Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arquivototal.pdf: 12262121 bytes, checksum: 2c0c8aa4e0b4b5920d10e406ad12ef1a (MD5) Previous issue date: 2012-08-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Trichophyton rubrum is the main responsible microorganism of chronic cases of dermatophytosis on nails, feet, hands, torso, neck and scalp, with high rates of resistance to antifungal agents. The clinical and epidemiological importance concerned dermatophytosis encourage studies for searching of new antifungal agents. In this context, attention has been drawn to the products from aromatic plants, especially essential oils and their components. The monoterpenes stands out due to widespread recognition of its antimicrobial activity. Therefore, it was investigated the antifungal activity of the monoterpenes citronellal, geraniol and citronellol against 14 strains of T. rubrum. For this, it was determined the minimum inhibitory concentration (MIC) of each drug, as well as their effects on mycelial growth (dry weight), the viability (logCFU/mL), conidial germination and morphogenesis. The action of the drugs on the fungal cell wall (test with sorbitol) and on the fungal cell membrane (release of cellular material, complex with ergosterol and ergosterol synthesis) were also investigated. Moreover, it was analyzed the interference on the infectivity of T. rubrum (in vitro nail infection). Among the tested monoterpenes, geraniol and citronellol were the most potent, since they showed lower MIC values. Assays were performed with geraniol (MIC = 32 μg/mL and MICx2 = 64 μg/mL) and citronellol (MIC = 128 μg/mL and MICx2 = 256 μg/mL), they significantly inhibited the mycelial growth and conidial germination. The monoterpenes showed fungicidal effect and caused caused abnormalities in morphogenesis showing large, short and twisted hyphal in the strains ATCC1683 and LM422. With sorbitol, the MIC values of these monoterpenes increased against the strain ATCC1683, suggesting action on the fungal cell wall. The results of the assays on the cell membrane showed that geraniol and citronellol released intracellular material, formed complexes with the ergosterol and decreased content of ergosterol. Therefore, the results suggest that that geraniol and citronellol act on the membrane of T. rubrum by a mechanism that appears to involve a complex with ergosterol and inhibition its biosynthesis, indirectly affecting the cell wall and causing cell lysis. Moreover, geraniol and citronellol at MIC and MICx2 also prevented infection of T. rubrum on nail fragments. Thus, the monoterpenes geraniol and citronellol are presented as promising antifungal agents, with potential applicability in the treatment of dermatophytosis, especially against the agent T. rubrum. / Trichophyton rubrum é o principal agente responsável por quadros crônicos de dermatofitoses em unhas, nos pés, nas mãos, no tronco, pescoço e couro cabeludo, com altos índices de resistência aos antifúngicos. A importância clínica e epidemiológica dispensada às dermatofitoses impulsionam estudos que visam à descoberta de novos agentes antifúngicos. Neste contexto, grande atenção vem sendo dada aos produtos oriundos de plantas aromáticas, especialmente os óleos essenciais e seus componentes. Entre estes, os monoterpenos se destacam por possuírem amplo reconhecimento do seu poder antimicrobiano. Por isso, foi investigada a atividade antifúngica dos monoterpenos citronelal, geraniol e citronelol frente a 14 cepas de T. rubrum. Para tal, foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) de cada produto, como também os seus efeitos sobre o crescimento micelial (massa seca), a viabilidade (LogUFC/mL), a germinação de conídios e a morfogênese de T. rubrum. A ação dos produtos sobre a parede celular fúngica (ensaio com sorbitol) e sobre a membrana plasmática fúngica (perda de material citoplasmático, complexação com ergosterol e síntese de ergosterol) também foi investigada. Além disso, foi analisada a interferência sobre a infectividade de T. rubrum (infecção in vitro em unhas). Entre os monoterpenos testados, geraniol e citronelol foram os mais potentes, pois apresentaram menores valores de CIM. Ensaios foram realizados com geraniol (CIM = 32 μg/mL e CIMx2 = 64 μg/mL) e citronelol (CIM = 128 μg/mL e CIMx2 = 256 μg/mL), nos quais eles inibiram significativamente o desenvolvimento micelial e a germinação dos conídios. Os monoterpenos apresentaram efeito fungicida e provocaram alterações na morfogênese formando hifas largas, curtas e tortuosas nas cepas ATCC1683 e LM422. Com sorbitol, os valores de CIM desses monoterpenos aumentaram frente à cepa ATCC1683, sugerindo ação sobre a parede celular fúngica. Os resultados dos ensaios sobre a membrana plasmática mostraram que geraniol e citronelol provocaram liberação de material intracelular, formaram complexos com o ergosterol e diminuíram o conteúdo de ergosterol. Diante dos resultados, sugere-se que o geraniol e citronelol atuam sobre a membrana de T. rubrum por um mecanismo que parece envolver a complexação com o ergosterol e inibição de sua biossíntese, afetando indiretamente a parede celular e ocasionando lise celular. Além do mais, geraniol e citronelol, na CIM e CIMx2, também inibiram a infecção de T. rubrum em fragmentos ungueais. Dessa maneira, os monoterpenos geraniol e citronelol se apresentam como promissores agentes antifúngicos, com potencial aplicabilidade no tratamento das dermatofitoses, em especial contra o agente T. rubrum.

