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Imagerie moléculaire de la neuroinflammation : evaluation préclinique d'un nouveau radiopharmaceutique : le CLINDE. / Molecular imaging of neuroinflammation : preclinical evaluation of a new radiopharmaceutical : cLINDEArlicot, Nicolas 08 December 2009 (has links)
La protéine translocatrice 18kDa (TSPO), en reflétant l’activation microgliale et la neuroinflammation, est actuellement reconnue comme un marqueur sensible de la survenue d’événements pathologiques dans le cerveau. Par conséquent, la TSPO est une cible privilégiée pour l’étude des pathologies du cerveau par imagerie moléculaire (TEP/TEMP). Il y a actuellement un manque d’outils efficaces pour explorer la neuroinflammation en TEMP. Notre objectif a donc été d’évaluer un nouveau radiopharmaceutique de forte affinité pour la TSPO, utilisable en TEMP : le CLINDE, dans deux modèles animaux : l’excitotoxicité focale et l’ischémie cérébrale. Dans ces deux modèles, les études ex vivo ont mis en évidence une accumulation préférentielle du [125I]-CLINDE dans les régions cérébrales lésées, riches en cellules microgliales. De plus, nous avons observé une relation quantitative entre l’intensité de la lésion cérébrale et la fixation du radiopharmaceutique. Le CLINDE apparaît donc comme un candidat très prometteur pour l’imagerie TEMP de la neuroinflammation en recherche clinique. / The 18kDa Translocator protein (TSPO) is currently the most reliable marker for pathological events in the brain, reflecting microglial activation and neuroinflammation, which are linked to neuronal damage. Thereby, TSPO is a potential target to evaluate neuroinflammatory changes in a variety of brain diseases by molecular imaging (PET/SPECT). To date, there is a lack of effective tool to explore neuroinflammation by SPECT. Our aim was to evaluate a new high-affinity ligand for TSPO SPECT imaging: the CLINDE, in two rodent models: focal excitotoxicity and cerebral ischemia. In both animal models, ex vivo studies highlighted preferential localisation of [125I]-CLINDE accumulation in cerebral area that also expressed activated microglial cells as assessed by immunohistochemical staining. Moreover, we found a quantitative relationship between the intensity of brain damages and radiotracer binding, making CLINDE an attractive radioionidated candidate for imaging neuroinflammation by SPECT in clinical setting.
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A translocator protein 18 kDa agonist protects against cerebral ischemia/reperfusion injuryLi, Han-Dong, Li, Minshu, Shi, Elaine, Jin, Wei-Na, Wood, Kristofer, Gonzales, Rayna, Liu, Qiang 28 July 2017 (has links)
Background: Cerebral ischemia is a leading cause of death and disability with limited treatment options. Although inflammatory and immune responses participate in ischemic brain injury, the molecular regulators of neuroinflammation after ischemia remain to be defined. Translocator protein 18 kDa (TSPO) mainly localized to the mitochondrial outer membrane is predominantly expressed in glia within the central nervous system during inflammatory conditions. This study investigated the effect of a TSPO agonist, etifoxine, on neuroinflammation and brain injury after ischemia/reperfusion. Methods: We used a mouse model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) to examine the therapeutic potential and mechanisms of neuroprotection by etifoxine. Results: TSPO was upregulated in Iba1(+) or CD11b(+) CD45(int) cells from mice subjected to MCAO and reperfusion. Etifoxine significantly attenuated neurodeficits and infarct volume after MCAO and reperfusion. The attenuation was pronounced in mice subjected to 30, 60, or 90 min MCAO. Etifoxine reduced production of pro-inflammatory factors in the ischemic brain. In addition, etifoxine treatment led to decreased expression of interleukin-1 beta, interleukin-6, tumor necrosis factor-alpha, and inducible nitric oxide synthase by microglia. Notably, the benefit of etifoxine against brain infarction was ablated in mice depleted of microglia using a colony-stimulating factor 1 receptor inhibitor. Conclusions: These findings indicate that the TSPO agonist, etifoxine, reduces neuroinflammation and brain injury after ischemia/reperfusion. The therapeutic potential of targeting TSPO requires further investigations in ischemic stroke.
