Ce travail de thèse a permis la caractérisation de deux familles de modulateurs mitochondriaux: les analogues de l’alloprégnanolone et les nouveaux ligands synthétiques de la protéine de translocation mitochondriale ou translocator protein (TSPO) impliquée dans la neurostéroidogenèse. Nos résultats clés ont montré que: i) in vitro, BR297, un analogue de l'alloprégnanolone atténue les déficits bioénergétiques liés à la maladie d'Alzheimer et présente un effet protecteur contre le stress oxydatif, en réduisant les espèces réactives de l'oxygène et la mort dans un modèle cellulaire de la maladie d'Alzheimer, avec une plus grande efficacité comparé à l’allopregnanolone; ii) in vivo, premièrement l’effet protecteur de BR297 a été confirmé dans un modèle de souris transgénique de la maladie d’Alzheimer en atténuant les déficits mitochondriaux,puis deuxièmement, BR297 et BR351 ont démontré des effets neuroprotecteurs sur les dysfonctionnements mitochondriaux liés à l'âge par l'amélioration de bioénergétique cellulaire et des activités des complexes mitochondriaux; et iii) in vitro, les ligands TSPO représentent des molécules prometteuses qui sont capables d'augmenter bioénergétique cellulaire avec des effets comparable ou plus important que des molécules de référence dans un modèle cellulaire de la maladie d'Alzheimer. / This PhD work allowed the characterization of two families of mitochondrial modulators: novel analogues of allopregnanolone, and novel synthetic ligands of translocator protein (TSPO) implicated in the neurosteroidogenesis. Our key findings showed that: i) in vitro, BR297, an analog of allopregnanolone alleviated Alzheimer’s disease-related bioenergetics deficits and exhibited protective effects against oxidative stress by reducing reactive oxygen species and decreasing death in a cellular model of Alzheimer’s disease,with a higher effectiveness compared to allopregnanolone; ii) in vivo, firstly the protective effect of BR297 was confirmed in the transgenic Tg2576 mouse model by alleviating the mitochondrial deficits, secondly BR297and another analog BR351 demonstrated neuroprotective effects on age-related mitochondrial dysfunctions via enhancement of cellular bioenergetics and complex activities; and iii) in vitro, TSPO ligands represent promising molecules which are able to increase cellular bioenergetics with similar/ or higher effects compared to different reference molecules in a cellular model of Alzheimer’s disease.

Bien que les mécanismes moléculaires précis à l’origine de la neurodégénérescence dopaminergique ne soient pas encore totalement connus, un ensemble de preuves épidémiologiques, cliniques et expérimentales indiquent que la neuroinflammation peut avoir un rôle important dans la pathogenèse de la MP. L’étude des liens spatio-temporels entre la neuroinflammation et la neurodégénérescence au cours de la MP pourrait améliorer la compréhension du mécanisme physiopathologique et aussi l'accessibilité à un diagnostic précoce et/ou à de nouvelles approches thérapeutiques anti-inflammatoires. Le développement actuel des méthodes non invasives d'imagerie moléculaire permettant la surveillance directe du processus de neuroinflammation devrait être utile à cet effet. La cible moléculaire de choix dans ce domaine est la protéine de 18 kDa translocateur (TSPO), biomarqueur sensible associée à la neuroinflammation, qui est surexprimé dans les microglies activées. Dans le travail présenté ici nous avons réalisé l'évaluation longitudinale des deux mécanismes physiopathologiques en parallèle avec les modifications de la fonction dopaminergique à plusieurs points au cours du temps après lésion à la 6-OHDA chez le rat, modèle qui imite un stade précoce de la MP. Après l'administration unilatérale, intra-striatale de la 6-OHDA, nous avons quantifié l'évolution temporelle de la TSPO, de l’immunoréactivité TH et du DAT dans le striatum et la SNC de 3 à 56 jours post-lésion (jpl). L’augmentation de la liaison des ligands de la TSPO utilisés, c-à-d [3H]-PK11195 et [125I]-CLINDE, a été observée dans le striatum lésé à 3, 7 et 14 jpl, suivie d'un retour progressif à un niveau basal à 56 jpl. Le profil de liaison dans la SNC a montré une augmentation progressive de la fixation qui débute à 3 jpl, avec un pic à 14 jpl, et diminue progressivement