O dermatófito Trichophyton rubrum é um fungo filamentoso, antropofílico que infecta preferencialmente tecidos queratinizados, e é o agente etiológico mais frequentemente isolado em casos de dermatofitoses humanas. Recentemente, este fungo tornou-se a causa de infecções profundas e generalizadas em pacientes imunocomprometidos. As estratégias terapêuticas para controlar esse tipo de infecção apresentam várias limitações, como o aparecimento de linhagens resistentes e o número restrito de alvos celulares disponíveis. Novas estratégias terapêuticas são necessárias, sendo o foco de muitas investigações. Acriflavina é uma droga citotóxica com atividade antifúngica envolvida na inibição da topoisomerase. Embora seja um composto intercalante de DNA, já foi relatada a super expressão de genes que codificam enzimas envolvidas no transporte de elétrons na cadeia respiratória mitocondrial e no transporte de ferro em resposta a esta droga, sugerindo um amplo espectro de efeitos celulares. A fim de melhor compreender seus efeitos moleculares, o objetivo deste trabalho foi avaliar o transcriptoma de T. rubrum em resposta a acriflavina. Os perfis transcricionais em resposta a esta droga foram analisados utilizando a metodologia de RNA-seq empregando o sequenciamento em larga escala SOLiD System. Foram comparadas quatro bibliotecas sendo uma o cultivo de T. rubrum em meio Sabouraud e três períodos de exposição à droga: 3 horas, 12 horas e 24 horas. Foram geradas aproximadamente 200 milhões de reads, as quais foram filtradas e alinhadas no genoma de T. rubrum disponível no Dermatophyte Comparative Database Broad Institute utilizando os algoritmos Bowtie e Tophat. As reads alinhadas foram processadas utilizando os algoritmos Cufflinks e Cuffdiff para estimar a abundancia dos transcritos e testar os genes diferencialmente expressos entre o controle e as condições de exposição à droga. Foram identificados 3.153 genes diferencialmente expressos. Após o estabelecimento de critérios mais estringentes, foram selecionados 490 genes diferencialmente expressos em resposta à droga. Estes genes estão relacionados a vários processos celulares como reações de oxidação e redução, transporte transmembrana, transporte de íons e metais e a patogenicidade. Os genes envolvidos com patogenicidade foram reprimidos, sugerindo que a droga interfira com processos importantes para instalação e manutenção da infecção no hospedeiro. Outros fatores de virulência como genes envolvidos no ciclo do glioxilato, também foram reprimidos pela droga. Além disso, genes da via de biossíntese do ergosterol foram reprimidos pela droga, o que constitui um provável novo mecanismo de ação de acriflavina. Os resultados obtidos nesta análise em larga escala contribuem com a elucidação dos mecanismos moleculares envolvidos na adaptação ao estresse em dermatófitos e podem auxiliar o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas. Além disso, estes resultados contribuem com a anotação do genoma e transcritoma de T. rubrum e outros dermatófitos. / The dermatophyte Trichophyton rubrum is an anthropophilic filamentous fungus that infects keratinized tissues and is the most common etiologic agent isolated in cases of human dermatophytoses. Recently, it has become the cause of deep and widespread infections in immunocompromised patients. Therapeutic strategies to control these infections have several limitations, such as the appearence of resistant strains and the limited number of antifungal cellular targets. New therapeutic strategies are necessary, being the focus of many investigations. Acriflavine is a cytotoxic drug with antifungal activity involved in topoisomerase inhibition. Although it presents DNA intercalating properties, it has already been reported the over-expression of genes coding for enzymes involved in mitochondrial respiratory-electron transport and in iron transport in response to this drug, suggesting a broad spectra of cellular effects. In order to better understand its molecular effects we evaluated T. rubrum transcriptome in response to acriflavine in a time-course assay using the next generation sequencing technology SOLiD System. RNA-seq was performed comparing T. rubrum growth in Sabouraud medium as the control and the three periods of drug exposure, 3h, 12h, and 24h. RNA-seq generated approximately 200 million short reads that were mapped to the Broad Institutes Dermatophyte Comparative Database using Bowtie and TopHat algoritms. Differential gene expression analysis was performed using Cufflinks and Cuffdiff. It was identified 3,153 differentially expressed genes. A more stringent cut-off threshold was established and this analysis revealed a subset of 490 genes modulated in response to the stress caused by exposure of T. rubrum to acriflavine. These genes are involved in various cellular processes such as oxidation-reduction reactions, transmembrane transport, metal ion binding, and pathogenicity. The genes involved in pathogenicity were down-regulated, suggesting that this drug interferes with virulence factors that allow the development of infection and persistence of the dermatophyte in the host. Other virulence factors such as genes involved in the glyoxylate cycle were also repressed by the drug. Moreover, genes involved in ergosterol biosynthesis pathway were down-regulated by the drug and may constitute a new mechanism of action of acriflavine. The results obtained in this large scale analysis provide insights into the molecular mechanisms underlying the responses of T. rubrum to stress conditions and may aid the development of new antifungal drugs. Furthermore, these results contribute to improve gene annotation and open reading frame prediction for T. rubrum and other dermatophyte genomes and transcriptomes.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Jaqueline Oliveira (jaqueoliveiram@gmail.com) on 2008-11-25T16:49:56Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_FernandaMeloESilva.pdf: 2007298 bytes, checksum: 76d60a90eeef8b6d87445af7b2e853c0 (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2009-02-09T11:49:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_FernandaMeloESilva.pdf: 2007298 bytes, checksum: 76d60a90eeef8b6d87445af7b2e853c0 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-02-09T11:49:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_FernandaMeloESilva.pdf: 2007298 bytes, checksum: 76d60a90eeef8b6d87445af7b2e853c0 (MD5) / As limitações terapêuticas, o desenvolvimento de resistência, a toxicidade relacionada a antifúngicos, as significantes interações medicamentosas e a biodisponibilidade insuficiente dos antifúngicos convencionais tornam necessários o desenvolvimento de medicamentos para tratar as novas e emergentes infecções fúngicas. O Cerrado é o segundo maior bioma do Brasil e foi identificado como um dos mais distintos biomas sulamericanos, constituindo uma importante fonte de moléculas vegetais inovadores para diversas condições, incluindo as doenças infecciosas. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi avaliar o potencial antifúngico de extratos de plantas do Cerrado utilizadas tradicionalmente para tratar infecções e feridas. Dos 66 extratos testados na concentração de 20 mg/mL, a atividade foi pouco expressiva sobre Candida albicans e 17 foram ativos para Trichophyton rubrum. Os extratos diclorometânicos da madeira do caule e da madeira da raiz de Kielmeyera coriacea, os hexânicos da folha de Renealmia alpinia e Stryphnodendron adstringens e o diclorometânico da madeira do caule de Tabebuia caraiba foram os mais promissores apresentando a média geométrica dos valores da concentração inibitória mínima (CIM) entre 170,39 e 23,23 µg/mL. Esse estudo mostra que extratos de plantas do Cerrado são de particular interesse como fonte de novos agentes para o tratamento de infecções dermatofíticas. Dessa forma, um estudo mais profundo, com isolamento de substâncias e análise sobre outras espécies de dermatófitos, permitiria uma melhor investigação da susceptibilidade desses fungos. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Therapeutic limitations, development of fungal drug resistances, drug-related toxicity, significant drug interactions and insufficient bioavailability of the conventional antifungal drugs make necessary the development of drugs able to treat the new and emerging fungal infections. The Cerrado is the second greater biome of Brazil and it was identified as one of the most distinguished biomes of South America, becoming an important source of innovative vegetal molecules to treat several conditions, including infectious diseases. Thus, the objective of this study is to evaluate the antifungal potential of Cerrado plants used to treat infections and wounds. Of the 66 extracts tested in the concentration of 20 mg/ml, none showed relevant activity against Candida albicans and 17 were active to Trichophyton rubrum. The dicloromethanic extracts of stem wood and root wood of Kielmeyera coriacea, the hexanic extracts of the leaves of Renealmia alpinia and Stryphnodendron adstringens, and the dicloromethanic extracts of stem wood of Tabebuia caraiba were the most promising, presenting geometric means of minimal inhibitory concentration (MIC) values between 170.39 and 23.23 µg/ml. The present study shows that extracts of Cerrado plants are of particular interesting as source of new agents to the treatment of dermatophytics infections. Therefore, a deeper study, with the isolation of substances and the analysis against other dermatophytes, would allow a better investigation of these fungi susceptibility.