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Efeitos do diazepam sobre o crescimento do tumor ascítico de Ehrlich: envolvimento do Receptor Periférico para Benzodiazepínico (PBR) ou Proteína Translocadora (TSPO) / Diazepam effects on Ehrlich ascitic tumor growth: role of Peripheral Benzodiazepine Receptor (PBR) or Translocator Protein (TSPO)Sakai, Mônica 17 August 2009 (has links)
Os benzodiazepínicos são amplamente utilizados devido às suas propriedades ansiolíticas e sedativas mediadas pelo complexo GABAA no Sistema Nervoso Central. Porém, posteriormente foi demonstrado que os mesmos também atuam no Receptor Periférico para Benzodiazepínico (PBR), conhecido atualmente como Proteína Translocadora (TSPO), expresso tanto em células normais como também em células tumorais. O presente trabalho avaliou os efeitos in vivo da administração de diazepam sobre o crescimento do tumor ascítico de Ehrlich em camundongos e o envolvimento da TSPO mediando este efeito. Mais especificamente, estudamos o crescimento tumoral, fases do ciclo e morte celular, assim como a produção de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs) e a expressão de TSPO nas células tumorais, após o tratamento com diazepam, Ro5-4864 ou clonazepam (3,0 mg/kg, via oral, por 7 dias). Quantificou-se também os níveis de diazepam no plasma e no fluido ascítico dos camundongos portadores do tumor. Finalmente, o sequenciamento parcial de Tspo das células do tumor de Ehrlich e a presença de receptores de estrógeno foram avaliadas. Os resultados mostraram que o tratamento in vivo com diazepam aumentou: (1) o crescimento do tumor ascítico de Ehrlich e a porcentagem de células em fase G2-M, (2) a porcentagem de células positivas para anexina e PI, (3) a produção de EROs. No mesmo sentido, o tratamento in vivo com Ro5-4864: (4) Aumentou o crescimento do tumor ascítico de Ehrlich e a porcentagem de células em fase S, (5) Não modificou a porcentagem de morte celular, (6) Aumentou a produção de EROs. Por outro lado, o tratamento in vivo com clonazepam não modificou: (7) quer o crescimento do tumor quer o ciclo celular, (8) a porcentagem de morte celular, (9) a produção de EROs. Além disso, o tratamento in vivo com diazepam não interferiu com a expressão de TSPO (western blot e citometria de fluxo) ou com os valores de Kd e Bmax de PK11195 (binding) presentes nas células do tumor de Ehrlich; entretanto, detectou-se a presença de polímeros, de alta porcentagem de células positivas para TSPO e uma alta afinidade de PK11195 por TSPO. Este mesmo tratamento resultou em níveis quantificáveis de diazepam no plasma e no fluido ascítico de animais portadores do tumor de Ehrlich. Finalmente, o sequenciamento parcial da Tspo presente nas células tumorais revelou 3 mutações nos nucleotídeos, sendo 1 delas silenciosa. Desta forma, estes resultados sugerem que as ações in vivo do diazepam sobre o crescimento do tumor ascítico de Ehrlich ocorram de maneira dependente e direta na TSPO existente em células do tumor de Ehrlich. Essas ações parecem envolver um aumento da produção de EROs e não modificam a expressão de TSPO. Finalmente o padrão farmacológico e bioquímico de expressão de TSPO nas células do tumor de Ehrlich pode indicar um papel dos mesmos na patogênese do câncer. / Benzodiazepines are widely used due to their anxiolitic and sedative properties, acting on specific site coupled to GABAA complex in the Central Nervous System. However, benzodiazepines have been shown to have high affinity for Peripheral Benzodiazepine Receptor site (PBR), now renamed as Translocator Protein (TSPO), expressed in normal cells, and being up-regulated on cancer cells. The present study evaluated the diazepam in vivo effects on Ehrlich ascitic tumor growth in mice and also the TSPO role in mediating this effect. Specifically we evaluated the tumor growth, cell cycle and cell death, and also the Reactive Oxygen Species (ROS) production and TSPO expression on tumor cells after diazepam, Ro5-4864 or clonazepam treatments (3.0 mg/kg, per oral, during 7 days). Furthermore, diazepam levels on plasma and on ascitic fluid taken from Ehrlich ascitic tumor bearing mice were quantified. Finally, the parcial Tspo sequencing on Ehrlich cells and Estrogen Receptor detection was evaluated. Results showed that diazepam in vivo treatment increased: (1) Ehrlich tumor growth and percentage of cells on G2-M phase, (2) percentage of positive cells for both annexin and PI, (3) ROS production. In the same way, Ro5-4864 in vivo treatment: (4) increased Ehrlich tumor growth and percentage of cells on S phase, (5) did not change the percentage of cell death, (6) increased ROS production. On the other hand, clonazepam in vivo treatment did not modify: (7) both Ehrlich tumor growth and cell cycle, (8) the percentage of cell death, and, (9) ROS production. Moreover, the in vivo diazepam treatment did not interfere with TSPO expression (western blot and flow cytometry) or Kd and Bmax values for PK11195 (binding) detected on Ehrlich tumor cells; however, the presence of TSPO polymers, a high percentage of TSPO positive cells and a high PK11195 afinity were found on these cells. This same treatment resulted on diazepam levels that were quantified on plasma and ascitic fluid from Ehrlich tumor bearing mice. Finally, Tspo partial nucleotide sequencing reaveled three point mutations, one of them is silent. Taken together, these data suggest that diazepam in vivo effects on Ehrlich tumor growth are TSPO-dependent. These actions may involve an increase on ROS production and seems not to be related to modifications on TSPO expression on tumor cells. Finally, TSPO pharmacological and biochemical properties on Ehrlich tumor cells are similar to those described in other tumor cells and may indicate a possible role for this protein on cancer pathogenesis.
