Thèse (M.Sc.) -- Université Laval, 1997. / Bibliogr.: f. 67-83. Publ. aussi en version électronique.

Thesis (Ph. D. in Biochemistry)--Vanderbilt University, Dec. 2007. / Title from title screen. Includes bibliographical references.

Master of Science in Biomedical Sciences / Department of Clinical Sciences / Mary Lynn Higginbotham / This study evaluated sixteen canine nasal carcinoma and five normal nasal epithelium samples for expression and phosphorylation of known targets of toceranib [vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGR2), platelet derived growth factor alpha (PDGFR-[alpha]), platelet derived growth factor receptor beta (PDGFR-[beta]), and stem cell factor receptor (c-KIT)] and epidermal growth factor receptor 1 (EGFR1) using immunohistochemistry, RT-PCR and a receptor tyrosine kinase (RTK) phosphorylation panel. Protein for VEGFR2 was expressed in neoplastic cells of all carcinomas, PDGFR-[alpha] was noted in 15/16, whereas PDGFR-[beta] was detected in 3/16 samples, but showed primarily stromal staining. Protein expression for c-KIT was present in 4/16 and EGFR1 was noted in 14/16 samples. Normal tissue showed variable protein expression of the RTKs. Messenger RNA for VEGFR2, PDGFR-[beta], and c-KIT were noted in all samples. Messenger RNA for PDGFR-[alpha] and EGFR1 were detected in 15/16 samples. All normal nasal tissue detected messenger RNA for all RTKs of interest. Constitutive phosphorylation of VEGFR2, PDGFR-[alpha], PDGFR-[beta] and c-KIT was not observed in any carcinoma or normal nasal sample, but phosphorylation of EGFR1 was noted in 10/16 carcinoma and 3/5 normal samples. The absence of major phosphorylated RTK targets of toceranib suggests the clinical effect of toceranib may occur through inhibition of alternative and currently unidentified RTK pathways in canine nasal carcinomas. The observed protein and message expression and phosphorylation of EGFR1 in the nasal carcinoma samples merits further inquiry into EGFR1 as a therapeutic target for this cancer.

Titre de l'écran-titre (visionné le 12 juillet 2023) / Au cours du développement et lors du maintien de l'homéostasie chez les adultes, divers processus sont nécessaires pour maintenir l'architecture tissulaire. Par exemple, dans les tissus épithéliaux, la distribution asymétrique des composantes cellulaires menant à la formation de domaines distincts ainsi que la formation des jonctions sont des processus cellulaires clés qui doivent être finement régulés pour maintenir la structure et la fonction épithéliales. La dérégulation de l'un de ces processus peut entraîner des défauts dans l'architecture épithéliale et contribuer à la progression de maladies comme le cancer. Dans les dernières années, un nombre croissant d'études ont mis en évidence un lien entre la signalisation des récepteurs EPH et le développement et le maintien de l'homéostasie des tissus épithéliaux. Notamment, les récepteurs EPH interagissent avec des protéines impliquées dans des processus tels que l'établissement et le maintien de la polarité des cellules épithéliales et des jonctions cellulaires. La dérégulation de la signalisation des récepteurs EPH a aussi été associée à des défauts d'orientation de division cellulaire. Nous avons émis l'hypothèse qu'un sous-groupe de récepteurs EPH coordonne la morphogénèse épithéliale en interagissant avec des protéines impliquées dans la polarité apico-basale. Pour tester cette hypothèse, nous avons utilisé la culture tridimensionnelle de cellules Caco-2, une lignée du cancer du côlon. Nous avons d'abord montré qu'au moins deux des quatorze récepteurs EPH (EPHA1 et -B4) sont exprimés dans des cellules épithéliales Caco-2 polarisées. L'analyse de la localisation subcellulaire de ces deux récepteurs dans les sphéroïdes de Caco-2 a révélé qu'EPHA1 et EPHB4 sont localisés au domaine basolatéral. Pour comprendre le rôle des récepteurs EPH dans la morphogenèse épithéliale, nous avons effectué des expériences de perte de fonction. Nos résultats montrent que la déplétion d'EPHA1 ou EPHB4 mène à la formation de sphéroïdes désorganisés. Nous avons identifié les domaines des récepteurs EPH responsables de la coordination de la morphogénèse épithéliale dans les sphéroïdes de Caco-2 par analyse structure-fonction. Nos résultats montrent que le domaine intracellulaire d'EPHA1 et plus particulièrement sa région incluant le domaine de liaison aux protéines SAM et le motif PDZ est responsable du rôle d'EPHA1 dans l'organisation des sphéroïdes épithéliaux. En