jusqu'à ce que 56 jpl. Dans ce modèle de rongeur de la MP, les processus neuroinflammatoire et neurodégénératif surviennent de façon concomitante. La présence transitoire de l'activation microgliale pourrait être impliquée dans l’apparition et l'installation durable de la perte neuronale dopaminergique. Cette étude confirme donc le lien entre la neuroinflammation et de la neurodégénérescence et met aussi l'accent sur l'intérêt du CLINDE comme traceur potentiel de la neuroinflammation in-vivo en fournissant des informations précieuses pour le diagnostic précoce et le suivi longitudinal de la progression de la maladie, avec des applications potentielles chez l'homme. En effet, la détection précoce de la neuroinflammation, de façon antérieure à une perte neuronale cliniquement significative, pourrait devenir un enjeu majeur dans la prise en charge pré-symptomatique de la MP. Dans ce sens, nous mettons en évidence l’existence d'une fenêtre thérapeutique, survenant juste après la lésion, qui peut être proposé pour l'introduction de traitements anti-inflammatoires qui viseraient à ralentir le processus neurodégénératif. La poursuite de l’exploration des relations entre la neuroinflammation et la neurodégénéréscence in-vivo dans le même modèle animal avec la méthode d’imagerie micro-TEP, transposable à l’homme, en utilisant en parallèle le [18F]-DPA714 pour la TSPO et le [18F]-LBT999 pour le DAT est en cours. / Although the precise molecular mechanisms causing the dopaminergic neurodegeneration are still not totally understood, a body of epidemiological, clinical and experimental evidence indicates that neuroinflammation may have an important role in the pathogenesis of PD. Study of spatio-temporal links between neuroinflammation and neurodegeneration during the course of PD would improve understanding of the physiopathological mechanism and also accessibility to early diagnosis and/or new antiinflammatory therapeutic approaches. The current development of non-invasive molecular imaging methods allowing direct monitoring of the neuroinflammation process should be valuable for this purpose. The molecular target of choice in this field is the 18 kDa translocator protein (TSPO), a sensitive biomarker associated with neuroinflammation, which is over-expressed in activated microglia. In the study presented here we achieved the longitudinal evaluation of both physiopayhological mechanisms in parallel with the modifications of dopaminergic function at several time-points after 6-OHDA lesion in the rat that mimics an early stage of PD. After unilateral intra-striatal 6-OHDA administration, we quantified the temporal evolution of the TSPO, TH immunoreactivity and DAT in the striatum and the SNc from 3 to 56 days post-lesion (dpl). Increased binding of TSPO ligands used, i.e. [3H]PK11195 and [125I]CLINDE, was observed in the lesioned striatum at 3, 7 and 14 dpl, followed by a progressive return to the basal level at 56 dpl. The binding profile in the SNc showed progressive binding beginning at 3 dpl, peaking at 14 dpl, and progressively decreasing until 56 dpl. In this rodent model of PD, the neuroinflammatory and neurodegenerative processes occurred concomitantly. The transitory occurrence of microglial activation could be involved in the advent and the lasting installation of dopaminergic neuron loss. This study supports the link between neuroinflammation and neurodegeneration and emphasizes the interest of CLINDE as potent in vivo tracer of neuroinflammation by providing valuable information for early diagnosis and longitudinal follow-up of disease progression, with potential applications to human patients. Indeed, early detection of neuroinflammation, prior to a clinically significant loss of neurons, could become a major issue in the management of pre-symptomatic PD. To support this idea, we demonstrate the existence of a therapeutic window, occurring just after the lesion, which may be proposed for the introduction of anti-inflammatory treatments that aimed to slow the neurodegenerative process. Further exploration of the relationship between neuroinflammation and neurodegeneration in vivo in the same animal model with the method of micro-PET imaging, transposable to humans, using in parallel the [18F]-DPA714 for TSPO and [18F]-LBT999 for DAT is pending.

