de drogas para dermatófitos. / Dermatophytes are a group of fungi filamentous that have the ability to invade keratinized substrates, causing dermatophytosis in humans and animals and only penetrate deeper if the host is immunocompromised. Trichophyton rubrum is an anthropophilic and cosmopolitan fungi, the most common agent of superficial mycoses, which uses cell components such as proteins and lipids after a specific regulation of its gene expression governed by pH environment and sensing cell. The virulence T. rubrum is related to secretion of proteolytic enzymes, an important factor determinant in the invasion, utilization and subsequently dissemination through the stratum corneum. The aim of this study was to indentify by Suppression Subtractive Hybridization (SSH) T. rubrum genes preferentially expressed during growth in the presence of keratin and lipids, upregulated when this fungus degrades carbon source typically found at epidemic cells. Initially, this work evaluated the changes in the extracellular pH during its growth in keratin and lipid (after 6, 12, 24, 48, 72 h and 7 days) at initial pH 5.0, where we observed a gradual increase of basal pH under both tests when compared to glucose condition (control). Also, we identified 576 T. rubrum transcripts differentially expressed by SSH using conidia cultivated for 72 h in keratin as tester, and in glucose as driver. The T. rubrum genes upregulated encode putative proteins that were validated by cDNA dot-blot and northern blot, showing similarity to fungi proteins involved in basic metabolism, growth and virulence, i.e., transporters ABC-MDR, MFS and ATPase of copper, permease, NIMA interactive protein, Gag-Pol polyprotein, virulence factors serine-protease subtilisins (Sub 3 and 5) and metalloproteases (Mep 3 and 4) and Hsp30. Additionally, among the 762 clones obtained in a library of lipid condition (72 h), 80 over-expressed transcripts were confirmed by cDNA dot-blot, revealing 14 unigenes similar to proteins of several pathogenic organisms, like glicoprotein 43 kD, MDR transporters, G protein, chitin synthase and serine/threonine-protein phosphatase. Transcripts of TruMDR2 gene, encoding an ABC transporter in T. rubrum, were isolated in the presence of keratin and lipid, and the examination of TruMDR2 mutant T. rubrum showed a reduction in infecting activity, characterized by low growth in human nails compared to wild-strain. The high expression of transporter by T. rubrum in conditions that mimetize the infection and the virulence reduction of TruMDR2 in an in vitro model suggests that transporters are involved in T. rubrum pathogenicity. Another mutant, pacC-1 with a knockout in PacC gene that encodes a transcription factor regulated by local pH, showed the expression of proteases (Sub 3, Sub 5 and Mep 4) decreased after growth in keratin (72 h) in comparison to wild-strain in northern blot analyzes. These proteases have an optimal activity in alkaline pH, and our results indicate a defective regulation of T. rubrum pacC gene in the activation of proteases. In conclusion, by means of SSH to identify genes upregulated in T. rubrum after specific treatments, their importance in the dermatophyte-host interaction, installation and maintenance in the disease is suggested. These results provide new insights about T. rubrum that will contribute to a better understanding of molecular mechanisms about the growth, metabolism and pathogenicity, and may also aid in the identification of novel effective drug targets for dermathophytes.