ce qui concerne EPHB4, nos résultats suggèrent que les défauts de morphogénèse dans les sphéroïdes de Caco-2 dépendent plutôt de son domaine extracellulaire. Pour mieux comprendre le phénotype associé à la perte de fonction d'EPHA1 et EPHB4, nous avons exploré deux processus qui, lorsqu'ils sont dérégulés, peuvent entraîner des défauts dans l'organisation tissulaire : le maintien de la polarité apico-basale et l'orientation du fuseau mitotique. Plutôt que d'affecter l'intégrité de la polarité apico-basale, nos résultats suggèrent que le phénotype de perte de fonction provient de défauts dans l'orientation du fuseau mitotique de cellules en division, ce qui est crucial pour le maintien d'une monocouche cellulaire pendant la morphogenèse du tissu épithélial. En conclusion, nos résultats montrent qu'EPHA1 et EPHB4 joue un rôle important dans la morphogénèse épithéliale des sphéroïdes de Caco-2 via la régulation de l'orientation du fuseau mitotique. Toutefois, EPHA1 et EPHB4 régulent ce processus selon deux mécanismes moléculaires différents. Puisque l'organisation en monocouche est perdue dans les tissus cancéreux, nos travaux pourraient permettre de mieux comprendre comment ces récepteurs contribuent à la morphogenèse épithéliale et à l'homéostasie dans le contexte de la progression du cancer. / During development and adult tissue homeostasis, various processes are required to maintain tissue architecture. For instance, in epithelial tissues, coordination of apical and basal membrane morphogenesis and cell-cell adhesion are key molecular mechanisms that must be tightly regulated to maintain epithelial structure and function. Dysregulation of any of these processes can lead to defects in epithelial architecture and contribute to the progression of diseases such as cancer. In the past years, a growing number of studies have demonstrated a link between EPH-EFN signaling and the development and maintenance of epithelial tissue homeostasis. In particular, several partners of the EPH receptors have been implicated in the establishment and maintenance of epithelial cell polarity and cell junctions. Dysregulation of EPH-EFN signaling has also been associated with defects in the orientation of cell divisions. We hypothesized that a subgroup of EPH receptors coordinates epithelial morphogenesis by interacting with proteins involved in apical-basal polarity. To test this hypothesis, we used three-dimensional culture of Caco-2 epithelial cells, a colon-cancer cell line. We first showed that at least two of the fourteen EPH receptors (EPHA1 and -B4) are expressed in polarized Caco-2 cells. Analysis of the subcellular localization of these two receptors in Caco-2 spheroids revealed that EPHA1 and EPHB4 were localized to the basolateral domain. To further study the role of EPH receptors in epithelial morphogenesis, we have performed loss-of-function experiments. These showed that either EPHA1 or EPHB4 depletion led to the formation of disorganized spheroids. We identified the structural domains of the EPH receptors responsible for coordinating epithelial morphogenesis in Caco-2 spheroids using a structure-function approach. Our results indicated that the intracellular domain of EPHA1 and more particularly the region including the SAM domain and the PDZ motif was required for the formation of normal epithelial spheroids. In contrast, our results suggested that the correct formation of Caco-2 spheroids required the extracellular domain of EPHB4. To better understand the phenotype associated with the loss of function of EPHA1 and EPHB4, we explored two processes that, when deregulated, can lead to defects in tissue organization: maintenance of apical-basal polarity and mitotic spindle orientation. Rather than affecting the integrity of the apical-basal polarity, our results suggested that the loss-of-function phenotype stems from defects in mitotic spindle orientation in dividing cells, which is known to be crucial for the maintenance of a cell monolayer during epithelial tissue morphogenesis. In conclusion, our results showed that EPHA1 and EPHB4 played an important role in Caco-2 spheroids epithelial morphogenesis via the regulation of mitotic spindle orientation. However, EPHA1 and EPHB4 regulate this process by different molecular mechanisms. Since monolayer organization is lost in cancerous tissues, our work could provide insight into how these receptors contribute to epithelial morphogenesis and homeostasis in the context of cancer progression.