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Mecanismos de modulação da ANXA1 sobre a função da proteína translocadora (TSPO) em células da glia (OU) Mecanismos de modulação da anexina A1 sobre a função da proteína translocadora em células da glia / Annexin A1 modulation mechanism on the expression of the Translocator Protein (TSPO) in BV2 cells.Pantaleão, Lorena do Nascimento 05 July 2017 (has links)
A inflamação no sistema nervoso central (SNC) está envolvida na gênese de uma série de doenças neurodegenerativas, sendo assim, compreender o processo inflamatório nessas circunstâncias se torna essencial para propor novas abordagens terapêuticas. Sabemos que a Anexina A1 (ANXA1) e o receptor TSPO são dois moduladores importantes da neuroinflamação. Enquanto se sabe que a ANXA1 possui propriedades antiinflamatórias, o papel do TSPO ainda não está esclarecido. Desta forma, este projeto avaliou a atuação da ANXA1 sobre a expressão do TSPO em linhagem de células da microglia (BV2), e sua conexão com o receptor Toll-like receptor-4 (TLR4) em BV2 ativada pelo lipopolisacarídeo de E.coli (LPS). Os resultados obtidos mostram que o tratamento de BV2 com LPS induz a expressão de TSPO, dependente de ativação de TLR4, através das vias da molécula adaptadora do fator de diferenciação mielóide 88 (MyD88) e do fator nuclear κB (NFκB). O tratamento com ANXA1 recombinante induz um perfil antiinflamatório em células BV2 estimuladas com LPS, por reduzir a secreção de citocinas proinflamatórias e, ao mesmo tempo, aumentar secreção de citocinas antiinflamatórias. A exposição com ANXA1 ainda impede o aumento da expressão de TSPO induzida pelo LPS. Mostramos também que esta ação da ANXA1 é dependente da interação com o receptor de peptídeo formilado (FPR2). Adicionalmente, o silenciamento de TSPO em células BV2 predispõe essas células a um perfil ativado exacerbando a secreção do fator de necrose tumoral (TNFα) em resposta ao LPS, o que não pode ser revertido pelo tratamento com ANXA1 recombinante. Em conjunto, os resultados expõe a relação existente entre ANXA1 e TSPO em micróglia ativada pelo LPS, mostrando que a ANXA1 9 modula negativamente a expressão do TSPO. Ademais, o silenciamento de TSPO inibiu a fagocitose de neurônios apoptóticos, o que ainda sugere a participação do TSPO na eferocitose. / Inflammation in the Central Nervous System (CNS) is involved in the genesis of a number of neurodegenerative diseases, so understanding the inflammatory process in these circumstances is essential to proposal new therapeutic approaches. We know that Annexin A1 (ANXA1) and the TSPO receptor are two important modulators of neuroinflammation. While it is known that ANXA1 has anti-inflammatory properties, the role of TSPO has not yet been clarified. Thus, this project evaluated the interference of ANXA1 on the expression of TSPO in microglia cell line (BV2), and its connection with the Toll-like receptor-4 receptor (TLR4) in BV2 activated by E. coli lipopolysaccharide LPS). The results show that the treatment of BV2 with LPS induces the expression of TSPO, dependent on activation of TLR4, through the pathways of the adapter molecule of myeloid differentiation factor 88 (MyD88) and nuclear factor κB (NFκB). Treatment with recombinant ANXA1 induces an anti-inflammatory profile in LPS-stimulated BV2 cells, by reducing the secretion of proinflammatory cytokines and, at the same time, increasing secretion of anti-inflammatory cytokines. Exposure with ANXA1 still prevents the increase of LPS-induced TSPO expression. We also show that this action of ANXA1 is dependent on the interaction with the formylated peptide receptor (FPR2). In addition, TSPO silencing in BV2 cells predisposes these cells to an activated profile exacerbating secretion of tumor necrosis factor (TNFα) in response to LPS, which can not be reversed by treatment with recombinant ANXA1. Together, the results show the relationship between ANXA1 and TSPO in LPS activated microglia, showing that ANXA1 negatively modulates TSPO 11 expression. In addition, TSPO silencing inhibited the phagocytosis of apoptotic neurons, which still suggests the participation of TSPO in eferocytosis.