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Regulação da expressão gênica no patógeno humano Trichophyton rubrum em resposta ao pH ambiente, a variações nutricionais e na interação dermatófito-hospedeiro / Regulation of gene expression in human pathogen Trichophyton rubrum in response to ambient pH, the variations in nutritional and dermatophyte-host interactionRodrigo da Silva Santos 09 December 2013 (has links)
O patógeno Trichophyton rubrum é um fungo queratinofílico e o principal agente de micoses cutâneas humanas. O processo de degradação de substratos queratinizados por dermatófitos está relacionado com a alcalinização do ambiente, o que modula a expressão e a secreção de enzimas responsáveis pela captação e utilização dos nutrientes presentes no microambiente hospedeiro. Essa modulação do pH parece determinante para o sucesso do processo infeccioso, quando o fungo se depara com o pH ácido da pele humana. A hipótese deste trabalho foi verificar se há influência do pH e da fonte nutricional na modulação da expressão de genes de T. rubrum que codificam proteínas envolvidas nos processos de autofagia (atg8 e atg15), adesão celular (sowgp) e de alguns fatores de transcrição (pacC, bZIP/cys-3 e nuc-1), e se estes processos estão relacionados à patogenicidade deste dermatófito. De modo a avaliar a modulação da expressão destes genes na patogenicidade e sobrevivência fúngica, T. rubrum foi cultivado em meios de cultura tamponados (pH 5,0 e pH 8,0) e não tamponados, contendo glicose, glicina, glicose com glicina, ou queratina como fonte nutricional. Os genes envolvidos no processo de autofagia também foram avaliados na presença do inibidor de autofagia 3-metiladenina (3-MA). Além disso, o perfil transcricional destes genes de T. rubrum foi avaliado durante a interação ex vivo com unha e pele humana. As análises demonstraram a influência concomitante da fonte nutricional e do pH ambiente na modulação da expressão dos transcritos gênicos estudados nas diferentes linhagens de T. rubrum utilizadas neste trabalho (CBS, H6 e pacC-1). Nossos resultados revelaram que o crescimento destas linhagens é maior na fonte nutricional queratina, quando comparado com as outras fontes nutricionais (glicose e glicina), havendo uma diferença na taxa de crescimento entre as linhagens neste substrato preferencial. Os genes bZIP/cys-3 e nuc-1 apresentaram perfil de expressão semelhante, mais elevada durante cultivos longos, respondendo a condições de estresse nutricional e pH alcalino, sugerindo a participação dos mesmos nos processos de crescimento e sobrevivência do fungo. Além disso, mecanismos regulatórios diferentes destes genes devem ocorrer nas três linhagens de T. rubrum em relação ao crescimento na fonte nutricional queratina. A variação transcricional do gene pacC em resposta às diferentes fontes nutricionais sugere que sua expressão depende das condições nutricionais encontradas por esse fungo, sendo o pH uma resposta secundária. Nossos resultados sugerem ainda que a via de autofagia seja importante para o desenvolvimento e sobrevivência de T. rubrum nestes substratos, e que o FT PacC atue regulando um dos pontos deste processo, visto que o gene atg15 apresenta um perfil semelhante de expressão ao gene pacC, e o gene atg8 tem perfil antagônico de expressão nas linhagens H6 e pacC-1, nas condições avaliadas neste trabalho. 3-MA inibiu a transcrição dos genes atg8 e atg15 em T. rubrum de modo especifico, e por consequência a via de macroautofagia. Os dados de expressão de sowgp sugerem que essa molécula atue durante a privação nutricional e situações de estresse pelo dermatófito, provavelmente desempenhando seu papel na progressão e manutenção do processo infeccioso, permitindo a permanência do fungo em tecidos queratinizados, e auxiliando na fixação do fungo ao epitélio humano. Desta maneira, nossos resultados fornecem informações sobre os eventos moleculares envolvidos na regulação da expressão genica durante a adaptação de T. rubrum ao pH, à variação nutricional, e interação com células e moléculas do microambiente hospedeiro. Os resultados revelam o envolvimento do processo