Après la découverte des mutations de la calréticuline dans les néoplasmes classiques myéloproliferatifs négatifs pour le Ph1, les travaux se sont focalisés sur les deux mutations les plus fréquentes, c'est-à-dire la calréticuline del52 et l’ins5, mais il existe environ 20% de mutants rares de la calréticuline (une cinquantaine), qui ont été classés en type-1 « like » et type-2 « like », classification basée sur leur structure. Cependant il reste à déterminer si cette classification est pertinente du point de vue fonctionnel, ce qui pourrait avoir des conséquences pour la prise en charge des patients et leur traitement. Ici, nous démontrons que deux mutants rares de type-1 (del34 et del46) et un de type-2 (del19) se comportent de manière similaire aux deux mutations fondatrices de cette classification, del52 et ins5, respectivement. Ces résultats ont été validés par des expériences in vivo chez la souris. Tous les mutants de la calréticuline (del19, del34 et del46) nécessitent absolument le récepteur de la thrombopoïétine, appelé MPL, pour induire une transformation cellulaire en provoquant une activation indépendante de la thrombopoïétine de la voie MPL / JAK2-STAT, comme les mutants del52 et ins5. Dans les expériences de transplantation de moelle osseuse de souris, les mutants rares de type-1 sont associés à une progression fréquente de la maladie d’un tableau proche d’une thrombocytémie essentielle à une myélofibrose, tandis que le mutant rare de type 2 est associé à une légère thrombocytose. Du point de vue hématopoïétique, les mutants rares de type-1 provoquent une amplification au niveau des cellules souches hématopoïétiques donc à un stade précoce tandis que les mutants rares de type-2 provoquent une amplification tardive de la mégacaryopoïèse. Grâce à une modélisation protéique basée sur l'homologie des mutants de calréticuline, nous avons identifié des domaines oncogènes qui seraient potentiellement responsables de l'interaction pathologique de la calréticuline et de MPL pour conduire à une activation indépendante de la thrombopoïétine. Maintenant, ces résultats in silico doivent être absolument validés par des études structure fonction. Enfin, nous avons modélisé un nouveau mécanisme de signalisation dans la leucémie myéloïde chronique comprenant IRE-1alpha, un bras de la voie de réponse des protéines mal repliées (UPR), qui pourrait être responsable de la perte de la fonction de la p53 pendant la progression de la leucémie myéloïde chronique vers une leucémie aiguë. Un tel mécanisme pourrait être impliqué dans les autres MPN. / After the discovery of calreticulin mutations in classical Ph1- Myeloproliferative Neoplasms, extensive investigation is underway on the two most frequent mutations, i.e., del52 and ins5, but it remains that the rare calreticulin mutants, which include both type-1 like and type-2 like require a similar investigation for ascertaining whether the classification of type-1 and type-2 has a functional relevance as well as for therapeutic intervention and patient management. Here we demonstrate that type-1 like (del34 and del46) and type-2 like (del19) mutants behave similarly as del52 and ins5 mutants, respectively. Moreover, we validate our findings with in vivo experiments. All the calreticulin mutants (del19, del34 and del46) absolutely require the thrombopoietin receptor, MPL, to induce cell transformation by causing ligand independent activation of the MPL/JAK2-STAT pathway. In mouse bone marrow transplantation experiments, type-1 like mutants are associated with frequent progression from an essential thrombocythemia-like phenotype to myelofibrosis whereas type-2 like mutant is associated with mild thrombocytosis. Type-1 like mutants cause clonal amplification of early hematopoetic stem cells whereas the type-2 like mutant causes late platelet amplification. Further, by homology based protein modeling of calreticulin mutants, we have identified possible oncogenic domains responsible for pathologic interaction of CALR and MPL leading to ligand independent activation of MPL. Now they must be validated by structural-functional studies Finally, we have modelled a novel signaling mechanism in chronic myeloid leukemia comprising of IRE-1alpha, an unfolded protein response (UPR) pathway arm, which may be responsible for loss of the WT p53 function during leukemic development and progression. Such a mechanism may be involved in the other MPNs