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Efeitos dos ligantes de TSPO sobre a migração leucocitária: participação de receptores de glicorticóides / Effects of TSPO ligands on leukocyte migration: role of glucocorticoids receptorsLima, Camila Bento de 15 February 2012 (has links)
Além dos receptores no sistema nervoso central (SNC), acoplados a receptores GABAA (CBR - central benzodiazepine receptor), outros sítios periféricos de ligação para os benzodiazepínicos (BDZ) foram descritos e denominados de \"periféricos\" (PBR peripheral benzodiazepine receptor) ou TSPO - Translocator protein. Sua função como modulador do sistema imune tem sido proposta, com a participação, pelo menos em parte, de glicocorticóides endógenos (GE). No entanto, os mecanismos da modulação dos TSPO sobre o processo inflamatório e a relação destes receptores com os GE ainda não estão totalmente estabelecidos. Desta forma, este trabalho visou investigar os efeitos de dois ligantes sintéticos de TSPO, um benzodiazepínico, Ro5-4864, e uma isoquinolona carboxamida, PK 11195, e suas relações com os GE, sobre os eventos da migração leucocitária. Para tanto, ratos Wistar machos foram tratados in vivo com RU 38486 (antagonista de receptor de GE) ou com veículo e, adicionalmente, os ligantes de TSPO, Ro5-4864 e/ou PK 11195, foram aplicados topicamente sobre a microcirculação do mesentério dos animais para avaliação do comportamento rolling e aderência de leucócitos, por microscopia intravital, em condições basais ou após estimulação pelo peptídeo formil-metionil-leucilfenilalanina (fMLP). Leucócitos periféricos foram coletados e tratados in vitro com os ligantes de TSPO para avaliação da expressão de moléculas de adesão, quimiotaxia e influxo de cálcio em condições basais ou após estimulação pelo fMLP. Ainda, culturas primárias de células endoteliais da microcirculação de ratos foram tratadas in vitro com os ligantes de TSPO para avaliação da expressão de moléculas de adesão em condições basais ou após estimulação pelo lipopolisacarídeo de E.coli (LPS). Os resultados obtidos mostraram que: 1) o ligante de TSPO, Ro5-4864, alterou a ação do fMLP, uma vez que inibiu a diminuição do rolling, o aumento de células aderentes, a clivagem de L-selectina, o aumento de expressão de PECAM-1 (platelet endothelial cell adhesion molecule), a quimiotaxia e o influxo de cálcio em neutrófilos; não afetou a expressão de PECAM-1 e ICAM-1 (intracellular cell adhesion molecule) induzida pelo LPS em células endoteliais; 2) o PK 11195 aumentou o influxo de cálcio e a quimiotaxia de neutrófilos induzido pelo fMLP; 3) a co-administração dos ligantes de TSPO, Ro5-4864 e PK 11195, reverteu os efeitos do Ro5-4864 sobre a expressão de L-selectina e PECAM-1, o influxo de cálcio e a quimiotaxia de neutrófilos. A possível inter-relação dos TSPO e GE foi verificada uma vez que o Ro5-4864 inibiu o aumento do número de leucócitos rolling e aderidos à parede vascular in vivo causado pelo tratamento com RU 38486; inibiu o aumento da expressão de L-selectina em neutrófilos e de β2-integrina presente em linfócitos e de PECAM-1 em neutrófilos. Ainda, foi verificado que neutrófilos possuem expressões de TSPO maiores que linfócitos e células endoteliais e que esta expressão é aumentada em neutrófilos pela ação do fMLP. Em conjunto, os resultados obtidos neste trabalho sugerem que os ligantes de TSPO modulam diferentemente as funções de adesão e mobilidade de leucócitos e de adesão da célula endotelial e que uma relação alostérica de agonismo/antagonismo entre estes pode ser sugerida. Adicionalmente, os resultados mostram uma possível relação entre os TSPO e os receptores de citoplasmáticos de GE no controle da interação leucócito-endotélio. / Besides central benzodiazepine receptor (CBR) found on central nervous system (CNS) coupled to GABAA, another binding site for benzodiazepines was described and named peripheral benzodiazepine receptor (PBR) or Translocator protein (TSPO). The mainly function described to this TSPO is steroidogenesis. Additionally, its function as an immune modulator has been proposed with the involvement, at least in part, of endogenous glucocorticoids (EG). However, mechanisms of TSPO modulation on inflammatory process and the relation between the receptor and EG has not been totally established. This study aimed investigates effects of two synthetic TSPO ligands, a benzodiazepine, Ro5-4864, and an isoquinoline carboxamide, PK 11195, and their relation with EG on leukocyte migration. For this purpose, male Wistar rats were in vivo treated with RU 38486 (EG antagonist receptor) or vehicle and, in addition, TSPO ligands, Ro5-4864 and/or PK 11195, were topically applied on animal mesentery microcirculation to evaluate leukocyte rolling and adhesion, by intravital microscopy, under basal conditions or after stimulation by N-formyl-methionine-leucine-phenylalanine (fMLP). In addition, peripheral leukocytes were collected and in vitro treated with TSPO ligands to evaluate adhesion molecules expression, chemotaxis and calcium influx. Endothelial cells obtained from cremaster muscle were in vitro treated with TSPO ligands to evaluate adhesion molecules expression under basal conditions or after stimulation by lipopolysaccharide from E.coli (LPS). Our results showed that: 1) TSPO ligand, Ro5-4864, altered the fMLP action since TSPO ligand inhibited the decrease of rolling, the increase of adherent cells, L-selectin cleavage, the increase of PECAM-1 expression, neutrophil chemotaxis and calcium influx; did not affect expression of PECAM-1 and ICAM-1 induced by LPS on endothelial cells; 2) PK 11195 increased fMLP-induced neutrophil calcium influx and chemotaxis; 3) co-administration of TSPO ligands, Ro5-4864 and PK 11195, reverted Ro5-4864 effects on L-selectin and PECAM-1 expression, neutrophil and calcium influx, as well as PECAM-1 and ICAM-1 expression on endothelial cells; 3) a possible inter-relation between TSPO and EG was observed since Ro5-4864 inhibited the increase of in vivo leukocyte rolling and adhesion induced by RU 38486 in vivo treatment; it inhibited the increase of neutrophil L-selectin, lymphocyte β2-integrin and leukocyte PECAM-1 expressions; 4) It was showed that neutrophil have more TSPO than lymphocytes and endothelial cells, and this expression is increased by fMLP stimulation. Taken together, our results suggest that TSPO ligands differently modulate leukocyte adhesion and motility functions and endothelial cells adhesion, and further, they suggest an allosteric agonist/antagonist relation. Additionally, they showed a relation between TSPO and EG cytoplasmic receptor on the control of leukocyte-endothelial interaction.