O patógeno Trichophyton rubrum é um fungo queratinofílico e o principal agente de micoses cutâneas humanas. O processo de degradação de substratos queratinizados por dermatófitos está relacionado com a alcalinização do ambiente, o que modula a expressão e a secreção de enzimas responsáveis pela captação e utilização dos nutrientes presentes no microambiente hospedeiro. Essa modulação do pH parece determinante para o sucesso do processo infeccioso, quando o fungo se depara com o pH ácido da pele humana. A hipótese deste trabalho foi verificar se há influência do pH e da fonte nutricional na modulação da expressão de genes de T. rubrum que codificam proteínas envolvidas nos processos de autofagia (atg8 e atg15), adesão celular (sowgp) e de alguns fatores de transcrição (pacC, bZIP/cys-3 e nuc-1), e se estes processos estão relacionados à patogenicidade deste dermatófito. De modo a avaliar a modulação da expressão destes genes na patogenicidade e sobrevivência fúngica, T. rubrum foi cultivado em meios de cultura tamponados (pH 5,0 e pH 8,0) e não tamponados, contendo glicose, glicina, glicose com glicina, ou queratina como fonte nutricional. Os genes envolvidos no processo de autofagia também foram avaliados na presença do inibidor de autofagia 3-metiladenina (3-MA). Além disso, o perfil transcricional destes genes de T. rubrum foi avaliado durante a interação ex vivo com unha e pele humana. As análises demonstraram a influência concomitante da fonte nutricional e do pH ambiente na modulação da expressão dos transcritos gênicos estudados nas diferentes linhagens de T. rubrum utilizadas neste trabalho (CBS, H6 e pacC-1). Nossos resultados revelaram que o crescimento destas linhagens é maior na fonte nutricional queratina, quando comparado com as outras fontes nutricionais (glicose e glicina), havendo uma diferença na taxa de crescimento entre as linhagens neste substrato preferencial. Os genes bZIP/cys-3 e nuc-1 apresentaram perfil de expressão semelhante, mais elevada durante cultivos longos, respondendo a condições de estresse nutricional e pH alcalino, sugerindo a participação dos mesmos nos processos de crescimento e sobrevivência do fungo. Além disso, mecanismos regulatórios diferentes destes genes devem ocorrer nas três linhagens de T. rubrum em relação ao crescimento na fonte nutricional queratina. A variação transcricional do gene pacC em resposta às diferentes fontes nutricionais sugere que sua expressão depende das condições nutricionais encontradas por esse fungo, sendo o pH uma resposta secundária. Nossos resultados sugerem ainda que a via de autofagia seja importante para o desenvolvimento e sobrevivência de T. rubrum nestes substratos, e que o FT PacC atue regulando um dos pontos deste processo, visto que o gene atg15 apresenta um perfil semelhante de expressão ao gene pacC, e o gene atg8 tem perfil antagônico de expressão nas linhagens H6 e pacC-1, nas condições avaliadas neste trabalho. 3-MA inibiu a transcrição dos genes atg8 e atg15 em T. rubrum de modo especifico, e por consequência a via de macroautofagia. Os dados de expressão de sowgp sugerem que essa molécula atue durante a privação nutricional e situações de estresse pelo dermatófito, provavelmente desempenhando seu papel na progressão e manutenção do processo infeccioso, permitindo a permanência do fungo em tecidos queratinizados, e auxiliando na fixação do fungo ao epitélio humano. Desta maneira, nossos resultados fornecem informações sobre os eventos moleculares envolvidos na regulação da expressão genica durante a adaptação de T. rubrum ao pH, à variação nutricional, e interação com células e moléculas do microambiente hospedeiro. Os resultados revelam o envolvimento do processo de autofagia e de moléculas de adesão no sensoriamento e resposta a variações ambientais, e a modulação dos fatores de transcrição bZIP/Cys-3, Nuc-1 e PacC durante a adaptação de T. rubrum ao pH e à fonte nutricional podem ser importantes na regulação de moléculas necessárias para sua patogenicidade. / The pathogen Trichophyton rubrum is a keratinophylic fungi and the major agent of cutaneous mycosis in humans. The process of degradation of keratinized substrates by dermatophytes is related with environment alkalinization, which modulates the expression and secretion of the enzymes responsible for the acquisition and utilization of nutrients from the host microenvironment. This pH modulation seems to be determinant for the success of the infectious process when the fungus encounters the acidic pH of the human skin. The hypothesis of this study was to determine whether there is influence of ambient pH and nutritional source in the modulation of gene expression of T. rubrum genes coding for proteins involved in the processes of autophagy (atg8 and atg15), cellular adhesion (sowgp) and some transcription factors (pacC, bZIP/cys-3 and nuc-1), and if they are related with the pathogenicity of this dermatophyte. To evaluate the modulation of the expression of these genes in fungal pathogenicity and survival, T. rubrum was cultivated in buffered (pH 5.0 and pH8.0) or non-buffered media, containing glucose, glycine, glucose and glycine, or keratin as nutrient source. The autophagy-related genes were also analyzed in the presence of 3- methyladenine (3-MA) autophagy inhibitor. Moreover, the transcriptional profile of these genes was evaluated during T. rubrum ex vivo interaction with human nail and skin. The analyses demonstrate the simultaneous influence of the nutritional source and environment pH in the modulation of gene transcription in the different T. rubrum strains evaluated here (CBS, H6 and pacC-1). Our results revealed that growth of these strains is higher in keratin source, compared with other nutrient sources (glucose or glycine), and that they present different growth rates in this preferential substrate. The genes bZIP/cys-3 and nuc-1 presented a similar expression profile, which is higher during longer periods of growth, responding to nutritional stress and alkaline pH, suggesting their involvement in fungal growth and survival. Also, different regulatory mechanisms of these genes in these three T. rubrum strains might be implicated during keratin degradation. The transcriptional variation in the pacC gene in response to different nutritional sources, suggests that its expression is dependent on the nutritional conditions, being the ambient pH a secondary response. Furthermore, our results indicate that the autophagy pathway is important for T. rubrum survival and development during nutrient and pH adaptation, and that PacC might regulates some points of this process, since atg15 and pacC genes presented a similar expression profile, and atg8 has antagonistic expression profiles in the H6 and pacC-1 strains, in the conditions evaluated here. 3-MA inhibited the transcription of atg8 and atg15 T. rubrum genes in a specific manner, and thus inhibited the macroautophagy process. The expression profile of the sowgp gene suggests that this molecule is important during nutrient starvation and stress situation, probably having a role in the progression and maintenance of the infectious process, allowing fungal maintenance in the host keratinized tissues, contributing to fungal adherence to human epithelia. Taken together, our results provide insights into the molecular events involved in the regulation of gene expression during T. rubrum adaptation to pH, nutritional variation and interaction with the host cells and molecules. Our data reveals the involvement of the autophagy process and adhesion molecules in sensing and response of environmental changes, and the modulation of the bZIP/Cys-3, Nuc-1 and PacC transcription factors during T. rubrum adaptation to pH and nutrient source might be important in the regulation of molecules required for its pathogenicity.