La neuroinflammation joue un rôle important dans de nombreuses maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer, Parkinson, ou encore la sclérose en plaques. De récents développements en imagerie moléculaire permettent aujourd’hui un meilleur diagnostique et un meilleur suivi thérapeutique de ces maladies. Parmi les techniques d’imagerie dont nous disposons actuellement, la Tomographie par Emission de Positions (TEP) et Tomographie par Emission Mono Photonique (TEMP) jouent un rôle important de par leur haute sensibilité et leurs aspects quantitatifs. L’objectif de ma thèse est de développer de nouveaux ligands et radioligands dédiés à l’imagerie de cibles spécifiques impliquées dans les processus de neuroinflammation. Pour ce faire, la TEP et ses émetteurs de positons à vie brève associés (notamment le fluor-18 ; T1/2 : 109.8 min) constituent un outil de choix. Le projet est divisé en deux sections principales. La première est dédiée au développement de ligands ciblant la protéine de Translocation 18 kDa (TSPO). Cette protéine est aujourd’hui reconnue comme un biomarqueur précoce des processus neuroinflammatoires, et de nombreux ligands ont déjà été synthétisés pour cette cible. Le plus anciens d’entre eux est le PK11195 appartenant à la famille des isoquinoléines, qui a été marqué au carbone-11 à la fin des années 80. Plus récemment, d’autres familles de composés ont vu le jour, et notamment la familles des pyrazolopyrimidines avec le [11C]DPA-713, ainsi que celle des pyridazinoindoles avec le [11C]SSR180575. A travers cette première partie de ma thèse, l’objectif est de synthétiser et de caractériser in vitro de nouveaux ligands dérivés des deux composés leaders de ces deux familles. Les précurseurs de marquage correspondant ont également été synthétisés pour les composés les plus prometteurs, permettant ainsi un radiomarquage au fluor-18. Certains résultats ont par ailleurs été présentés lors d’un congrès international (21st International Symposium on Radiopharmaceutical Sciences (Columbia, MO, USA – Mai 26-31, 2015)). La seconde partie de ma thèse est dédiée au développement de ligands pour des cibles alternatives à la TSPO, qui sont les récepteurs cannabinoïdes de type 2 (CB2R), et les récepteurs purinergiques P2Y12 et P2Y14. Ces nouvelles cibles, récemment émergées présentent un fort potentiel pour de nouvelles opportunités en imagerie. Une nouvelle série de sept composés a par ailleurs déjà été synthétisée en ce qui concerne le CB2R. Les précurseurs des molécules les plus prometteuses ont également été préparés. La synthèse des ligands dédiés aux récepteurs purinergiques a été initiée, et un premier couple référence /précurseur a été obtenu. / Neuroinflammation plays an important role in many neurodegenerative diseases (Alzheimer, Parkinson, Multiple sclerosis …) and recent developments in molecular imaging provide today new insights into the diagnostic and the treatement managment of these diseases. Among the existing imaging techniques, the highly sensitive and quantitative nuclear modalities SPECT (single photon emission computed tomography) but especially PET (positron emission tomography) play key roles. My PhD program is devoted to the design and synthesis of novel radioligands, all dedicated to the imaging of specific targets and processes linked to neuroinflammation. For this, PET and the short-lived positron-emitter fluorine-18 (T1/2: 109.8 min) remain the main focuses. The project has been divided into two sections, the first one concentrates on the development of novel ligands targeting the Translocator Protein 18 kDa (TSPO). Indeed, this target is today recognized as an early biomarker of neuroinflammatory processes and PK11195, an isoquinoline carboxamide labelled with carbon-11, was, in the late 80’s, the first reported PET-radioligand. More recently, new compounds, all belonging to different chemical classes, have emerged and notably the pyrazolopyrimidine acetamide [11C]DPA-713 and the pyridazinoindole acetamide [11C]SSR180575. Within the first section of my PhD, novel derivatives of both DPA-713 and SSR180575 have been synthesized and in vitro characterized. Dedicated precursors for labelling were also developed for the most promising candidates, and radiolabelling has been performed. Some results have been presented at the 21st International Symposium on Radiopharmaceutical Sciences (Columbia, MO, USA – May 26-31, 2015).The second part of my PhD, deals with the development of ligands for alternative targets to the TSPO, like the type-2 cannabinoid receptor (CB2R) and the purinergic P2Y14 / P2Y12 receptors, the latter emerging today as a hot topic for imaging opportunities. Up to now, a series of seven compounds targeting the CB2R has been successfully synthetized and in vitro characterized. Dedicated precursors of the most promising compounds have also been prepared and labelling will be shortly performed. The synthesis of ligands targeting the purinergic receptors has also been initiated and a first couple of reference / precursor has been obtained for the P2Y12R.