de autofagia e de moléculas de adesão no sensoriamento e resposta a variações ambientais, e a modulação dos fatores de transcrição bZIP/Cys-3, Nuc-1 e PacC durante a adaptação de T. rubrum ao pH e à fonte nutricional podem ser importantes na regulação de moléculas necessárias para sua patogenicidade. / The pathogen Trichophyton rubrum is a keratinophylic fungi and the major agent of cutaneous mycosis in humans. The process of degradation of keratinized substrates by dermatophytes is related with environment alkalinization, which modulates the expression and secretion of the enzymes responsible for the acquisition and utilization of nutrients from the host microenvironment. This pH modulation seems to be determinant for the success of the infectious process when the fungus encounters the acidic pH of the human skin. The hypothesis of this study was to determine whether there is influence of ambient pH and nutritional source in the modulation of gene expression of T. rubrum genes coding for proteins involved in the processes of autophagy (atg8 and atg15), cellular adhesion (sowgp) and some transcription factors (pacC, bZIP/cys-3 and nuc-1), and if they are related with the pathogenicity of this dermatophyte. To evaluate the modulation of the expression of these genes in fungal pathogenicity and survival, T. rubrum was cultivated in buffered (pH 5.0 and pH8.0) or non-buffered media, containing glucose, glycine, glucose and glycine, or keratin as nutrient source. The autophagy-related genes were also analyzed in the presence of 3- methyladenine (3-MA) autophagy inhibitor. Moreover, the transcriptional profile of these genes was evaluated during T. rubrum ex vivo interaction with human nail and skin. The analyses demonstrate the simultaneous influence of the nutritional source and environment pH in the modulation of gene transcription in the different T. rubrum strains evaluated here (CBS, H6 and pacC-1). Our results revealed that growth of these strains is higher in keratin source, compared with other nutrient sources (glucose or glycine), and that they present different growth rates in this preferential substrate. The genes bZIP/cys-3 and nuc-1 presented a similar expression profile, which is higher during longer periods of growth, responding to nutritional stress and alkaline pH, suggesting their involvement in fungal growth and survival. Also, different regulatory mechanisms of these genes in these three T. rubrum strains might be implicated during keratin degradation. The transcriptional variation in the pacC gene in response to different nutritional sources, suggests that its expression is dependent on the nutritional conditions, being the ambient pH a secondary response. Furthermore, our results indicate that the autophagy pathway is important for T. rubrum survival and development during nutrient and pH adaptation, and that PacC might regulates some points of this process, since atg15 and pacC genes presented a similar expression profile, and atg8 has antagonistic expression profiles in the H6 and pacC-1 strains, in the conditions evaluated here. 3-MA inhibited the transcription of atg8 and atg15 T. rubrum genes in a specific manner, and thus inhibited the macroautophagy process. The expression profile of the sowgp gene suggests that this molecule is important during nutrient starvation and stress situation, probably having a role in the progression and maintenance of the infectious process, allowing fungal maintenance in the host keratinized tissues, contributing to fungal adherence to human epithelia. Taken together, our results provide insights into the molecular events involved in the regulation of gene expression during T. rubrum adaptation to pH, nutritional variation and interaction with the host cells and molecules. Our data reveals the involvement of the autophagy process and adhesion molecules in sensing and response of environmental changes, and the modulation of the bZIP/Cys-3, Nuc-1 and PacC transcription factors during T. rubrum adaptation to pH and nutrient source might be important in the regulation of molecules required for its pathogenicity.