Dermatófitos são fungos filamentosos com a habilidade de invadir substratos queratinizados e causar dermatofitoses em humanos e animais, penetrando profundamente apenas em hospedeiros imunocomprometidos. Trichophyton rubrum é um fungo antropofílico e cosmopolita, o mais comum agente de micoses superficiais, que usa componentes celulares como proteínas e lipídeos após uma específica regulação de sua expressão gênica governada pelo pH ambiente e sensoriamento celular. A virulência de T. rubrum é relacionada com a secreção de enzimas proteolíticas, um importante fator determinante na invasão, utilização e subseqüente disseminação através do estrato córneo. O objetivo desse estudo foi identificar através de Hibridização Subtrativa Supressiva (SSH) genes de T. rubrum preferencialmente expressos durante o crescimento na presença de queratina e lipídeos, quando T. rubrum degrada fontes de carbono tipicamente encontradas em células epidérmicas. Inicialmente, nós avaliamos as mudanças no pH extracelular durante seu crescimento em queratina e lipídeo (depois de 6, 12, 24, 48, 72 h e 7 dias) em pH inicial 5,0, onde foi observado um gradual aumento do pH basal sob ambas as condições de teste, comparado com a condição glicose (controle). Também identificamos 576 transcritos de T. rubrum diferencialmente expressos por SSH usando conídios cultivados por 72 h em queratina como teste e em glicose como controle. Os genes de T. rubrum ativados codificam proteínas putativas que foram validadas por cDNA dot-blot e northern blot, mostrando similaridade com proteínas fúngicas envolvidas no metabolismo básico, crescimento e virulência, p. ex., transportadores ABC-MDR, MFS e ATPase de cobre, permease, NIMA interactive protein, poliproteína Gag-Pol, fatores de virulência subtilisinas serino-proteases (Sub 3 e 5) e metaloproteases (Mep 3 e 4) e Hsp30. Adicionalmente, entre os 762 clones obtidos na biblioteca da condição lipídeo (72 h), 80 transcritos superexpressos foram confirmados por cDNA dot-blot, revelando 14 unigenes similares à proteínas de vários organismos patogênicos, como glicoproteína 43 kD, transportador MDR, proteína G, quitina sintase e serino/treonina fosfatase. Transcritos do gene TruMDR2, codificador de um transportador ABC, foi isolado tanto na presença de queratina quanto em lipídeo, e a análise da linhagem mutante TruMDR2 de T. rubrum mostrou uma redução na atividade infectante, caracterizada pelo baixo crescimento em unhas humanas comparada com o tipo selvagem. A alta expressão de transportadores por T. rubrum em condições que mimetizam a infecção e a redução na virulência de TruMDR2 durante o modelo in vitro sugerem que transportadores estão envolvidos na patogenicidade de T. rubrum. Outro linhagem mutante (pacC-1) com um nocaute no gene pacC que codifica um fator de transcrição regulado pelo pH local, mostrou a expressão de proteases (Sub 3 e 5 e Mep 4) diminuída após o crescimento em queratina em comparação com o tipo selvagem em análises de northern blots. Essas proteases tem uma atividade ótima em pH alcalino, e nossos resultados indicam uma regulação defectiva do gene pacC de T. rubrum na ativação de proteases. Em conclusão, através do uso de SSH foi possível identificar genes de T. rubrum ativados após tratamentos específicos, o que sugere a importância dos mesmos na interação dermatófito-hospedeiro, instalação e manutenção da doença. Esses resultados disponibilizam novos dados sobre T. rubrum que levarão a um melhor entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos no crescimento, metabolismo geral e patogenicidade, e também auxiliar na identificação de novos e efetivos alvos de drogas para dermatófitos. / Dermatophytes are a group of fungi filamentous that have the ability to invade keratinized substrates, causing dermatophytosis in humans and animals and only penetrate deeper if the host is immunocompromised. Trichophyton rubrum is an anthropophilic and cosmopolitan fungi, the most common agent of superficial mycoses, which uses cell components such as proteins and lipids after a specific regulation of its gene expression governed by pH environment and sensing cell. The virulence T. rubrum is related to secretion of proteolytic enzymes, an important factor determinant in the invasion, utilization and subsequently dissemination through the stratum corneum. The aim of this study was to indentify by Suppression Subtractive Hybridization (SSH) T. rubrum genes preferentially expressed during growth in the presence of keratin and lipids, upregulated when this fungus degrades carbon source typically found at epidemic cells. Initially, this work evaluated the changes in the extracellular pH during its growth in keratin and lipid (after 6, 12, 24, 48, 72 h and 7 days) at initial pH 5.0, where we observed a gradual increase of basal pH under both tests when compared to glucose condition (control). Also, we identified 576 T. rubrum transcripts differentially expressed by SSH using conidia cultivated for 72 h in keratin as tester, and in glucose as driver. The T. rubrum genes upregulated encode putative proteins that were validated by cDNA dot-blot and northern blot, showing similarity to fungi proteins involved in basic metabolism, growth and virulence, i.e., transporters ABC-MDR, MFS and ATPase of copper, permease, NIMA interactive protein, Gag-Pol polyprotein, virulence factors serine-protease subtilisins (Sub 3 and 5) and metalloproteases (Mep 3 and 4) and Hsp30. Additionally, among the 762 clones obtained in a library of lipid condition (72 h), 80 over-expressed transcripts were confirmed by cDNA dot-blot, revealing 14 unigenes similar to proteins of several pathogenic organisms, like glicoprotein 43 kD, MDR transporters, G protein, chitin synthase and serine/threonine-protein phosphatase. Transcripts of TruMDR2 gene, encoding an ABC transporter in T. rubrum, were isolated in the presence of keratin and lipid, and the examination of TruMDR2 mutant T. rubrum showed a reduction in infecting activity, characterized by low growth in human nails compared to wild-strain. The high expression of transporter by T. rubrum in conditions that mimetize the infection and the virulence reduction of TruMDR2 in an in vitro model suggests that transporters are involved in T. rubrum pathogenicity. Another mutant, pacC-1 with a knockout in PacC gene that encodes a transcription factor regulated by local pH, showed the expression of proteases (Sub 3, Sub 5 and Mep 4) decreased after growth in keratin (72 h) in comparison to wild-strain in northern blot analyzes. These proteases have an optimal activity in alkaline pH, and our results indicate a defective regulation of T. rubrum pacC gene in the activation of proteases. In conclusion, by means of SSH to identify genes upregulated in T. rubrum after specific treatments, their importance in the dermatophyte-host interaction, installation and maintenance in the disease is suggested. These results provide new insights about T. rubrum that will contribute to a better understanding of molecular mechanisms about the growth, metabolism and pathogenicity, and may also aid in the identification of novel effective drug targets for dermathophytes.