Avec 3000 nouveaux cas par an en France, le glioblastome multiforme (GBM) est la tumeur primitive du cerveau la plus fréquente. C’est aussi la plus agressive, l’espérance de vie moyenne des patients au moment du diagnostic ne dépassant guère 15 mois. Depuis l’étude de Stupp et collaborateurs en 2005, l’association radiothérapie – temozolomide est le traitement de référence en première ligne des glioblastomes nouvellement diagnostiqués. La protéine de la translocation (translocator protein, TSPO), connu aussi sous le nom de récepteur périphérique des benzodiazépines ou PBR, joue un rôle dans la biosynthèse des stéroïdes et le transport du cholestérol. L’interaction de la TSPO avec VDAC (Voltage-Dependant Anion Channel) dans les pores de transition de la perméabilité mitochondrial suggère également un rôle dans la régulation de l’homéostasie cellulaire et de l’apoptose. Certains travaux ont rapporté une surexpression de la TSPO dans des tumeurs cérébrales, suggérant que cette protéine pourrait représenter une cible moléculaire pour la thérapie du GBM. En particulier, l’Erucylphosphohomocholine (ErPC3, erufosine), dont l’activité antitumorale semble dépendre de la TSPO, a été capable d’induire l'apoptose in vitro dans des lignées de cellules de gliome résistantes à la chimiothérapie. Un radioligand de la TSPO pour l’imagerie par tomographie par émission de positons (TEP), le [18F]DPA-714, a été mis au point au CEA et validé dans différents modèles de neuroinflammation. Les hypothèses qui ont sous-tendu ce travail de thèse sont 1°) que la surexpression de la TSPO dans le GBM pouvait être mise en évidence par imagerie TEP au [18F]DPA-714 et 2°) que la manipulation pharmacologique de la TSPO, via les ligands spécifiques de cette protéine ou via l’ErPC3,pourrait induire l’apoptose dans les GBM. Les objectifs de la thèse étaient : 1°) d’évaluer l’expression de la TSPO dans un panel de cellules de gliomes murin et humain ; 2°) de caractériser, in vitro et in vivo, l’effet sur la survie cellulaire de lignées de GBM de l’administration de ligands de la TSPO [(et RO5-4864)] d’une part, ou de l’ErPC3 d’autre part ; 3°) de développer un modèle préclinique d’imagerie in vivo utilisant le [18F]DPA-714 pour suivre l’effet thérapeutique du ou des ligands sélectionné(s). Ce travail de thèse a démontré la faisabilité de l'imagerie TEP par [18F]DPA-714 pour détecter les gliomes 9L dans un modèle préclinique de rat et évaluer l’efficacité du traitement par ErPC3, ce qui pourrait constituer une nouvelle approche d’imagerie moléculaire du GBM. Il a permis de confirmer l'effet pro-apoptotique de l’ErPC3sur le gliome de rat in vitro et in vivo où une infiltration de la zone de la tumeur par les cellules microgliales/macrophages (CD11b-positives) et les astrocytes (GFAP-positives) chez les animaux traités à l’ErPC3 a pu être mise en évidence. Ces résultats ouvrent des perspectives intéressantes pour la recherche clinique dans le traitement des GBM. / In France alone, there are 3000 new cases of glioblastoma multiforme (GBM) per year and therefore GBM is the most common and aggressive form of the primary tumor in the central nervous system (CNS). The clinical prognosis for glioblastoma patients is extremely poor with a median survival period that rarely exceeds 15 months post-diagnosis. Since the study performed by Stupp and colleagues in 2005, the standard treatment for newly diagnosed glioblastoma consists of surgical removal of the tumor, followed by radiotherapy and concomitant chemotherapy with temozolomide. The 18 kDa Translocator Protein (TSPO), previously known as the peripheral benzodiazepine receptor (PBR) is a mitochondrial membrane protein known to be implicated in cholesterol transport, protein import, transport of porphyrin, cell proliferation and apoptosis through its interaction with VDAC (Voltage-Dependent Anion Channel) in the mitochondrial permeability transition pore (PTPM). Previous studies have reported