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Inativação fotodinâmica de espécies de Candida e Trichophyton e de Cryptococcus neoformans com fotossensibilizadores fenotiazínicos e com uma cloroalumínio ftalocianina em nanoemulsão / Photodynamic inactivation of Candida and Trichophyton species and of Cryptococcus neoformans with phenothiazinium photosensitisers and with a chloroaluminum phthalocyanine nanoemulsionRodrigues, Gabriela Braga 12 December 2012 (has links)
Espécies de fungos dos gêneros Candida e Trichophyton e Cryptococcus neoformans são os mais importantes agentes causadores de micoses em humanos. A seleção de linhagens tolerantes aos fungicidas atualmente utilizados torna extremamente necessário o desenvolvimento de novas estratégias para o controle desses patógenos. A inativação fotodinâmica (IF) de fungos baseia-se na utilização de um fotossensibilizador (FS) que se acumula preferencialmente nas células-alvo e que pode ser ativado por exposições à luz visível. A ativação do FS induz a formação de espécies reativas de oxigênio que matam a célula fúngica. O uso de FS para o tratamento de micoses é uma aplicação recente e promissora da IF de fungos. No presente estudo, foram avaliados os efeitos dos tratamentos fotodinâmicos (TF) com os FS fenotiazínicos azul de metileno (MB), azul de toluidina (TBO), novo azul de metileno (NMBN), o derivado pentacíclico do azul de metileno S137 e com uma cloroalumínio ftalocianina em nanoemulsão (ClAlPc/NE) nas leveduras Candida albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis, Cryptococcus neoformans e nos microconídios dos dermatófitos Trichophyton mentagrophytes e T. rubrum. Os efeitos dos TF com os diferentes FS fenotiazínicos também foram avaliados na linhagem celular L929 de camundongo. Inicialmente, a eficácia dos TF foi avaliada pela determinação da concentração inibitória mínima (CIM) de cada FS para cada dose de luz. Adicionalmente, nas condições otimizadas, também foram determinados os efeitos dos TF na sobrevivência das diferentes espécies de fungos. Os MICs variaram tanto entre FS como entre espécies e diminuíram com o aumento da dose de luz. Entre os FS fenotiazínicos, para a maioria dos tratamentos (espécies e doses de luz), o NMBN e o S137 apresentaram os menores MICs. Os MICs para o NMBN e para o S137 foram <= 2,5 ?M para todas as espécies de Candida, para doses >= 20 J cm-2. MICs para a ClAlPc/NE foram tão baixos quanto 0,01 ?M para algumas das espécies de Candida. O TF com NMBN e S137 resultaram em redução de pelo menos 3 logs na sobrevivência de todas as espécies de Candida e de Trichophyton. O TF com ClAlPc/NE resultou em redução de até 4 logs na sobrevivência de C. albicans e C. tropicalis e de até 6 logs na sobrevivência de células melanizadas de C. neoformans. A internalização da ClAlPc foi confirmada por microscopia confocal de fluorescência e a quantidade incorporada pelas células foi dependente da concentração do FS. As toxicidades relativas entre os diferentes FS para as células de mamífero foram semelhantes às observadas em fungos, por exemplo maior toxicidade e fototoxicidade do NMBN e do S137 comparada às do MB e TBO / Fungal species of the genera Candida and Trichophyton and Cryptococcus neoformans are the main responsible for mycoses in humans. The selection of fungal strains resistant to currently used fungicides makes the development of alternative fungus-control techniques highly desirable. Fungal photodinamic inactivation (PI) is based on the use of a visible light-activate photosensitiser (PS) that preferentially accumulates in the cell of the target microorganism. The activation of the PS starts photochemical processes that produce a series of reactive oxygen species (ROS) that kill the fungal cell. The use of PS to treat mycoses is a novel and promising application of PI. In the present study, the effects of the photodynamic treatments (PDT) with the phenothiazinium PS methylene blue (MB), toluidine blue O (TBO), new methylene blue N (NMBN), the novel pentacyclic photosensitiser S137 and with a chloroaluminum phthalocyanine nanoemulsion (ClAlPc/NE) on the yeasts Candida albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis and Cryptococcus neoformans and on microconidia of the dermatophytes Trichophyton mentagrophytes and T. rubrum were evaluated. The effects of the PDT with the phenothiazinium PS were also evaluated on the mouse fibroblast cell line L929. The efficacies of the PDT were evaluated initially by determining the minimal inhibitory concentration (MIC) of each PS for each light dose. Additionally, for the optimized conditions, the effects of the PDT on the survival of the different fungal species were also determined. MICs varied both among PS and species and decreased with light dose increase. Among the phenothiazinium PS, for most treatments (species and light doses), NMBN and S137 showed the lowest MICs. MICs for NMBN and S137 were <= 2.5 ?M for all the Candida species to light doses >= 20 J cm-2. MICs for ClAlPc/NE were as low as 0.01 ?M for some of the Candida species. PDT with NMBN and S137 resulted in a reduction of at least 3 logs in the survival of all Candida and Trichphyton species. PDT with ClAlPc/NE resulted in reductions up to 4 logs in the survival of C. albicans and C. tropicalis and up to 6 logs in the survival of C. neoformans melanized cells. Internalization of ClAlPc by C. neoformans was confirmed by confocal fluorescence microscopy, and the degree of uptake was dependent on PS concentration. The relative toxicities among the different PS to mammalian cell were similar to the antifungal data, i.e. greater toxicity and phototoxicity with NMBN and S137 compared to MB and TBO.