Les rétinopathies ischémiques prolifératives telles que la rétinopathie diabétique proliférative et la rétinopathie du prématuré sont les principales causes de la perte de la vision dans la population active et pédiatrique des pays industrialisés. Malgré le fait que les événements initiateurs sont différents et propres à chacune des pathologies, les rétinopathies ischémiques prolifératives sont le résultat d’un processus biphasique. On a d’abord une phase initiale de dégénérescence microvasculaire suivie d’une néovascularisation excessive et pathologique de la rétine hypoxique qui tente de réinstaurer l’apport en nutriments et en énergie. Mais au lieu d’aller revasculariser les zones avasculaires de la rétine, ces nouveaux vaisseaux sanguins sont mal orientés et se dirigent plutôt vers le vitré normalement avasculaire. Ceci provoque des tensions physiques dans la rétine et mène à long terme à son détachement et une perte de vision conséquente. Les traitements actuels ne viennent pas sans effets secondaires majeurs. Par exemple, la formation de la cataracte et l’augmentation de la pression intraoculaire avec l’utilisation des corticostéroïdes ou la perte de la vision partielle dans le cas du traitement au laser sont fréquemment observées. De même, la thérapie anti-VEGF (Vascular endothelial growth factor) apporte aussi son lot de complications, telles que la thromboembolie veineuse et l’augmentation de la neurotoxicité après un long usage, vu les propriétés neuro- et vaso-protectrices du VEGF. Le développement d’une nouvelle approche thérapeutique pour les rétinopathies ischémiques prolifératives est donc nécessaire afin de contrer ces limitations thérapeutiques. Dans notre première étude, nous mettons en évidence un nouveau mécanisme par lequel les cellules neuronales sous stress diabétique sont à l’origine d’une forte inflammation oculaire. Nos résultats démontrent que le co-récepteur multi-ligand Neuropiline-1, le VEGF et la Sémaphorine-3A agissent de concert afin d’attirer une sous-population particulière de phagocytes mononucléaires susceptibles d’activer le processus de croissance vasculaire pathologique dans la rétine diabétique. De plus, notre étude propose une base pour de futures recherches sur l’impact des phagocytes mononucléaires exprimant Neuropiline-1 dans les pathologies du système nerveux central caractérisées par une inflammation excessive. Nos résultats permettent aussi de mettre en lumière le caractère anti-inflammatoire potentiel des thérapies actuelles anti-VEGF (à cause du rôle de VEGF dans la mobilisation des phagocytes mononucléaires via Neuropiline-1) au niveau oculaire. Dans notre deuxième étude, nous mettons en évidence l’activation du facteur HIF1α dans les phagocytes mononucléaires présents dans la rétine hypoxique. L’utilisation d’une approche protéomique non biaisée de spectrométrie de masse en tandem nous a permis d’identifier les partenaires interagissant avec HIF1α dans un milieu déficient en oxygène. Nous avons pu ainsi déterminer pour la première fois l’association entre la voie d’HIF1α et celle d’IRE1α (un des trois senseurs de la voie de l’UPR « unfolded protein response ») dans le processus d’adaptation à l’oxygène des phagocytes mononucléaires. Nos résultats révèlent ensuite l’importance d’IRE1α (plus principalement son activité kinase) dans la production d’HIF1α. Nous démontrons finalement que la synergie entre les signalisations d’IRE1α et HIF1α pourrait être responsable du comportement pathogénique des phagocytes mononucléaires via leur libération de cytokines inflammatoires; ce qui participerait ainsi à la progression des rétinopathies. Collectivement, nos travaux ont permis d’identifier d’importants régulateurs de l’activité pathogénique des phagocytes mononucléaires. Nous montrons : 1) le rôle de Neuropiline-1 dans l’infiltration des phagocytes mononucléaires au niveau des zones endommagées de la rétine et 2) l’impact du mécanisme convergent entre les voies d’IRE1α et HIF1α sur leur sécrétion de facteurs pro-inflammatoires durant les rétinopathies. Nos résultats offrent une base pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques (ciblant Neuropiline-1, IRE1α et HIF1α) dans le traitement de maladies oculaires et d’autres pathologies caractérisées par une inflammation excessive. / Proliferative ischemic retinopathies such as proliferative diabetic retinopathy (PDR) and retinopathy of prematurity (ROP) are the principal causes of vision loss in working age and pediatric populations of industrialized countries. Although they display different initial triggers, proliferative ischemic retinopathies are biphasic ocular diseases that affect retinal vessels. There is an initial degeneration of the microvasculature, followed by a hypoxic stress on the retina. This triggers a second phase of deregulated and destructive blood vessel growth within the retina. Given this sequence of events