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Efeitos do diazepam sobre o crescimento do tumor ascítico de Ehrlich: envolvimento do Receptor Periférico para Benzodiazepínico (PBR) ou Proteína Translocadora (TSPO) / Diazepam effects on Ehrlich ascitic tumor growth: role of Peripheral Benzodiazepine Receptor (PBR) or Translocator Protein (TSPO)Mônica Sakai 17 August 2009 (has links)
Os benzodiazepínicos são amplamente utilizados devido às suas propriedades ansiolíticas e sedativas mediadas pelo complexo GABAA no Sistema Nervoso Central. Porém, posteriormente foi demonstrado que os mesmos também atuam no Receptor Periférico para Benzodiazepínico (PBR), conhecido atualmente como Proteína Translocadora (TSPO), expresso tanto em células normais como também em células tumorais. O presente trabalho avaliou os efeitos in vivo da administração de diazepam sobre o crescimento do tumor ascítico de Ehrlich em camundongos e o envolvimento da TSPO mediando este efeito. Mais especificamente, estudamos o crescimento tumoral, fases do ciclo e morte celular, assim como a produção de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs) e a expressão de TSPO nas células tumorais, após o tratamento com diazepam, Ro5-4864 ou clonazepam (3,0 mg/kg, via oral, por 7 dias). Quantificou-se também os níveis de diazepam no plasma e no fluido ascítico dos camundongos portadores do tumor. Finalmente, o sequenciamento parcial de Tspo das células do tumor de Ehrlich e a presença de receptores de estrógeno foram avaliadas. Os resultados mostraram que o tratamento in vivo com diazepam aumentou: (1) o crescimento do tumor ascítico de Ehrlich e a porcentagem de células em fase G2-M, (2) a porcentagem de células positivas para anexina e PI, (3) a produção de EROs. No mesmo sentido, o tratamento in vivo com Ro5-4864: (4) Aumentou o crescimento do tumor ascítico de Ehrlich e a porcentagem de células em fase S, (5) Não modificou a porcentagem de morte celular, (6) Aumentou a produção de EROs. Por outro lado, o tratamento in vivo com clonazepam não modificou: (7) quer o crescimento do tumor quer o ciclo celular, (8) a porcentagem de morte celular, (9) a produção de EROs. Além disso, o tratamento in vivo com diazepam não interferiu com a expressão de TSPO (western blot e citometria de fluxo) ou com os valores de Kd e Bmax de PK11195 (binding) presentes nas células do tumor de Ehrlich; entretanto, detectou-se a presença de polímeros, de alta porcentagem de células positivas para TSPO e uma alta afinidade de PK11195 por TSPO. Este mesmo tratamento resultou em níveis quantificáveis de diazepam no plasma e no fluido ascítico de animais portadores do tumor de Ehrlich. Finalmente, o sequenciamento parcial da Tspo presente nas células tumorais revelou 3 mutações nos nucleotídeos, sendo 1 delas silenciosa. Desta forma, estes resultados sugerem que as ações in vivo do diazepam sobre o crescimento do tumor ascítico de Ehrlich ocorram de maneira dependente e direta na TSPO existente em células do tumor de Ehrlich. Essas ações parecem envolver um aumento da produção de EROs e não modificam a expressão de TSPO. Finalmente o padrão farmacológico e bioquímico de expressão de TSPO nas células do tumor de Ehrlich pode indicar um papel dos mesmos na patogênese do câncer. / Benzodiazepines are widely used due to their anxiolitic and sedative properties, acting on specific site coupled to GABAA complex in the Central Nervous System. However, benzodiazepines have been shown to have high affinity for Peripheral Benzodiazepine Receptor site (PBR), now renamed as Translocator Protein (TSPO), expressed in normal cells, and being up-regulated on cancer cells. The present study evaluated the diazepam in vivo effects on Ehrlich ascitic tumor growth in mice and also the TSPO role in mediating this effect. Specifically we evaluated the tumor growth, cell cycle and cell death, and also the Reactive Oxygen Species (ROS) production and TSPO expression on tumor cells after diazepam, Ro5-4864 or clonazepam treatments (3.0 mg/kg, per oral, during 7 days). Furthermore, diazepam levels on plasma and on ascitic fluid taken from Ehrlich ascitic tumor bearing mice were quantified. Finally, the parcial Tspo sequencing on Ehrlich cells and Estrogen Receptor detection was evaluated. Results showed that diazepam in vivo treatment increased: (1) Ehrlich tumor growth and percentage of cells on G2-M phase, (2) percentage of positive cells for both annexin and PI, (3) ROS production. In the same way, Ro5-4864 in vivo treatment: (4) increased Ehrlich tumor growth and percentage of cells on S phase, (5) did not change the percentage of cell death, (6) increased ROS production. On the other hand, clonazepam in vivo treatment did not modify: (7) both Ehrlich tumor growth and cell cycle, (8) the percentage of cell death, and, (9) ROS production. Moreover, the in vivo diazepam treatment did not interfere with TSPO expression (western blot and flow cytometry) or Kd and Bmax values for PK11195 (binding) detected on Ehrlich tumor cells; however, the presence of TSPO polymers, a high percentage of TSPO positive cells and a high PK11195 afinity were found on these cells. This same treatment resulted on diazepam levels that were quantified on plasma and ascitic fluid from Ehrlich tumor bearing mice. Finally, Tspo partial nucleotide sequencing reaveled three point mutations, one of them is silent. Taken together, these data suggest that diazepam in vivo effects on Ehrlich tumor growth are TSPO-dependent. These actions may involve an increase on ROS production and seems not to be related to modifications on TSPO expression on tumor cells. Finally, TSPO pharmacological and biochemical properties on Ehrlich tumor cells are similar to those described in other tumor cells and may indicate a possible role for this protein on cancer pathogenesis.