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Interação de células dendríticas com conídios de Trichophyton rubrum / Interaction of dendritic cells with conidia of Trichophyton rubrumSantiago, Karla Letícia 22 June 2009 (has links)
Os dermatófitos são um grupo de fungos que têm a capacidade de invadir o tecido queratinizado (pele, pêlos e unhas) de seres humanos e animais para produzir uma infecção denominada de dermatofitose. O Trichophyton rubrum é o principal patógeno causador de dermatofitose. As lesões causadas por estas espécies são crônicas e de carater pouco inflamatória. A doença apresenta evolução lenta e pacientes cronicamente infectados não respondem bem a terapia antifúngica. Assim como na maioria dos patógenos, o sistema imune inato é determinante na resposta antifúngica. Neutrófilos, macrófagos e células dendríticas constituem as células efetoras do sistema imune. A resposta imune aos dermatófitos ainda não está bem elucidada. Atualmente é aceito que a resposta imune mediada por células é responsável pelo controle da infecção. Poucos estudos têm focado a resposta imune inata a esses fungos. Assim, fomos estudar a interação de células dendríticas de pacientes com dermatofitose com conídios de T. rubrum. Nossos resultados mostraram que células dendríticas derivadas de monócitos (CDDM) foram capazes de fagocitar conídios de T. rubrum e ainda verificamos que estas células permaneceram viáveis após fagocitose. Quando analisamos a viabilidade dos conídios de T. rubrum, após 24 e 48 horas de interação com CDDM, verificamos que após 48horas houve um aumento no número de conídios viáveis quando estes foram fagocitados por células de pacientes, mostrando que CDDM de paciente não conseguem matar os conídios após fagocitose. Avaliamos a liberação de óxido nítrico por CDDM e a análise dos resultados mostrou que não houve diferença significativa na liberação de NO pela CDDM na presença de conídio de T. rubrum. Analisamos a expressão de moléculas co-estimulatórias como CD80, CD86, CD83, CD40 e HLA-DR em pacientes com dermatofitose e em indivíduos controle, observamos que não houve diferença na expressão dessas moléculas na presença de conídios de T. rubrum quando comparadas com culturas de CDDM sem conídios. Entretanto, houve uma diminuição do número de células de pacientes que expressam estas moléculas na presença de conídio de T. rubrum. Foi detectado um aumento significativo na secreção de TNF-α e de IL-12 pelas CDDM de pacientes quando em contato com conídio de T. rubrum. Avaliamos a capacidade das CDDM de indivíduos controle e pacientes pulsadas com concentrações crescentes de tricofitina em ativar linfócitos T CD4 e também verificamos o perfil de citocinas secretadas pelos linfócitos T CD4 após proliferação. Os resultados demonstraram que as CDDM foram capazes de estimular a proliferação de linfócitos somente em pacientes com dermatofitose. Foi detectado um aumento significativo na secreção de IL-4 pelos LT CD4 de indivíduos controle. Nossos resultados sugerem uma diferença no perfil de secreção de citocinas em indivíduos controle e pacientes. Indivíduos controle não produzem IL-12 e estimulam preferencialmente linfócitos T CD4 secretores de IL-4. Por outro lado, células dendríticas de pacientes produzem IL-12 e induzem a ativação de linfócitos T produtores de IL-4 e IL-10 / The dermatophytes are a group of fungi that have the capacity to invade the keratinized tissue (skin, hair and nails) of humans and animals to produce an infection called dermatophytosis. The Trichophyton rubrum is the main causative pathogen of dermatophytosis. Injuries caused by these species are chronic inflammatory and little character. The disease shows slow evolution and chronically infected patients do not respond well to antifungal therapy. Like most pathogens, the innate immune system is crucial in the antifungal response. Neutrophils, macrophages and dendritic cells are the effector cells of the immune system. The immune response to dermatophytes is not yet well elucidated. Currently it is accepted that the immune response mediated by cells is responsible for controlling the infection. Few studies have focused