The Neu/ErbB2 receptor tyrosine kinase has been implicated in the induction of mammary tumourigenesis. Both Ras-dependent and independent signalling downstream of activated Neu is believed to mediate cellular signalling that contributes cellular transformation in oncogenic Neu. Signalling from five 𝘣𝘰𝘯𝘢 𝘧𝘪𝘥𝘦 autophosphorylation sites (termed sites A through E) in the carboxyl tail of the receptor mediate these signals to the cytosol. Of the four positive regulatory sites (B, C, D, E), only three (B, C, D,) signal through known signalling molecules. Site E, (Y1253) in Neu, though known to interact with DOKR is essentially an orphan site. The discovery of a 34kD protein capable of associating to peptides corresponding to site E prompted investigations into the nature of site E signalling. Mass spectrometric analyses revealed that the 34kD protein is 2,4-dienoyl-CoA reductase (DECR1), a lipid metabolism protein typically localized to the mitochondria. Investigations into this protein reveal that DECR1 is capable of associating with Neu site E in a tyrosine phosphorylation and sequence specific manner. Furthermore, analyses with site E second-site mutants (YE[APEY], YE[DPEY], YE[NAEY] and YE[NDEY]) show that DECR1 associates in a manner consistent to a PTB domain-containing protein. Analyses of amino acid sequence demonstrate the presence of a putative Bcl-domain in DECR1 suggestive of a role in apoptosis. Experiments into the apoptotic activity of DECR1 proved inconclusive. The examination of sub-cellular localization of Neu and DECR1 showed that the two proteins are found in both the mitochondrial and plasma membrane fractions. These results demonstrate that DECR1 may be a veritable binding partner for Neu Y1253. / Thesis / Master of Science (MSc)

Les spermatozoïdes sont des cellules haploïdes hautement spécialisées ayant pour but ultime la fécondation de l'ovocyte. Afin de devenir aptes à la fécondation, les cellules germinales mâles subissent plusieurs étapes de maturation, impliquant bien des modifications tant au niveau protéique, membranaire et intracellulaire. Toutefois, les spermatozoïdes de mammifères fraîchement éjaculés sont incapables de féconder et acquièrent leur plein pouvoir fécondant à l'intérieur du tractus génital femelle, lors de leur transit pour rencontrer l'ovule. Ces différentes étapes de maturation permettent aux spermatozoïdes d'obtenir, entre autres, leur caractéristique unique concernant leur composition protéique et lipidique. Cette complexité membranaire est un mécanisme permettant aux spermatozoïdes d'avoir une spécificité de signal qui rend possible la capacitaton et la réaction acrosomiale au moment et endroit opportuns. Enfin, ce mémoire traitera du fractionnement membranaire et des partenaires d'interaction de la tyrosine kinase YES1 chez les spermatozoïdes humains.