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Efeitos dos ligantes de TSPO sobre a migração leucocitária: participação de receptores de glicorticóides / Effects of TSPO ligands on leukocyte migration: role of glucocorticoids receptorsCamila Bento de Lima 15 February 2012 (has links)
Além dos receptores no sistema nervoso central (SNC), acoplados a receptores GABAA (CBR - central benzodiazepine receptor), outros sítios periféricos de ligação para os benzodiazepínicos (BDZ) foram descritos e denominados de \"periféricos\" (PBR peripheral benzodiazepine receptor) ou TSPO - Translocator protein. Sua função como modulador do sistema imune tem sido proposta, com a participação, pelo menos em parte, de glicocorticóides endógenos (GE). No entanto, os mecanismos da modulação dos TSPO sobre o processo inflamatório e a relação destes receptores com os GE ainda não estão totalmente estabelecidos. Desta forma, este trabalho visou investigar os efeitos de dois ligantes sintéticos de TSPO, um benzodiazepínico, Ro5-4864, e uma isoquinolona carboxamida, PK 11195, e suas relações com os GE, sobre os eventos da migração leucocitária. Para tanto, ratos Wistar machos foram tratados in vivo com RU 38486 (antagonista de receptor de GE) ou com veículo e, adicionalmente, os ligantes de TSPO, Ro5-4864 e/ou PK 11195, foram aplicados topicamente sobre a microcirculação do mesentério dos animais para avaliação do comportamento rolling e aderência de leucócitos, por microscopia intravital, em condições basais ou após estimulação pelo peptídeo formil-metionil-leucilfenilalanina (fMLP). Leucócitos periféricos foram coletados e tratados in vitro com os ligantes de TSPO para avaliação da expressão de moléculas de adesão, quimiotaxia e influxo de cálcio em condições basais ou após estimulação pelo fMLP. Ainda, culturas primárias de células endoteliais da microcirculação de ratos foram tratadas in vitro com os ligantes de TSPO para avaliação da expressão de moléculas de adesão em condições basais ou após estimulação pelo lipopolisacarídeo de E.coli (LPS). Os resultados obtidos mostraram que: 1) o ligante de TSPO, Ro5-4864, alterou a ação do fMLP, uma vez que inibiu a diminuição do rolling, o aumento de células aderentes, a clivagem de L-selectina, o aumento de expressão de PECAM-1 (platelet endothelial cell adhesion molecule), a quimiotaxia e o influxo de cálcio em neutrófilos; não afetou a expressão de PECAM-1 e ICAM-1 (intracellular cell adhesion molecule) induzida pelo LPS em células endoteliais; 2) o PK 11195 aumentou o influxo de cálcio e a quimiotaxia de neutrófilos induzido pelo fMLP; 3) a co-administração dos ligantes de TSPO, Ro5-4864 e PK 11195, reverteu os efeitos do Ro5-4864 sobre a expressão de L-selectina e PECAM-1, o influxo de cálcio e a quimiotaxia de neutrófilos. A possível inter-relação dos TSPO e GE foi verificada uma vez que o Ro5-4864 inibiu o aumento do número de leucócitos rolling e aderidos à parede vascular in vivo causado pelo tratamento com RU 38486; inibiu o aumento da expressão de L-selectina em neutrófilos e de β2-integrina presente em linfócitos e de PECAM-1 em neutrófilos. Ainda, foi verificado que neutrófilos possuem expressões de TSPO maiores que linfócitos e células endoteliais e que esta expressão é aumentada em neutrófilos pela ação do fMLP. Em conjunto, os resultados obtidos neste trabalho sugerem que os ligantes de TSPO modulam diferentemente as funções de adesão e mobilidade de leucócitos e de adesão da célula endotelial e que uma relação alostérica de agonismo/antagonismo entre estes pode ser sugerida. Adicionalmente, os resultados mostram uma possível relação entre os TSPO e os receptores de citoplasmáticos de GE no controle da interação leucócito-endotélio. / Besides central benzodiazepine receptor (CBR) found on central nervous system (CNS) coupled to GABAA, another binding site for benzodiazepines was described and named peripheral benzodiazepine receptor (PBR) or Translocator protein (TSPO). The mainly function described to this TSPO is steroidogenesis. Additionally, its function as an immune modulator has been proposed with the involvement, at least in part, of endogenous glucocorticoids (EG). However, mechanisms of TSPO modulation on inflammatory process and the relation between the receptor and EG has not been totally established. This study aimed investigates effects of two synthetic TSPO ligands, a benzodiazepine, Ro5-4864, and an isoquinoline carboxamide, PK 11195, and their relation with EG on leukocyte migration. For this purpose, male Wistar rats were in vivo treated with RU 38486 (EG antagonist receptor) or vehicle and, in addition, TSPO ligands, Ro5-4864 and/or PK 11195, were topically applied on animal mesentery microcirculation to evaluate leukocyte rolling and adhesion, by intravital microscopy, under basal conditions or after stimulation by