on the innate immune response to these fungi. Thus, we study the interaction of dendritic cells from patients with dermatophytosis with conidia of T. rubrum. Our results showed that dendritic cells derived from monocytes (CDDM) were capable of phagocytosed conidia of T. rubrum and found that these cells remained viable after phagocytosis. When we analyze the viability of conidia of T. rubrum after 24 and 48 hours of interaction with CDDM shows that after 48hours an increase in the number of viable conidia when they were phagocytized by cells of patients, showing that CDDM not kill the patient after the conidia phagocytosis. Evaluated the release of nitric oxide by CDDM and analysis of results showed that there was no significant difference in the release of NO by CDDM in the presence of conidia of T. rubrum. We analyzed the expression of co-stimulatory molecules such as CD80, CD86, CD83, CD40 and HLA-DR in patients with dermatophytosis and in control subjects, we observed that there was no difference in expression of these molecules in the presence of conidia of T. rubrum compared with cultures of CDDM without conidia . However, there was a decrease in the number of cells of patients who express these molecules in the presence of conidia of T. rubrum. It was observed a significant increase in the secretion of TNF-α and IL-12 by CDDM of patients when in contact with conidia of T. rubrum. Evaluate the capacity of individuals to control and CDDM patients pulsed with increasing concentrations of trichophytin to activate CD4 T lymphocytes and also see the profile of cytokines secreted by CD4 + T lymphocytes after proliferation. The results showed that the CDDM were able to stimulate the proliferation of lymphocytes only in patients with dermatophytosis. We observed a significant increase in the secretion of IL-4 by CD4 L T to control individuals. Our results suggest a difference in the profile of secretion of cytokines in control subjects and patients. Control subjects did not produce IL-12 and preferentially stimulate CD4 T lymphocytes secreting IL-4. Furthermore, dendritic cells of patients produce IL-12 and induce the activation of T lymphocytes producing IL-4 and IL-10
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Expressão, regulação e funcionalidade de genes HSPs no dermatófito Trichophyton rubrum / Expression, regulation, and functionality of HSPs genes in the dermatophyte Trichophyton rubrumJacob, Tiago Rinaldi 14 March 2014 (has links)
O dermatófito Trichophyton rubrum é um fungo filamentoso, queratinofílico e antropofílico, sendo o principal agente etiológico de micoses cutâneas em humanos. Sua distribuição cosmopolita e seu acometimento grave em pacientes imunocomprometidos fazem dele um dos desafios a ser enfrentado pelos serviços de saúde pública mundial. As interações patógeno-hospedeiro envolvem diferentes processos relacionados com a degradação de queratina e com modificações metabólicas que permitem sua adesão e posterior penetração nos tecidos infectados. Essas alterações são importantes para o sucesso do processo infeccioso e envolvem mecanismos que modulam a expressão gênica, a secreção de proteínas específicas, a adaptação metabólica e as alterações no pH cutâneo, fundamentais para o estabelecimento da infecção. Dentre as proteínas que participam do processo de interação patógeno-hospedeiro estão as proteínas de choque térmico HSPs (Heat Shock Proteins), relacionadas aos mais diversificados processos celulares. Nesse sentido, a hipótese desse trabalho foi avaliar se os genes hsps de T. rubrum, bem como seu principal fator de transcrição (Hsf1), estão envolvidos nos processos de resposta a situações adversas e na interação com o microambiente hospedeiro, e se estes genes são modulados pelo fator de transcrição pacC, um regulador envolvido na sinalização do pH ambiente. Para tanto, a expressão dos genes hsps foi analisada em resposta ao cultivo de T. rubrum em diferentes meios de cultura, durante a exposição a antifúngicos, estresse térmico e interação com fragmentos de unha e pele humanas. O envolvimento da Hsp90 na modulação da expressão gênica, na suscetibilidade a antifúngicos e