overexpression of TSPO in brain tumors, suggesting that this protein may represent a molecular target for the therapy of GBM. In particular, Erucylphosphohomocholine (ErPC3, erufosine), an alkylphosphocholine, seems to be a promising agent in the treatment of glioblastoma. Previous studies have reported its ability to induce apoptosisin otherwise highly apoptosis resistant glioma cell lines and ErPC3 induced apoptosis seems to require the presence TSPO. [18F]DPA-714, a new TSPO radioligand for positron emission tomography (PET) imaging, was developed at the CEA and validated in different models of neuroinflammation. The hypotheses underlying this thesis are: 1) that the overexpression of TSPO in GBM can be detected by PET imaging using [18F]DPA-714 and 2) that the targeting of TSPO, via specific ligands or via ErPC3, can induce apoptosis in GBM. The objectives of the thesis were: 1) to evaluate the expression of TSPO in a panel of rodent and human glioma cell lines and 2) to characterize, in vitro and in vivo, the anti-neoplastic effect of TSPO ligands (PK11195 and RO5-4864) or ErPC3 in glioma cell lines as well as 3) to develop a preclinical model for in vivo PET imaging using [18F]DPA-714 to monitor treatment efficacy of selected ligands. In this thesis, we demonstrated the feasibility of using PET imaging with [18F]DPA-714 to characterize 9L glioma in an orthotopic rat model and to evaluate the effect of ErPC3 treatment, which could provide a new approach to molecular imaging of GBM. We confirmed the pro-apoptotic effect of ErPC3 in the rat 9L glioma cells in vitro and in vivo, and found an infiltration of microglia/macrophages (CD11b-positive) and astrocytes (GFAP-positive) in the tumor area of animals treated with ErPC3. These results open interesting perspectives for clinical research in the treatment of GBM.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune inflammatoire chronique qui détériore la myéline centrale des patients. Des progrès ont été réalisés dans le traitement de la SEP mais il n'existe pas encore de neuroprotecteurs efficaces contre les dommages axonaux entraînant un lourd handicap. Ce travail de thèse a évalué le potentiel du XBD173, un ligand du translocator protein contrôlant la neurostéroïdogenèse et la neuroinflammation, à améliorer les symptômes dans un modèle de SEP induit par la protéolipide-protéine (souris EAE-PLP) qui mime la forme rémittente-récurrente de la SEP (85% des patients). Nos résultats montrent qu'à faible dose, le XBD173, qui diminue les taux sériques d’interleukines pro-inflammatoires et empêche la répression des marqueurs myélinique et axonal, améliore aussi la symptomatologie des souris EAE-PLP. L'effet bénéfique du XBD173 contre les signes cliniques est reproduit chez les souris EAE-MOG mimant la forme progressive de la SEP. La thèse ouvre des perspectives pour l'élaboration de stratégies efficaces contre la SEP sans induire d'effets secondaires majeurs. / Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory autoimmune disease affecting the central myelin. Progress has been made for MS treatment, but effective neuroprotective drugs against MS-evoked axonal damages and severe disability are still missing. This thesis assessed the potential of XBD173, a ligand of the translocator protein controlling neurosteroidogenesis and neuroinflammation, to improve symptoms in the proteolipid protein-induced MS model (EAE-PLP mice) that mimics the relapsing-remitting form affecting 85% of MS patients. Our results show that XBD173 at low dose decreases serum levels of pro-inflammatory interleukins, prevents the repression of myelin and axonal markers, and also ameliorates clinical deficits in EAE-PLP mice. The beneficial effect of XBD173 against clinical symptoms was also observed in the EAE-MOG mice mimicking the progressive MS. Promising perspectives are open for the development of effective strategies against MS with little or no serious side effects.