Dermatófitos são fungos filamentosos com a habilidade de invadir substratos queratinizados e causar dermatofitoses em humanos e animais, penetrando profundamente apenas em hospedeiros imunocomprometidos. Trichophyton rubrum é um fungo antropofílico e cosmopolita, o mais comum agente de micoses superficiais, que usa componentes celulares como proteínas e lipídeos após uma específica regulação de sua expressão gênica governada pelo pH ambiente e sensoriamento celular. A virulência de T. rubrum é relacionada com a secreção de enzimas proteolíticas, um importante fator determinante na invasão, utilização e subseqüente disseminação através do estrato córneo. O objetivo desse estudo foi identificar através de Hibridização Subtrativa Supressiva (SSH) genes de T. rubrum preferencialmente expressos durante o crescimento na presença de queratina e lipídeos, quando T. rubrum degrada fontes de carbono tipicamente encontradas em células epidérmicas. Inicialmente, nós avaliamos as mudanças no pH extracelular durante seu crescimento em queratina e lipídeo (depois de 6, 12, 24, 48, 72 h e 7 dias) em pH inicial 5,0, onde foi observado um gradual aumento do pH basal sob ambas as condições de teste, comparado com a condição glicose (controle). Também identificamos 576 transcritos de T. rubrum diferencialmente expressos por SSH usando conídios cultivados por 72 h em queratina como teste e em glicose como controle. Os genes de T. rubrum ativados codificam proteínas putativas que foram validadas por cDNA dot-blot e northern blot, mostrando similaridade com proteínas fúngicas envolvidas no metabolismo básico, crescimento e virulência, p. ex., transportadores ABC-MDR, MFS e ATPase de cobre, permease, NIMA interactive protein, poliproteína Gag-Pol, fatores de virulência subtilisinas serino-proteases (Sub 3 e 5) e metaloproteases (Mep 3 e 4) e Hsp30. Adicionalmente, entre os 762 clones obtidos na biblioteca da condição lipídeo (72 h), 80 transcritos superexpressos foram confirmados por cDNA dot-blot, revelando 14 unigenes similares à proteínas de vários organismos patogênicos, como glicoproteína 43 kD, transportador MDR, proteína G, quitina sintase e serino/treonina fosfatase. Transcritos do gene TruMDR2, codificador de um transportador ABC, foi isolado tanto na presença de queratina quanto em lipídeo, e a análise da linhagem mutante TruMDR2 de T. rubrum mostrou uma redução na atividade infectante, caracterizada pelo baixo crescimento em unhas humanas comparada com o tipo selvagem. A alta expressão de transportadores por T. rubrum em condições que mimetizam a infecção e a redução na virulência de TruMDR2 durante o modelo in vitro sugerem que transportadores estão envolvidos na patogenicidade de T. rubrum. Outro linhagem mutante (pacC-1) com um nocaute no gene pacC que codifica um fator de transcrição regulado pelo pH local, mostrou a expressão de proteases (Sub 3 e 5 e Mep 4) diminuída após o crescimento em queratina em comparação com o tipo selvagem em análises de northern blots. Essas proteases tem uma atividade ótima em pH alcalino, e nossos resultados indicam uma regulação defectiva do gene pacC de T. rubrum na ativação de proteases. Em conclusão, através do uso de SSH foi possível identificar genes de T. rubrum ativados após tratamentos específicos, o que sugere a importância dos mesmos na interação dermatófito-hospedeiro, instalação e manutenção da doença. Esses resultados disponibilizam novos dados sobre T. rubrum que levarão a um melhor entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos no crescimento, metabolismo geral e patogenicidade, e também auxiliar na identificação de novos e efetivos alvos de drogas para dermatófitos. / Dermatophytes are a group of fungi filamentous that have the ability to invade keratinized substrates, causing dermatophytosis in humans and animals and only penetrate deeper if the host is immunocompromised. Trichophyton rubrum is an anthropophilic and cosmopolitan fungi, the most common agent of superficial mycoses, which uses cell components such as proteins and lipids after a specific regulation of its gene expression governed by pH environment and sensing cell. The virulence T. rubrum is related to secretion of proteolytic enzymes, an important factor determinant in the invasion, utilization and subsequently dissemination through the stratum corneum. The aim of this study was to indentify by Suppression Subtractive Hybridization (SSH) T. rubrum genes preferentially expressed during growth in the presence of keratin and lipids, upregulated when this fungus degrades carbon source typically found at epidemic cells. Initially, this work evaluated the changes in the extracellular pH during its growth in keratin and lipid (after 6, 12, 24, 48, 72 h and 7 days) at initial pH 5.0, where we observed a gradual increase of basal pH under both tests when compared to glucose condition (control). Also, we identified 576 T. rubrum transcripts differentially expressed by SSH using conidia cultivated for 72 h in keratin as tester, and in glucose as driver. The T. rubrum genes upregulated encode putative proteins that were validated by cDNA dot-blot and northern blot, showing similarity to fungi proteins involved in basic metabolism, growth and virulence, i.e., transporters ABC-MDR, MFS and ATPase of copper, permease, NIMA interactive protein, Gag-Pol polyprotein, virulence factors serine-protease subtilisins (Sub 3 and 5) and metalloproteases (Mep 3 and 4) and Hsp30. Additionally, among the 762 clones obtained in a library of lipid condition (72 h), 80 over-expressed transcripts were confirmed by cDNA dot-blot, revealing 14 unigenes similar to proteins of several pathogenic organisms, like glicoprotein 43 kD, MDR transporters, G protein, chitin synthase and serine/threonine-protein phosphatase. Transcripts of TruMDR2 gene, encoding an ABC transporter in T. rubrum, were isolated in the presence of keratin and lipid, and the examination of TruMDR2 mutant T. rubrum showed a reduction in infecting activity, characterized by low growth in human nails compared to wild-strain. The high expression of transporter by T. rubrum in conditions that mimetize the infection and the virulence reduction of TruMDR2 in an in vitro model suggests that transporters are involved in T. rubrum pathogenicity. Another mutant, pacC-1 with a knockout in PacC gene that encodes a transcription factor regulated by local pH, showed the expression of proteases (Sub 3, Sub 5 and Mep 4) decreased after growth in keratin (72 h) in comparison to wild-strain in northern blot analyzes. These proteases have an optimal activity in alkaline pH, and our results indicate a defective regulation of T. rubrum pacC gene in the activation of proteases. In conclusion, by means of SSH to identify genes upregulated in T. rubrum after specific treatments, their importance in the dermatophyte-host interaction, installation and maintenance in the disease is suggested. These results provide new insights about T. rubrum that will contribute to a better understanding of molecular mechanisms about the growth, metabolism and pathogenicity, and may also aid in the identification of novel effective drug targets for dermathophytes.