na interação de T. rubrum com fragmentos de unha humana foi avaliado utilizando-se um inibidor químico específico para esta proteína. Os resultados indicam uma expressão variável dentre os genes hsps e até mesmo dentro de cada família HSP, em resposta a cada condição ambiental ou interação a que o fungo foi exposto. Além disto, temos indício de que a expressão dos genes hsps seja modulada pelo fator de transcrição PacC, através da modulação do fator de transcrição Hsf1. Constatamos ainda, a influência de Hsp90 na susceptibilidade de T. rubrum às drogas Itraconazol e Micafungina, e no desenvolvimento de T. rubrum em fragmentos de unha humana. Esses resultados revelam a participação das proteínas HSPs em diversos aspectos do metabolismo de T. rubrum, e sugerem a participação de Hsp90 na patogenicicade e na suscetibilidade a drogas deste dermatófito / The dermatophyte Trichophyton rubrum is a filamentous, keratinophilic, and anthrophophilic fungi, being the major etiologic agent of cutaneous mycoses in humans. Its cosmopolitan distribution and the severe infection in immunocompromised patients make it one of the challenges to be faced by public health agencies worldwide. Hostpathogen interactions involve different processes related to keratin degradation and metabolic changes that allow adhesion and subsequent penetration of the infected tissue. These changes are important to the success of the infectious process and involve mechanisms that modulate gene expression, secretion of specific proteins, and metabolic adaptation, and cutaneous pH changes, essential to the establishment of the infection. Among the proteins that participate in the host-pathogen interaction are the heat shoch proteins (HSPs), related to diverse cellular processes. Thus, the hypothesis of this work was to evaluate whether T. rubrum hsp genes, as well as their major transcription factor (Hsf1), are involved in the response to adverse situations and in the interaction with the host microenvironment, and if these genes are regulated by the transcription fator PacC, a regulator of the pH signaling pathway. The expression of the hsp genes was evaluated in response to the cultivation of T. rubrum in different culture medium, during exposure to antifungal drugs, heat stress, and interaction with human nail and skin. The involvement of T. rubrum Hsp90 in the modulation of gene expression, susceptibility to antifungal drugs, and interaction with human nails was evaluated by using a chemical inhibitor, specific to this protein. Our results indicate a variable expression of the hsp genes, even among members of the same HSP family, in response to each environmental condition or interaction, to which the fungus was exposed. Furthermore, we have evidence that the hsp gene expression is modulated by the PacC transcription factor, by modulating the expression of the Hsf1 coding gene. We also found that Hsp90 is involved in T. rubrum susceptibility to the drugs Itraconazole and Micafungin, and in the development of this dermatophyte in human nails. These results reveal the involvement of HSPs in several aspects of T. rubrum metabolism, suggesting a role for Hsp90 in the pathogenicity and drug susceptibility in this dermatophyte
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Atividade in vitro de formulações de lípides catiônicos contra bactérias multirresistentes, fungos e microalgas de interesse médico humano e veterinário. / In vitro activity of cationic lipids formulations against multiresistants bacterias, fungi and microalgae from human and veterinary medical interest.Bentivoglio, Enyd Crystina Rodrigues de Oliveira 29 August 2016 (has links)