Le modèle induit par injectionunilatérale intrahippocampique d’acide kaïniquechez la souris présente de grandes analogiesavec l’épilepsie mésio-temporale (EMT) chezl’homme caractérisée par la périoded’épileptogénèse et par une sclérosehippocampique (SH) typique.De récents travaux ex vivo ont révélé l’existencede processus neuroinflammatoires au niveau dela SH chez des patients épileptiques et dans desmodèles animaux. La protéine translocatrice de18kDa (TSPO), la plus étudiée actuellement aumoyen de différents traceurs, est considéréecomme une cible de référence pour visualiser etquantifier la neuroinflammation.Ma thèse a donc eu pour objectif de déterminerl’évolution de l’expression de TSPO au cours dela constitution de la SH à l’aide de laTomographie par émission de positons (TEP) au18F-DPA-714 dans une étude longitudinale chezce modèle d’EMT, et à identifier son origine àpartir d’analyses d’immunohistofluorescence.Nous avons démontré la faisabilité de la TEPpour suivre in vivo le processus inflammatoiremême dans de petites structures cérébrales à lafois par la mesure locale du pourcentaged’activité injectée et par l’estimation du volumede distribution.Le signal maximum a été observé durantl’épileptogénèse et correspondait aux microgliesactivées puis il diminuait mais persistait lorsquela SH était bien établie, et était alorsprincipalement lié aux astrocytes activés.Nos principaux résultats ont permis d’identifierles phases pendant lesquelles de nouvellesstratégies thérapeutiques ciblant différentescomposants de la neuroinflammationmériteraient d’être étudiés. / The model induced by unilateralinjection of kainic acid is considered as the bestreliable model for the mesial temporal lobeepilepsy (MTLE) and reproduces theepileptogenesis and the typical hippocampalsclerosis (HS).Recent ex vivo studies have revealed theexistence of neuroinflammation in the HS ofepileptic patients and animal models. The18kDa translocator protein (TSPO), which iscurrently the most widely studied with variousradiotracers, is considered as a reference targetto visualize and quantify theneuroinflammation.In that context, my thesis focused ondetermining the evolution of TSPO during theconstitution of HS using 18F-DPA-714positrons emission tomography (PET) in alongitudinal study in this mouse model, and toidentify its origin fromimmunohistofluorescence analysis.We demonstrated the feasibility of PET tomonitor in vivo the inflammatory process evenin small cerebral structures both by the localmeasurement of the percent injected dose or bythe measurement of the volume of distribution.The peak signal was found during theepileptogenesis and corresponded to activatedmicroglia, and then this signal decreased butpersisted after the HS was well established, andmainly originated from activated astrocytesduring this period.Our main results allowed us to identifydifferent phases during which potential antiepileptictreatment targeting differentcomponents of neuroinflammation could beinvestigated.