O patógeno Trichophyton rubrum é um fungo queratinofílico e o principal agente de micoses cutâneas humanas. O processo de degradação de substratos queratinizados por dermatófitos está relacionado com a alcalinização do ambiente, o que modula a expressão e a secreção de enzimas responsáveis pela captação e utilização dos nutrientes presentes no microambiente hospedeiro. Essa modulação do pH parece determinante para o sucesso do processo infeccioso, quando o fungo se depara com o pH ácido da pele humana. A hipótese deste trabalho foi verificar se há influência do pH e da fonte nutricional na modulação da expressão de genes de T. rubrum que codificam proteínas envolvidas nos processos de autofagia (atg8 e atg15), adesão celular (sowgp) e de alguns fatores de transcrição (pacC, bZIP/cys-3 e nuc-1), e se estes processos estão relacionados à patogenicidade deste dermatófito. De modo a avaliar a modulação da expressão destes genes na patogenicidade e sobrevivência fúngica, T. rubrum foi cultivado em meios de cultura tamponados (pH 5,0 e pH 8,0) e não tamponados, contendo glicose, glicina, glicose com glicina, ou queratina como fonte nutricional. Os genes envolvidos no processo de autofagia também foram avaliados na presença do inibidor de autofagia 3-metiladenina (3-MA). Além disso, o perfil transcricional destes genes de T. rubrum foi avaliado durante a interação ex vivo com unha e pele humana. As análises demonstraram a influência concomitante da fonte nutricional e do pH ambiente na modulação da expressão dos transcritos gênicos estudados nas diferentes linhagens de T. rubrum utilizadas neste trabalho (CBS, H6 e pacC-1). Nossos resultados revelaram que o crescimento destas linhagens é maior na fonte nutricional queratina, quando comparado com as outras fontes nutricionais (glicose e glicina), havendo uma diferença na taxa de crescimento entre as linhagens neste substrato preferencial. Os genes bZIP/cys-3 e nuc-1 apresentaram perfil de expressão semelhante, mais elevada durante cultivos longos, respondendo a condições de estresse nutricional e pH alcalino, sugerindo a participação dos mesmos nos processos de crescimento e sobrevivência do fungo. Além disso, mecanismos regulatórios diferentes destes genes devem ocorrer nas três linhagens de T. rubrum em relação ao crescimento na fonte nutricional queratina. A variação transcricional do gene pacC em resposta às diferentes fontes nutricionais sugere que sua expressão depende das condições nutricionais encontradas por esse fungo, sendo o pH uma resposta secundária. Nossos resultados sugerem ainda que a via de autofagia seja importante para o desenvolvimento e sobrevivência de T. rubrum nestes substratos, e que o FT PacC atue regulando um dos pontos deste processo, visto que o gene atg15 apresenta um perfil semelhante de expressão ao gene pacC, e o gene atg8 tem perfil antagônico de expressão nas linhagens H6 e pacC-1, nas condições avaliadas neste trabalho. 3-MA inibiu a transcrição dos genes atg8 e atg15 em T. rubrum de modo especifico, e por consequência a via de macroautofagia. Os dados de expressão de sowgp sugerem que essa molécula atue durante a privação nutricional e situações de estresse pelo dermatófito, provavelmente desempenhando seu papel na progressão e manutenção do processo infeccioso, permitindo a permanência do fungo em tecidos queratinizados, e auxiliando na fixação do fungo ao epitélio humano. Desta maneira, nossos resultados fornecem informações sobre os eventos moleculares envolvidos na regulação da expressão genica durante a adaptação de T. rubrum ao pH, à variação nutricional, e interação com células e moléculas do microambiente hospedeiro. Os resultados revelam o envolvimento do processo de autofagia e de moléculas de adesão no sensoriamento e resposta a variações ambientais, e a modulação dos fatores de transcrição bZIP/Cys-3, Nuc-1 e PacC durante a adaptação de T. rubrum ao pH e à fonte nutricional podem ser importantes na regulação de moléculas necessárias para sua patogenicidade. / The pathogen Trichophyton rubrum is a keratinophylic fungi and the major agent of cutaneous mycosis in humans. The process of degradation of keratinized substrates by dermatophytes is related with environment alkalinization, which modulates the expression and secretion of the enzymes responsible for the acquisition and utilization of nutrients from the host microenvironment. This pH modulation seems to be determinant for the success of the infectious process when the fungus encounters the acidic pH of the human skin. The hypothesis of this study was to determine whether there is influence of ambient pH and nutritional source in the modulation of gene expression of T. rubrum genes coding for proteins involved in the processes of autophagy (atg8 and atg15), cellular adhesion (sowgp) and some transcription factors (pacC, bZIP/cys-3 and nuc-1), and if they are related with the pathogenicity of this dermatophyte. To evaluate the modulation of the expression of these genes in fungal pathogenicity and survival, T. rubrum was cultivated in buffered (pH 5.0 and pH8.0) or non-buffered media, containing glucose, glycine, glucose and glycine, or keratin as nutrient source. The autophagy-related genes were also analyzed in the presence of 3- methyladenine (3-MA) autophagy inhibitor. Moreover, the transcriptional profile of these genes was evaluated during T. rubrum ex vivo interaction with human nail and skin. The analyses demonstrate the simultaneous influence of the nutritional source and environment pH in the modulation of gene transcription in the different T. rubrum strains evaluated here (CBS, H6 and pacC-1). Our results revealed that growth of these strains is higher in keratin source, compared with other nutrient sources (glucose or glycine), and that they present different growth rates in this preferential substrate. The genes bZIP/cys-3 and nuc-1 presented a similar expression profile, which is higher during longer periods of growth, responding to nutritional stress and alkaline pH, suggesting their involvement in fungal growth and survival. Also, different regulatory mechanisms of these genes in these three T. rubrum strains might be implicated during keratin degradation. The transcriptional variation in the pacC gene in response to different nutritional sources, suggests that its expression is dependent on the nutritional conditions, being the ambient pH a secondary response. Furthermore, our results indicate that the autophagy pathway is important for T. rubrum survival and development during nutrient and pH adaptation, and that PacC might regulates some points of this process, since atg15 and pacC genes presented a similar expression profile, and atg8 has antagonistic expression profiles in the H6 and pacC-1 strains, in the conditions evaluated here. 3-MA inhibited the transcription of atg8 and atg15 T. rubrum genes in a specific manner, and thus inhibited the macroautophagy process. The expression profile of the sowgp gene suggests that this molecule is important during nutrient starvation and stress situation, probably having a role in the progression and maintenance of the infectious process, allowing fungal maintenance in the host keratinized tissues, contributing to fungal adherence to human epithelia. Taken together, our results provide insights into the molecular events involved in the regulation of gene expression during T. rubrum adaptation to pH, nutritional variation and interaction with the host cells and molecules. Our data reveals the involvement of the autophagy process and adhesion molecules in sensing and response of environmental changes, and the modulation of the bZIP/Cys-3, Nuc-1 and PacC transcription factors during T. rubrum adaptation to pH and nutrient source might be important in the regulation of molecules required for its pathogenicity.