Infecções microbianas podem ser causadas por bactérias, fungos, vírus, parasitas e algas. O presente estudo avaliou a atividade in vitro de formulações de lípides catiônicos contra bactérias multirresistêntes (MRs), fungos e microalgas de interesse médico humano e veterinário. A atividade biocida de bicelas de brometo de dioctadecildimetilamônio (DBB) foi avaliada contra bactérias gram-negativas produtoras de β-lactamases de amplo espectro e carbapenemases mundialmente disseminadas. Para fungos (Candida albicans, Trichophyton rubrum) e microalgas (Prototheca zopfii), a atividade biocida de DBB, sem e com a associação a drogas antifúngicas (ex., miconazol, terbinafina e anfotericina B), foi avaliada determinando-se adicionalmente a atividade sinérgica. Nanodispersões catiônicas de DBB exibiram atividade bactericida, fungicida e algicida, mesmo para patógenos MRs, sendo que a sua associação com outros antimicrobianos resultou em uma atividade sinérgica que poderia favorecer a produção de formulações com potencial para aplicação clínica humana e veterinária. / Microbial infections can be caused by bactérias, fungi, virus, parasites and algae. This study evaluated in vitro activity from cationic lipds formulations against multiresistant bacterias (MRs), fungi and e microalgae from human and veterinary. The Biocidal activity from bromide dioctadecildimetilammonium biceles (DBB) was evaluated against gram-negative bactérias β-lactamases producers and carbapenemases from broad spectrum with wide spread dissemination. For fungi (Candida albicans, Trichophyton rubrum) and microalgae (Prototheca zopfii), the biocidal activity from DBB wuth and without antifungal drugs (ex., miconazole, terbinafine e amphotericin B), was also evaluated by synergistic activity. Cationic nanodispertions of DBB has shown bactericidal, fungicidal and algicidal activity, even for MRs patogens, thus , the association with the others antimicrobials resulted in a synergistic activity wich could foment the production of the formulations with a potential application in human and veterinary medicine.
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A participação dos receptores da imunidade inata na resposta contra Trichophyton rubrum / The participation of innate immunity receptors in the response to Trichophyton rubrum.Yoshikawa, Fábio Seiti Yamada 20 April 2016 (has links)
Dermatofitoses são infecções fúngicas de natureza crônica cujo principal agente etiológico é Trichophyton rubrum. Apesar de sua alta ocorrência mundial, pouco se sabe sobre os mecanismos imunológicos envolvidos nestas infecções. Neste trabalho investigamos a participação de duas classes de receptores de imunidade inata (NLRs e CLRs) na resposta a T.rubrum e avaliamos o perfil proteômico de macrófagos quando estimulados com o fungo. Observamos que T.rubrum foi capaz de induzir a produção de IL-1β dependente do inflamassomo NLRP3 e destacamos o papel da sinalização de IL-1 na modulação da resposta de IL-17. Determinamos os CLRs dectina-1 e dectina-2 como receptores essenciais na produção de citocinas inflamatórias e para o controle da infecção experimental. Curiosamente, a IL-17 e os linfócitos T e B foram dispensáveis para a eliminação do fungo. Também identificamos a proteína CLEC1A como uma novo receptor para fungos, envolvido no reconhecimento de glicolipídeos de T.rubrum. Por fim, a análise proteômica de macrofagos revelou a vimentina e a plastina-2 como duas proteínas potencialmente envolvidas na relação patógeno-hospedeiro. / Dermatophytosis are chronic fungal infections whose main causative agent is Trichophyton rubrum. Despite its high incidence worldwide, the immunological mechanisms underlying these infections remain largely unknown. Here we investigated the involvement of two classes of innate immune receptors (NLRs and CLRs) in the reponse to T.rubrum and performed a proteomic profiling of macrophages upon T.rubrum stimulation. We observed that T.rubrum was able to drive NLRP3 inflammasome-derived IL-1β production and highlighted IL-1 signaling as an important component in the shaping of the IL-17 response. We defined the CLRs dectin-1 and dectin-2 as key receptors for the induction of inflammatory cytokines and for the infection control in the in vivo settings. Curiously, IL-17 cytokines and T and B lymphocytes were dispensable for fungal clearance. In addition, we uncovered CLEC1A as a new receptor in fungal sensing, involved in the recognition of T.rubrum glycolipids. Finally, the proteomic analysis revealed Vimentin and Plastin-2 as two proteins potentially involved in the host-pathogen interaction.
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