Plusieurs réponses cellulaires aux stimuli extracellulaires sont transmises par des voies de signalisation qui agissent en aval de récepteurs membranaires tels les récepteurs tyrosine kinase (RTK). Les signaux provenant des RTK sont souvent relayés via des protéines adaptatrices comme NCK1 (Non-Catalytic region of tyrosine Kinase 1) et NCK2 dont les fonctions sont considérées redondantes et indissociables. Toutefois, certaines études suggèrent que chacune de ces deux protéines pourraient avoir des cibles cellulaires spécifiques et des fonctions uniques. L’objectif de mon projet de doctorat était d’analyser la spécificité des protéines NCK1/2, c’est-à-dire d’identifier pour chacune des cibles uniques, pour ensuite caractériser ce qui génère cette spécificité tout en définissant la fonction de ces interactions. En premier lieu, j’ai utilisé deux techniques complémentaires de protéomique, soit (i) des purifications d’affinité (AP) et (ii) du marquage de proximité in vivo (BioID) suivies d’analyses en spectrométrie de masse (MS) afin de caractériser les interactomes respectifs de NCK1/2. La combinaison de ces deux approches m’a permis d’identifier plus d’une centaine d’interactions spécifiques pour chaque NCK. Des analyses bio-informatiques basées sur ces résultats m’ont permises de mettre en évidence que NCK2 semble plus spécifiquement impliquée que NCK1 dans la régulation de l’organisation du cytosquelette d’actine, structure essentielle lors de la division et de la cytokinèse. En comparant simultanément des cellules fibroblastiques murines (MEF) déplétées soit pour NCK1, soit pour NCK2, j’ai remarqué que les cellules Nck2-/-, à l’inverse des cellules Nck1-/- étaient plus multinucléées et présentent un midbody altéré en longueur. Également, j’ai remarqué une altération dans la composition du midbody des cellules Nck2-/- tel que suggéré par l’absence dans cette structure des protéines Polo-like kinase1 (PLK1), Epithelial cell transforming 2 (ECT2) ou encore Aurora B (AURKB), régulateurs clefs de la cytokinèse. Finalement, j’ai montré que la fonction de NCK2 durant la cytokinèse repose principalement sur son domaine SH2. Dans un deuxième temps, j’ai sélectionné 27 partenaires identifiés en MS et confirmé par une méthode orthogonale leurs interactions respectives avec NCK1 et/ou NCK2. Grâce à des tests de liaison in vitro, j’ai déterminé que plusieurs protéines dont la Plakophiline 4 (PKP4), un régulateur de la cytokinèse, lient directement et spécifiquement NCK2. Par différentes expériences in vitro, j’ai pu déterminer que NCK2 lie les portions N-terminale et centrale de PKP4 grâce à son domaine Src Homology (SH) 2 et que la spécificité de NCK2 envers PKP4 ne semble pas dépendre seulement des propriétés intrinsèques du SH2. L’association résulte plutôt de la combinaison d’une partie ou de l’ensemble des propriétés des domaines et régions interdomaines constituant les protéines NCK1/2. En conclusion, bien que les fonctions de NCK1/2 soient généralement considérées comme redondantes, mes résultats démontrent que ces protéines sont capables de lier des partenaires différentspour réguler des fonctions biologiques distinctes. Ainsi, mes travaux suggèrent que NCK2 semble spécifiquement requise lors du processus de cytokinèse. De plus, l’ensemble de mes expériences in vitro apporte une première idée du mécanisme de spécificité des protéines NCK1/2 en suggérant que leur spécificité ne semble pas entièrement provenir des propriétés intrinsèques de leurs domaines individuels, mais plutôt d’une combinaison des propriétés de leurs domaines et/ou régions interdomaines respectives. / Signals from cell surface receptors are often relayed via adaptor proteins that can serve as hubs to recruit appropriate target signaling molecules and guide signals along specific pathways. Among these, adaptor proteins NCK1 (Non-Catalytic region of tyrosine Kinase 1) and NCK2 have functions that are often considered redundant and/or indistinguishable. The main goal of my work was to demonstrate that NCK1 and NCK2 are not fully redundant and may each display functional specificity. To achieve this, I delineated NCK1-and NCK2-specific signalling networks, identified for each unique target, then characterized what generates this specificity and obtained the function of these interactions. First, to identify the complement of interaction partners for NCK1 and NCK2, I used two unbiased mass spectrometry (MS)-based approaches: (i) epitope-tagged protein affinity purification (AP) followed by MS analysis and (ii) in vivo proximity labelling (BioID). The combination of these two approaches allowed me to identify more than one hundred specific interactions for each NCK. Bioinformatics analyzes based on the specific partners identified in MS enabled me to highlight that NCK2 was more specifically involved in the regulation of the actin cytoskeleton organization, structure essential for cell division and cytokinesis. By simultaneously comparing mouse embryo fibroblasts (MEF) depleted either for NCK1 or NCK2, I noticed that Nck2-/-, but not Nck1-/-cells are multi-nucleated and display extended protrusions reminiscent of intercellular bridges, which correlate