Os dermatófitos são um grupo de fungos que têm a capacidade de invadir o tecido queratinizado (pele, pêlos e unhas) de seres humanos e animais para produzir uma infecção denominada de dermatofitose. O Trichophyton rubrum é o principal patógeno causador de dermatofitose. As lesões causadas por estas espécies são crônicas e de carater pouco inflamatória. A doença apresenta evolução lenta e pacientes cronicamente infectados não respondem bem a terapia antifúngica. Assim como na maioria dos patógenos, o sistema imune inato é determinante na resposta antifúngica. Neutrófilos, macrófagos e células dendríticas constituem as células efetoras do sistema imune. A resposta imune aos dermatófitos ainda não está bem elucidada. Atualmente é aceito que a resposta imune mediada por células é responsável pelo controle da infecção. Poucos estudos têm focado a resposta imune inata a esses fungos. Assim, fomos estudar a interação de células dendríticas de pacientes com dermatofitose com conídios de T. rubrum. Nossos resultados mostraram que células dendríticas derivadas de monócitos (CDDM) foram capazes de fagocitar conídios de T. rubrum e ainda verificamos que estas células permaneceram viáveis após fagocitose. Quando analisamos a viabilidade dos conídios de T. rubrum, após 24 e 48 horas de interação com CDDM, verificamos que após 48horas houve um aumento no número de conídios viáveis quando estes foram fagocitados por células de pacientes, mostrando que CDDM de paciente não conseguem matar os conídios após fagocitose. Avaliamos a liberação de óxido nítrico por CDDM e a análise dos resultados mostrou que não houve diferença significativa na liberação de NO pela CDDM na presença de conídio de T. rubrum. Analisamos a expressão de moléculas co-estimulatórias como CD80, CD86, CD83, CD40 e HLA-DR em pacientes com dermatofitose e em indivíduos controle, observamos que não houve diferença na expressão dessas moléculas na presença de conídios de T. rubrum quando comparadas com culturas de CDDM sem conídios. Entretanto, houve uma diminuição do número de células de pacientes que expressam estas moléculas na presença de conídio de T. rubrum. Foi detectado um aumento significativo na secreção de TNF-α e de IL-12 pelas CDDM de pacientes quando em contato com conídio de T. rubrum. Avaliamos a capacidade das CDDM de indivíduos controle e pacientes pulsadas com concentrações crescentes de tricofitina em ativar linfócitos T CD4 e também verificamos o perfil de citocinas secretadas pelos linfócitos T CD4 após proliferação. Os resultados demonstraram que as CDDM foram capazes de estimular a proliferação de linfócitos somente em pacientes com dermatofitose. Foi detectado um aumento significativo na secreção de IL-4 pelos LT CD4 de indivíduos controle. Nossos resultados sugerem uma diferença no perfil de secreção de citocinas em indivíduos controle e pacientes. Indivíduos controle não produzem IL-12 e estimulam preferencialmente linfócitos T CD4 secretores de IL-4. Por outro lado, células dendríticas de pacientes produzem IL-12 e induzem a ativação de linfócitos T produtores de IL-4 e IL-10 / The dermatophytes are a group of fungi that have the capacity to invade the keratinized tissue (skin, hair and nails) of humans and animals to produce an infection called dermatophytosis. The Trichophyton rubrum is the main causative pathogen of dermatophytosis. Injuries caused by these species are chronic inflammatory and little character. The disease shows slow evolution and chronically infected patients do not respond well to antifungal therapy. Like most pathogens, the innate immune system is crucial in the antifungal response. Neutrophils, macrophages and dendritic cells are the effector cells of the immune system. The immune response to dermatophytes is not yet well elucidated. Currently it is accepted that the immune response mediated by cells is responsible for controlling the infection. Few studies have focused on the innate immune response to these fungi. Thus, we study the interaction of dendritic cells from patients with dermatophytosis with conidia of T. rubrum. Our results showed that dendritic cells derived from monocytes (CDDM) were capable of phagocytosed conidia of T. rubrum and found that these cells remained viable after phagocytosis. When we analyze the viability of conidia of T. rubrum after 24 and 48 hours of interaction with CDDM shows that after 48hours an increase in the number of viable conidia when they were phagocytized by cells of patients, showing that CDDM not kill the patient after the conidia phagocytosis. Evaluated the release of nitric oxide by CDDM and analysis of results showed that there was no significant difference in the release of NO by CDDM in the presence of conidia of T. rubrum. We analyzed the expression of co-stimulatory molecules such as CD80, CD86, CD83, CD40 and HLA-DR in patients with dermatophytosis and in control subjects, we observed that there was no difference in expression of these molecules in the presence of conidia of T. rubrum compared with cultures of CDDM without conidia . However, there was a decrease in the number of cells of patients who express these molecules in the presence of conidia of T. rubrum. It was observed a significant increase in the secretion of TNF-α and IL-12 by CDDM of patients when in contact with conidia of T. rubrum. Evaluate the capacity of individuals to control and CDDM patients pulsed with increasing concentrations of trichophytin to activate CD4 T lymphocytes and also see the profile of cytokines secreted by CD4 + T lymphocytes after proliferation. The results showed that the CDDM were able to stimulate the proliferation of lymphocytes only in patients with dermatophytosis. We observed a significant increase in the secretion of IL-4 by CD4 L T to control individuals. Our results suggest a difference in the profile of secretion of cytokines in control subjects and patients. Control subjects did not produce IL-12 and preferentially stimulate CD4 T lymphocytes secreting IL-4. Furthermore, dendritic cells of patients produce IL-12 and induce the activation of T lymphocytes producing IL-4 and IL-10