N-formyl-methionine-leucine-phenylalanine (fMLP). In addition, peripheral leukocytes were collected and in vitro treated with TSPO ligands to evaluate adhesion molecules expression, chemotaxis and calcium influx. Endothelial cells obtained from cremaster muscle were in vitro treated with TSPO ligands to evaluate adhesion molecules expression under basal conditions or after stimulation by lipopolysaccharide from E.coli (LPS). Our results showed that: 1) TSPO ligand, Ro5-4864, altered the fMLP action since TSPO ligand inhibited the decrease of rolling, the increase of adherent cells, L-selectin cleavage, the increase of PECAM-1 expression, neutrophil chemotaxis and calcium influx; did not affect expression of PECAM-1 and ICAM-1 induced by LPS on endothelial cells; 2) PK 11195 increased fMLP-induced neutrophil calcium influx and chemotaxis; 3) co-administration of TSPO ligands, Ro5-4864 and PK 11195, reverted Ro5-4864 effects on L-selectin and PECAM-1 expression, neutrophil and calcium influx, as well as PECAM-1 and ICAM-1 expression on endothelial cells; 3) a possible inter-relation between TSPO and EG was observed since Ro5-4864 inhibited the increase of in vivo leukocyte rolling and adhesion induced by RU 38486 in vivo treatment; it inhibited the increase of neutrophil L-selectin, lymphocyte β2-integrin and leukocyte PECAM-1 expressions; 4) It was showed that neutrophil have more TSPO than lymphocytes and endothelial cells, and this expression is increased by fMLP stimulation. Taken together, our results suggest that TSPO ligands differently modulate leukocyte adhesion and motility functions and endothelial cells adhesion, and further, they suggest an allosteric agonist/antagonist relation. Additionally, they showed a relation between TSPO and EG cytoplasmic receptor on the control of leukocyte-endothelial interaction.
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Mecanismos de modulação da ANXA1 sobre a função da proteína translocadora (TSPO) em células da glia (OU) Mecanismos de modulação da anexina A1 sobre a função da proteína translocadora em células da glia / Annexin A1 modulation mechanism on the expression of the Translocator Protein (TSPO) in BV2 cells.Lorena do Nascimento Pantaleão 05 July 2017 (has links)
A inflamação no sistema nervoso central (SNC) está envolvida na gênese de uma série de doenças neurodegenerativas, sendo assim, compreender o processo inflamatório nessas circunstâncias se torna essencial para propor novas abordagens terapêuticas. Sabemos que a Anexina A1 (ANXA1) e o receptor TSPO são dois moduladores importantes da neuroinflamação. Enquanto se sabe que a ANXA1 possui propriedades antiinflamatórias, o papel do TSPO ainda não está esclarecido. Desta forma, este projeto avaliou a atuação da ANXA1 sobre a expressão do TSPO em linhagem de células da microglia (BV2), e sua conexão com o receptor Toll-like receptor-4 (TLR4) em BV2 ativada pelo lipopolisacarídeo de E.coli (LPS). Os resultados obtidos mostram que o tratamento de BV2 com LPS induz a expressão de TSPO, dependente de ativação de TLR4, através das vias da molécula adaptadora do fator de diferenciação mielóide 88 (MyD88) e do fator nuclear κB (NFκB). O tratamento com ANXA1 recombinante induz um perfil antiinflamatório em células BV2 estimuladas com LPS, por reduzir a secreção de citocinas proinflamatórias e, ao mesmo tempo, aumentar secreção de citocinas antiinflamatórias. A exposição com ANXA1 ainda impede o aumento da expressão de TSPO induzida pelo LPS. Mostramos também que esta ação da ANXA1 é dependente da interação com o receptor de peptídeo formilado (FPR2). Adicionalmente, o silenciamento de TSPO em células BV2 predispõe essas células a um perfil ativado exacerbando a secreção do fator de necrose tumoral (TNFα) em resposta ao LPS, o que não pode ser revertido pelo tratamento com ANXA1 recombinante. Em conjunto, os resultados expõe a relação existente entre ANXA1 e TSPO em micróglia ativada pelo LPS, mostrando que a ANXA1 9 modula negativamente a expressão do TSPO. Ademais, o silenciamento de TSPO inibiu a fagocitose de neurônios apoptóticos, o que ainda sugere a participação do TSPO na eferocitose. / Inflammation in the Central Nervous System (CNS) is involved in the genesis of a number of neurodegenerative diseases, so understanding the inflammatory process in these circumstances is essential to proposal new therapeutic approaches. We know that Annexin A1 (ANXA1) and the TSPO receptor are two important modulators of neuroinflammation. While it is known that ANXA1 has anti-inflammatory properties, the role of TSPO has not yet been clarified. Thus, this project evaluated the interference of ANXA1 on the expression of TSPO in microglia cell line (BV2), and its connection with the Toll-like receptor-4 receptor (TLR4) in BV2 activated by E. coli lipopolysaccharide LPS). The results show that the treatment