La TSPO préalablement connue sous le nom de récepteur périphérique aux benzodiazépines (PBR), est une protéine membranaire principalement impliquée dans le transport du cholestérol du cytosol vers la matrice des mitochondries, étape limitante dans la synthèse des stéroïdes et des sels biliaires.La production de la forme murine de la TSPO recombinante a été réalisée par un plasmide exprimé dans la bactérie Escherichia coli. La purification a été obtenue par colonne d'affinité grâce à l'étiquette polyhistidine codée dans le gène recombinant. Différents environnements mimétiques membranaires, détergents, lysodérivés, lipides ont été testés d'un point de vue structural et fonctionnel. Parmi les détergents étudiés, la dodécyl phosphocholine (DPC) a permis le meilleur repliement de la protéine. L'ajout de lysodérivés (LMPE) ou de phospholipides (DMPC/DMPE) a permis d'accroître la stabilité. La liaison des ligands spécifiques de la TSPO (PK 11195, cholestérol, protoporphyrine IX) a été observée dans plusieurs conditions étudiées par différentes approches biophysiques et biochimiques. Les trois approches structurales (ME, RX et RMN) ont pu être réalisées après optimisation des conditions de production et de stabilisation. Les résultats obtenus sont discutés en lien avec la structure de la TSPO publiée ces derniers mois. En parallèle à l'étude structurale, des mesures fonctionnelles par mutagenèse dirigée ont été réalisées afin d'obtenir des informations sur la liaison du ligand PK 11195. Ces données ont été confrontées à la structure récemment déterminée permettant de proposer un rôle pour les résidus mutés. Le mécanisme de transport du cholestérol par la TSPO est discuté. / TSPO previously named peripheral-type benzodiazepine receptor (PBR) is a membrane protein mostly involved in cholesterol transport from the cytosol to the matrix of mitochondria, a limiting step in steroids and bile salts biosynthesis.Production of recombinant mouse TSPO has been performed by plasmid expression in Escherichia coli bacteria. Purification has been obtained by immobilized affinity chromatography (IMAC) using polyhistidine tag encoded by recombinant gene. Various membranous mimetic environments such as detergents, lysoderivates, lipids have been tested from structural and functional point of view. Among tested detergents, dodecyl phosphocholine (DPC) has permitted the best protein refolding. The presence of lysoderivate (LMPE) or phospholipids (DMPC/DMPE) increased protein stability. Binding of TSPO high affinity ligands (PK 11195, cholesterol, protoporphyrin IX) has been measured in different conditions studied by biochemical and biophysical techniques. Three structural approaches (EM, XR and NMR) have been performed after optimization of production conditions and protein stabilization. Results gained have been discussed in line with TSPO atomic structure published within these last months. In parallel with structural studies, functional measurements have been carried out by site directed mutagenesis in order to gain data on binding site of PK 11195. These data have been faced with recently published TSPO atomic structure stabilized with this ligand and enabled to propose functional implication of mutated amino acids. Transport mechanism of cholesterol by TSPO is discussed.

Positron emission tomography (PET) is a non-invasive medical imaging technique that allows visualisation and quantification of biochemical, physiological and pharmacological processes in living subjects. This is achieved through application of radiotracers – compounds labelled with positron emitting radionuclides. Neurodegeneration is the progressive loss of neurons resulting in impairment of brain function leading to cognitive decline and can affect movement. The underlying pathology of many neurodegenerative diseases is misfolding of proteins such as α-synuclein, the key pathological hallmark of Parkinson’s disease. Also implicated in the processes of neurodegeneration is neuroinflammation, which is observed by the activation of microglia – the immune cells of the brain. Activation of microglia is associated with the upregulation of the 18 kDa mitochondrial translocator protein (TSPO). This work has involved the synthesis and characterisation of novel compounds that have the potential for being applied as radiotracers for imaging α-synuclein fibrils (project 1), or TSPO (project 2) via PET. Over the course of project 1 a library of compounds was synthesised based upon structural modifications of a lead structure identified from the literature. These compounds then underwent screening via biophysical methodologies in order to determine their affinity to α-synuclein fibrils. This stage of the work involved the development of a novel biophysical technique – microscale thermophoresis (MST). A general automated radiosynthetic method to afford the [18F]fluoro-derivatives of these compounds has also been developed, and preliminary in vitro autoradiography studies and an in vivo microPET scan has been performed. For project 2, an automated radiosynthetic method was developed to produce [18F]GE387, a lead compound identified through collaboration with GE Healthcare. This radiotracer has then been applied to preliminary in vitro autoradiography and an in vivo microPET study using rats with induced neuroinflammation alongside control rats.