O dermatófito Trichophyton rubrum é um fungo filamentoso, queratinofílico e antropofílico, sendo o principal agente etiológico de micoses cutâneas em humanos. Sua distribuição cosmopolita e seu acometimento grave em pacientes imunocomprometidos fazem dele um dos desafios a ser enfrentado pelos serviços de saúde pública mundial. As interações patógeno-hospedeiro envolvem diferentes processos relacionados com a degradação de queratina e com modificações metabólicas que permitem sua adesão e posterior penetração nos tecidos infectados. Essas alterações são importantes para o sucesso do processo infeccioso e envolvem mecanismos que modulam a expressão gênica, a secreção de proteínas específicas, a adaptação metabólica e as alterações no pH cutâneo, fundamentais para o estabelecimento da infecção. Dentre as proteínas que participam do processo de interação patógeno-hospedeiro estão as proteínas de choque térmico HSPs (Heat Shock Proteins), relacionadas aos mais diversificados processos celulares. Nesse sentido, a hipótese desse trabalho foi avaliar se os genes hsps de T. rubrum, bem como seu principal fator de transcrição (Hsf1), estão envolvidos nos processos de resposta a situações adversas e na interação com o microambiente hospedeiro, e se estes genes são modulados pelo fator de transcrição pacC, um regulador envolvido na sinalização do pH ambiente. Para tanto, a expressão dos genes hsps foi analisada em resposta ao cultivo de T. rubrum em diferentes meios de cultura, durante a exposição a antifúngicos, estresse térmico e interação com fragmentos de unha e pele humanas. O envolvimento da Hsp90 na modulação da expressão gênica, na suscetibilidade a antifúngicos e na interação de T. rubrum com fragmentos de unha humana foi avaliado utilizando-se um inibidor químico específico para esta proteína. Os resultados indicam uma expressão variável dentre os genes hsps e até mesmo dentro de cada família HSP, em resposta a cada condição ambiental ou interação a que o fungo foi exposto. Além disto, temos indício de que a expressão dos genes hsps seja modulada pelo fator de transcrição PacC, através da modulação do fator de transcrição Hsf1. Constatamos ainda, a influência de Hsp90 na susceptibilidade de T. rubrum às drogas Itraconazol e Micafungina, e no desenvolvimento de T. rubrum em fragmentos de unha humana. Esses resultados revelam a participação das proteínas HSPs em diversos aspectos do metabolismo de T. rubrum, e sugerem a participação de Hsp90 na patogenicicade e na suscetibilidade a drogas deste dermatófito / The dermatophyte Trichophyton rubrum is a filamentous, keratinophilic, and anthrophophilic fungi, being the major etiologic agent of cutaneous mycoses in humans. Its cosmopolitan distribution and the severe infection in immunocompromised patients make it one of the challenges to be faced by public health agencies worldwide. Hostpathogen interactions involve different processes related to keratin degradation and metabolic changes that allow adhesion and subsequent penetration of the infected tissue. These changes are important to the success of the infectious process and involve mechanisms that modulate gene expression, secretion of specific proteins, and metabolic adaptation, and cutaneous pH changes, essential to the establishment of the infection. Among the proteins that participate in the host-pathogen interaction are the heat shoch proteins (HSPs), related to diverse cellular processes. Thus, the hypothesis of this work was to evaluate whether T. rubrum hsp genes, as well as their major transcription factor (Hsf1), are involved in the response to adverse situations and in the interaction with the host microenvironment, and if these genes are regulated by the transcription fator PacC, a regulator of the pH signaling pathway. The expression of the hsp genes was evaluated in response to the cultivation of T. rubrum in different culture medium, during exposure to antifungal drugs, heat stress, and interaction with human nail and skin. The involvement of T. rubrum Hsp90 in the modulation of gene expression, susceptibility to antifungal drugs, and interaction with human nails was evaluated by using a chemical inhibitor, specific to this protein. Our results indicate a variable expression of the hsp genes, even among members of the same HSP family, in response to each environmental condition or interaction, to which the fungus was exposed. Furthermore, we have evidence that the hsp gene expression is modulated by the PacC transcription factor, by modulating the expression of the Hsf1 coding gene. We also found that Hsp90 is involved in T. rubrum susceptibility to the drugs Itraconazole and Micafungin, and in the development of this dermatophyte in human nails. These results reveal the involvement of HSPs in several aspects of T. rubrum metabolism, suggesting a role for Hsp90 in the pathogenicity and drug susceptibility in this dermatophyte

Infecções microbianas podem ser causadas por bactérias, fungos, vírus, parasitas e algas. O presente estudo avaliou a atividade in vitro de formulações de lípides catiônicos contra bactérias multirresistêntes (MRs), fungos e microalgas de interesse médico humano e veterinário. A atividade biocida de bicelas de brometo de dioctadecildimetilamônio (DBB) foi avaliada contra bactérias gram-negativas produtoras de β-lactamases de amplo espectro e carbapenemases mundialmente disseminadas. Para fungos (Candida albicans, Trichophyton rubrum) e microalgas (Prototheca zopfii), a atividade biocida de DBB, sem e com a associação a drogas antifúngicas (ex., miconazol, terbinafina e anfotericina B), foi avaliada determinando-se adicionalmente a atividade sinérgica. Nanodispersões catiônicas de DBB exibiram atividade bactericida, fungicida e algicida, mesmo para patógenos MRs, sendo que a sua associação com outros antimicrobianos resultou em uma atividade sinérgica que poderia favorecer a produção de formulações com potencial para aplicação clínica humana e veterinária. / Microbial infections can be caused by bactérias, fungi, virus, parasites and algae. This study evaluated in vitro activity from cationic lipds formulations against multiresistant bacterias (MRs), fungi and e microalgae from human and veterinary. The Biocidal activity from bromide dioctadecildimetilammonium biceles (DBB) was evaluated against gram-negative bactérias β-lactamases producers and carbapenemases from broad spectrum with wide spread dissemination. For fungi (Candida albicans, Trichophyton rubrum) and microalgae (Prototheca zopfii), the biocidal activity from DBB wuth and without antifungal drugs (ex., miconazole, terbinafine e amphotericin B), was also evaluated by synergistic activity. Cationic nanodispertions of DBB has shown bactericidal, fungicidal and algicidal activity, even for MRs patogens, thus , the association with the others antimicrobials resulted in a synergistic activity wich could foment the production of the formulations with a potential application in human and veterinary medicine.