with an extended time spent in cytokinesis as well as a failure of a significant proportion of cells to complete abscission. Further analysis of this phenotype revealed that the midbody of NCK2-deficient cells is not only increased in length, but also altered in composition, as judged by the mislocalization of the Polo-like kinase 1 (PLK1), Epithelial cell transforming 2 (ECT2) and Aurora B (AURKB) proteins. Moreover, I showed that NCK2 function during cytokinesis requires its SH2 domain. Second, to underline the molecular mechanism of specific protein complex formation, I selected based on my MS results 27 partners to confirm by an orthogonal method their respective interactions with NCK1 and/or NCK2. By using in vitro binding assays, I was able to determine that several proteins including Plakophilin 4(PKP4), a key regulator of the cytokinesis process, were able to bind directly and specifically to NCK2. Through various in vitro experiments, I was able to determine that NCK2 binds the N-terminal and central portions of PKP4 through its SH2 domain and that the specificity of PKP4 toward NCK2 does not appear to result from the intrinsic properties of its SH2 alone. This association seems to result from the combination of some or all of the properties of the individual domains and inter-regions constituting the NCK1/2 proteins. In conclusion, despite what is generally accepted, I showed that both NCK1 and NCK2 may form specific protein complexes, thus reflecting the functional specificity of these two adaptor proteins. I further demonstrated that NCK1 and NCK2 are not completely redundant. I also shed light on a previously uncharacterized function for the NCK2 adaptor protein in cell division. Finally, my in vitro experiments provide an explanation for the specificity mechanism of NCK1/2 adaptor proteins by suggesting that their specificity come from the combination of the properties of their respective domains and/or interdomain regions.

Yes / Vandetanib is an orally available tyrosine kinase inhibitor used in the treatment of cancer. The current synthesis proceeds via an unstable 4-chloroquinazoline, using harsh reagents, in addition to requiring sequential protection and deprotection steps. In the present work, use of the Dimroth rearrangement in the key quinazoline forming step enabled the synthesis of Vandetanib in nine steps (compared to the previously reported 12–14). / This work was supported by the Cancer Research UK-Cancer Imaging Centre (grant: C1060/ A16464), the Institute of Cancer Research and the University of Hull.

La protéine liant les ARNs HuR/ELAVL1 est impliquée dans la stabilisation d’ARNm dont la région 3’UTR présente des motifs riches en A et U (« AU-rich element », ARE). Ces ARNm codent majoritairement des protéines dont la dérégulation favorise l’émergence de cancers (oncogènes, cyclines, facteurs de croissance…). Notamment, HuR est surexprimée dans le carcinome hépatocellulaire (CHC) humain et dans des lignées de CHC en culture et est anormalement retrouvée dans le cytoplasme des cellules hépatiques tumorales participant à leur prolifération. De plus, les modifications post-traductionnelles des protéines liant les ARNs modulent leur localisation subcellulaire ainsi que leur capacité à lier et contrôler le devenir de leurs cibles. Plusieurs serine/thréonine kinases identifiées sont capables de moduler la fonction de l’AUBP (« AU-binding protein ») HuR. Via des études in vitro, nous avons identifié la Y200 comme étant une cible (probablement la seule) de la « tyrosine kinase non-récepteur » Abelson sur HuR. Cette tyrosine kinase est également surexprimée dans le CHC humain et dans des lignées de CHC en culture (comme les cellules HuH7). L’inhibition d’Abl par le Nilotinib influence le profil acido-basique de la protéine HuR, en gel bidimensionnel, dans les cellules HuH7, suggérant un rôle d’Abl dans les fonctions d’HuR sur ses cibles ARNm. / The RNA binding proteins (RBPs) HuR/ELAVL1 is involved in the stabilization of mRNAs whose 3'UTR contains motifs enriched in A and U (« AU-rich element », ARE). These mRNAs encode mainly proteins whose deregulation promotes the emergence of cancer (oncogenes, cyclins, growth factors...). In particular, HuR is overexpressed in hepatocellular carcinoma (HCC) and in human HCC cell lines in culture and is abnormally found in the cytoplasm of liver tumor cells contributing to their proliferation. Furthermore, the Posttranslational modifications of RNA binding proteins (RBPs) modulate their subcellular localization and their ability to bind and control the fate of their targeted mRNAs. Some sérine/thréonine identified kinase are capable of modulating the function of the AUBP (« AU-binding protein ») HuR. By in vitro studies, we identified Y200 as a target (probably the only one) of the « non-receptor tyrosine kinase » Abelson on HuR. This kinase is also overexpressed in hepatocellular carcinoma (HCC) and in human HCC cell lines in culture (as cells HuH7). The inhibition of Abl by Nilotinib (one inhibitor) influences the acido-basic profile of the protein HuR, on Gel 2D, in cells HuH7, suggesting a role of Abl in the functions of HuR on its targets ARNm.