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Les travaux présentés dans ce manuscrit ont pour objectifs la synthèse chimique de nouveaux ligands de la protéine de translocation 18 kDa (TSPO), leur évaluation in vitro et le radiomarquage isotopique des candidats les plus prometteurs par l’émetteur de positons à vie brève fluor-18 (t1/2 : 109,8 minutes). Ce travail a pour finalité le développement de nouvelles sondes moléculaires ou biomarqueurs pour l’imagerie non-invasive et atraumatique par Tomographie par Emission de Positons (TEP) de la neuroinflammation, processus reconnu dans les maladies neurodégénératives telles la maladie d’Alzheimer, de Parkinson, la sclérose en plaque et certaines maladies psychiatriques.Le radioligand de choix pour l’imagerie de la TSPO est actuellement le [18F]DPA-714, une pyrazolo[1,5-a]pyrimidine marquée au fluor-18 récemment développée au laboratoire. Cependant, cette molécule subit in vivo la perte rapide de l’atome de fluor radioactif par rupture du motif fluoroalkoxy comme démontrée lors de l’étude de son métabolisme. Mon projet de thèse a donc visé à concevoir et développer de nouveaux dérivés structurellement proches de DPA-714 (analogues) pour lesquelles la liaison entre le squelette principal et le fluor-18 serait renforcée. C’est dans ce cadre que dix-neuf composés ont été préparés et évalués pour leur affinité pour la TSPO, et que deux candidats prometteurs, DPA-C5yne et CfO-DPA-714, ont été radiomarqués au fluor-18 avec de bons rendements radiochimiques (20-30 %) et de hautes radioactivités spécifiques (50-90 GBq/µmol). Ces radioligands ont également été évalués in vivo par imagerie TEP et présentent, chez l’animal, des performances équivalentes voire légèrement supérieures à [18F]DPA-714. / The work presented in this manuscript aims to describe the synthesis of new ligands of the translocation protein 18 kDa (TSPO), their in vitro evaluation and, for the most promising candidates, their isotopic radiolabelling with the short-lived positron emitter fluorine-18 (t1/2 : 109.8 minutes). The ultimate goal of this work consists in developing new molecular probes, or biomarkers, for imaging neuroinflammation in a non-invasive and atraumatic manor using Positron Emission Tomography (PET). Neuroinflammatory processes have been identified in Alzheimer and Parkinson diseases, MS and various psychiatric pathologies.The radioligand of choice for imaging TSPO is currently [18F]DPA-714, a pyrazolo[1,5-a]pyrimidine radiolabelled with fluorine-18 which has been recently prepared in our laboratories. However, [18F]DPA-714 undergoes a rapid in vivo loss of the radioactive fluorine by cleavage of the fluoroalkoxy chain as demonstrated in metabolic studies. Therefore, my PhD project aimed to design and develop new structurally related analogues of DPA-714 where the linkage between the main backbone and the fluorine-18 would be reinforced. To this extent, nineteen compounds were prepared and their affinity towards the TSPO was evaluated. Two promising candidates, coded DPA-C5yne and CfO-DPA-714, were radiolabelled with fluorine-18 with good radiochemical yields (20-30 %) and high specific radioactivities (50-90 GBq/µmol). These radioligands were also evaluated by PET imaging at the preclinical stage and displayed equivalent or slightly improved results when compared to [18F]DPA-714.