of BV2 with LPS induces the expression of TSPO, dependent on activation of TLR4, through the pathways of the adapter molecule of myeloid differentiation factor 88 (MyD88) and nuclear factor κB (NFκB). Treatment with recombinant ANXA1 induces an anti-inflammatory profile in LPS-stimulated BV2 cells, by reducing the secretion of proinflammatory cytokines and, at the same time, increasing secretion of anti-inflammatory cytokines. Exposure with ANXA1 still prevents the increase of LPS-induced TSPO expression. We also show that this action of ANXA1 is dependent on the interaction with the formylated peptide receptor (FPR2). In addition, TSPO silencing in BV2 cells predisposes these cells to an activated profile exacerbating secretion of tumor necrosis factor (TNFα) in response to LPS, which can not be reversed by treatment with recombinant ANXA1. Together, the results show the relationship between ANXA1 and TSPO in LPS activated microglia, showing that ANXA1 negatively modulates TSPO 11 expression. In addition, TSPO silencing inhibited the phagocytosis of apoptotic neurons, which still suggests the participation of TSPO in eferocytosis.
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Quantitative analysis of positron emission tomography (PET) with the second generation translocator protein (TSPO) ligand [18F]GE-180Sridharan, Sujata January 2016 (has links)
Background: The 18 kDa translocator protein (TSPO), expressed at a low level in the healthy human central nervous system (CNS), is upregulated in inflammatory brain diseases by activated microglia and other immune cells. Using positron emission tomography (PET) radioligands targeting TSPO, it is possible to localise this signal and map the course of microglial activation and its effects on disease progression. Here, a newly developed second generation TSPO PET ligand, [18F]GE-180, was evaluated in different models of preclinical and clinical neuroinflammatory disease. Methods: A preclinical model of low-level inflammation with lipopolysaccharide (LPS) was designed. Rats were scanned with the first generation TSPO ligand [11C]- (R)-PK11195 and either [18F]GE-180 or [18F]DPA-714, with dual scanning enabling the direct comparison of second generation tracers with [11C]-(R)-PK11195. An arterial blood sampling system for rodent imaging with [18F]DPA-714 was set up and characterised. The performance of [18F]GE-180 was assessed in a clinical study in nine relapsing-remitting multiple sclerosis patients (RRMS) and ten healthy volunteers (HV). A comparison of kinetic modelling approaches for [18F]GE-180 human brain PET data was performed, as well as a longitudinal analysis with intervention using the disease-modifying treatment, natalizumab to evaluate the potential of [18F]GE-180 as a biomarker for therapy monitoring in MS subjects. Finally, the plasma-protein binding behaviour of [18F]GE-180 was evaluated in vitro using ultrafiltration. Results: In LPS animals, [18F]GE-180 produced a significantly higher ipsi- to contralateral uptake ratio and binding potential () than [11C]-(R)-PK11195 (p = 0.03), but [18F]DPA-714 did not. There was no significant difference between animals scanned with [18F]GE-180 and [18F]DPA-714, suggesting no overall superiority of the former. Characterisation of an arterial sampling system for rodent studies with [18F]DPA-714 allowed correction for dispersion effects. A comparison of reference regions showed that a novel externally derived tissue estimated with lower bias than a contralateral reference region. In human [18F]GE-180 brain PET data, the unconstrained two-tissue compartment model (2TCM) best described tracer behaviour in RRMS and HV subjects. Normal appearing white matter (NAWM) in patients was elevated over that of HVs. Standardised uptake values (SUVs) for the tracer in rodents were 0.28±0.12 and 0.84±0.31 in healthy tissue and LPS lesions respectively, and in humans were 0.36±0.04 (HV) and 0.58 (in a gadolinium- enhancing MS lesion). [18F]GE-180 uptake was also significantly reduced in the brains of RRMS subjects treated with natalizumab, correlating with clinically-identified improvement. [18F]GE-180 has a free fraction of between 1 and 8%.Conclusions: [18F]GE-180 shows good brain uptake in the rodent brain and produces superior signal to [11C]-(R)-PK11195, but not to [18F]DPA-714. The 2TCM fits human [18F]GE-180 PET data well, and the tracer is able to identify an elevated signal in RRMS patients compared to healthy subjects. [18F]GE-180 shows a large fraction of non-displaceable binding in human blood, thus further optimisation of kinetic modelling approaches is suggested.
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Metabolic Regulation in Glioblastoma and its Association with Sex-Specific SurvivalTroike, Katie 26 August 2022 (has links)
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