La tyrosine kinase cytoplasmique Src est un régulateur clé de la signalisation induite par les facteurs de croissance et les intégrines. Src présente des propriétés oncogéniques lorsqu'elle est dérégulée, une situation fréquemment retrouvée dans les cancers colorectaux (CCR). Sous sa forme activée, Src participe à la croissance tumorale et à la formation de métastases. Cependant, les mécanismes de dérégulation impliqués sont mal connus. En effet, SRC est rarement muté dans ces cancers. Mon travail de thèse a mis en évidence un nouveau mécanisme de dérégulation de Src via l'inactivation de SLAP. SLAP est une protéine de signalisation de type adaptateur qui régule négativement la signalisation lymphocytaire. De part son association avec l'E3-ligase Cbl, il induit la dégradation de substrats importants de la tyrosine kinase Lck nécessaires à l'activation lymphocytaire. Je montre que SLAP est également exprimé dans le tissu épithélial colique et que son expression est fréquemment perdue au cours de la progression tumorale colorectale. SLAP inhibe la tumorigénicité et le potentiel métastasant des cellules de CCR. Sur le plan moléculaire, SLAP définit une boucle de rétrocontrôle d'une voie oncogénique Src/EphA2/Akt initiée par Src via la dégradation protéasome-dépendante du récepteur EphA2 impliquant l'ubiquitine E4-ligase UBE4A. Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme d'induction oncogénique de Src, une fonction insoupçonnée de suppresseur de tumeurs de SLAP et montrent l'importance d'une E4-ligase et des protéines adaptatrices dans la régulation négative de la signalisation initiée par les tyrosine kinases dans la progression tumorale. / The cytoplasmic tyrosine kinase Src mediates intracellular signaling induced by growth factors and integrins. When deregulated, Src acquires oncogenic properties. Src deregulation largely occurs in the absence of mutation of the corresponding gene but the underlying molecular mechanisms involved in this process are still unclear. Here I uncovered a novel mechanism of Src oncogenic induction in colorectal cancer (CRC) via SLAP silencing. SLAP is an adaptor protein and signaling molecule that controls lymphocytes activation. By association with E3-ligase Cbl, SLAP induces proteasomal degradation of important components of T cell receptor signaling, which impedes lymphocytes activation. I show that SLAP is also expressed in the epithelial tissue of the colon, but its expression is frequently lost during tumorigenesis. I also show that SLAP controls tumorigenicity and invasiveness of CRC cells. At the molecular level, SLAP specifies a feedback loop of a Src/EphA2/Akt oncogenic signaling that is initiated by Src itself. Precisely, phosphorylation of EphA2 on Tyr594 by Src creates a binding site for SLAP-SH2 to elicit receptor degradation. This novel SLAP function is independent of Cbl but requires its interaction with the E4-ligase UBE4A. SLAP down-regulation observed in cancer cells dramatically increases EphA2 levels and amplifies a Src/EphA2/Akt signaling required for cell tumorigenicity. Thus, SLAP inactivation defines a novel mechanism of Src oncogenic induction in human cancer.