and prominent clinical features, the currently most widely used local ocular therapeutic interventions directly target pathological blood vessel growth, yet present a number of non-desirable off-target effects such as the destruction of the retina itself. In fact, currently available treatments for proliferative ischemic retinopathies present non-negligible side effects, such as cataract formation with intravitreal use of corticosteroid or reduced visual field with laser-based photocoagulation surgery. Similarly, the anti-VEGF (Vascular endothelial growth factor) therapy may be associated with thromboembolic events, neuronal toxicity and atrophy when used as frequent long-term treatment given the fact that VEGF serves a vaso- and neuro-protective factor in the retina. Overcoming these therapeutic limitations and exploring novel pharmacological avenues are therefore required to ameliorate the safety profiles of current interventions. In our first study, we describe a novel mechanism by which severely stressed neuronal cells in the diabetic retina provoke destructive inflammation in the eye. We demonstrate that the multi-ligand co-receptor Neuropilin-1, VEGF and Semaphorin3A act as potent attractants for a specialized population of immune cells (mononuclear phagocytes) that later promote the exaggerated pathological vessel growth associated with the disease progression. Importantly, we provide evidence for a novel pharmacological intervention that reduces the inflammation associated with pathological retinal vessel growth. Our findings also suggest that current anti-VEGF therapies (a popular treatment for ocular vascular diseases) may in part be effective by reducing destructive ocular inflammation. In our second study, we provide evidence that those mononuclear phagocytes activate HIF1α in the hypoxic and inflamed retina. After using the unbiased proteomic approach of tandem mass spectrometry, we were able to identify HIF1α partners and found a novel link between HIF1α and the UPR (unfolded protein response) sensor IRE1α. Our data next established the crucial role of IRE1α (precisely via its kinase activity) in HIF1α production. We also suggested that the synergy between IRE1α and HIF1α pathways may be responsible of the pathogenic activity of the hypoxic mononuclear phagocytes via their secretion of inflammatory cytokines, thus contributing to the progression of the retinopathy. Collectively, our work identifies important regulators of the pathogenic activity of mononuclear phagocytes. We show that: 1) Neuropilin-1 promotes the infiltration of mononuclear phagocytes in the retina and 2) the convergent mechanism between IRE1α and HIF1α pathways is responsible for their release of pro-inflammatory factors during retinopathy. Our results could be used as a basis for the development of alternative therapeutic strategies (targeting Neuropilin-1, IRE1α and HIF1α) to treat ocular diseases or other pathologies characterized by an excessive inflammation.

Die ER-assoziierte Proteindegradation (ERAD) ist Teil des Qualitätskontrollsystems am ER, um der Akkumulation von fehlgefalteten Proteinen im ER entgegenzuwirken. Hierbei werden ERAD-Substrate mit Hilfe von E3-Ligasen wie z.B. HRD1 ubiquityliert und anschließend durch den p97-Ufd1-Npl4 Komplex aus der ER-Membran extrahiert. Im Zytosol werden diese extrahierten Proteine vom 26S Proteasom abgebaut. Für die Retrotranslokation von ERAD- Substraten werden zudem die Membranproteine Derlin-1 und VIMP benötigt, welche mit p97 assoziieren und einen Proteinkomplex bilden. HERP ist ein ER-lokalisiertes Protein, dessen Synthese durch den UPR (unfolded protein response) als Antwort auf die Akkumulation von fehlgefalteten Proteinen im ER induziert wird. Dies deutet auf eine Rolle von HERP im ERAD hin. Interessanterweise besitzt HERP eine sogenannte UBL-Domäne. Für andere Proteine mit UBL-Domäne konnte eine Interaktion dieser Domäne mit dem Proteasom nachgewiesen werden. Daher kann angenommen werden, dass HERP ebenfalls mit dem Proteasom interagiert und dies zur ER- Membran rekrutiert, wo es für den Abbau von ERAD-Substraten benötigt wird. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle von HERP innerhalb des UPR zu ermitteln. Die hier präsentierten Daten zeigen, dass HERP essentiell für den Abbau des ERAD-Modell- Substrates CD3-delta ist. Somit hat HERP tatsächlich eine Rolle im ERAD. Außerdem wird eine direkte Interaktion von HERP mit der E3-Ligase HRD1 nachgewiesen. Es wird zudem gezeigt, dass HERP und HRD1 einen Proteinkomplex mit p97, Derlin-1 und eventuell auch mit VIMP bilden. Dieser ERAD Komplex ist folglich sowohl für die Ubiquitylierung als auch die Retrotranslokation von ERAD-Substraten verantwortlich und garantiert somit die effiziente Prozessierung von Proteinen aus dem ER. Zudem wird gezeigt, dass die UBL-Domäne von HERP im Gegensatz zu anderen UBL- Domänen nicht mit dem Proteasom interagiert. Somit kann nicht mehr davon ausgegangen werden, dass Proteasombindung eine Gemeinsamkeit aller Proteine mit UBL-Domäne ist. Dagegen wird eine Interaktion der UBL-Domäne von HERP mit dem deubiquitylierenden Enzym USP7 nachgewiesen. Dies deutet darauf hin, dass auch Deubiquitylierung eine wichtige Rolle im ERAD-Prozess spielt. / ER-associated protein degradation (ERAD) is part of the ER quality control system dealing with the accumulation of misfolded proteins in the ER. This process requires polyubiquitylation of ERAD substrates involving E3 ligases, such as HRD1, and their subsequent extraction from the ER membrane by the p97-Ufd1-Npl4 complex. Retrotranslocation of substrates into the cytosol for degradation by the 26S proteasome also involves the membrane proteins Derlin-1 and VIMP, which are associated with p97 to form a protein complex. The ER-resident protein HERP was shown to be upregulated by the unfolded protein response pathway (UPR) upon the accumulation of misfolded proteins in the ER. It was therefore considered to function in ERAD. Interestingly, HERP contains a UBL domain. In other proteins this domain facilitates an interaction with the proteasome, suggesting that HERP might recruit the proteasome to the ER membrane for efficient ERAD. The aim of this study was to investigate the function of HERP within the UPR. The findings presented here demonstrate that HERP is essential for the degradation of a model ERAD substrate. Thus, HERP indeed has a role in ERAD. Moreover, the data show that HERP directly interacts with the E3 ligase HRD1 and the two proteins form a common protein complex with p97, Derlin-1 and possibly also with VIMP. This suggests that both ubiquitylation and retrotranslocation of ER proteins are performed by one protein complex, enabling an efficient processing of ERAD substrates. This study also demonstrates that the UBL domain of HERP does not share the proteasome binding property of other UBL domains, suggesting that proteasome binding cannot be considered a general feature of all UBL domains. Instead, the HERP UBL domain is able to interact with the deubiquitylating enzyme USP7. Therefore, deubiquitylation might also be an important aspect in the proteasome-dependent degradation of misfolded ER proteins.

Les biopuces à ADN permettent d’étudier à une échelle génomique une très grande variété de questions sur la physiologie et la différenciation cellulaires. Elles ont ainsi contribué de manière considérable aux progrès récents de nombreux domaines de la biologie et occuperont bientôt une place de choix dans le secteur du diagnostic médical. C’est la levure Saccharomyces cerevisiae qui a servi de modèle pour le développement de la première biopuce génomique. L’application de cette approche à la levure a permis d’explorer sous un angle nouveau l’étude de ses différents états de différenciation, de son cycle cellulaire, et de sa capacité d’adaptation à diverses conditions nutritionnelles ou à des conditions environnementales induisant un stress cellulaire. Plusieurs études ont plus particulièrement examiné la réponse des cellules de levure à une carence en azote ou en acides aminés. Cependant, une étude systématique de la réponse transcriptionnelle de la cellule aux différentes sources d’azote n’a jamais été entreprise en croissance confinée à l'état de régime. S. cerevisiae est capable d’utiliser plus d’une vingtaine de substances en tant que sources uniques d’azote pour la croissance. On distingue parmi les sources d’azote celles qui permettent une croissance optimale, appelées « bonnes » sources d’azote, des autres, appelées « mauvaises » sources d’azote. La levure possède plusieurs systèmes de régulation lui permettant de s'adapter à la condition azotée. Au niveau transcriptionnel, on recense trois régulations générales – la NCR (répression catabolique azotée), le GAAC (le contrôle général de la biosynthèse des acides aminés) et le système SPS (Ssy1-Ptr3-Ssy5) – et une multitude de régulations plus spécifiques.<p>En utilisant la technique des puces à ADN, nous avons généré une matrice d'expression de l'ensemble des gènes de la levure en croissance confinée à l'état de régime dans un milieu de culture contenant une parmi 21 sources d'azote différentes. Nous avons pu ainsi recenser systématiquement 506 gènes soumis à une régulation transcriptionnelle dépendante de l'azote.<p>En nous basant sur ces résultats, nous avons pu décrire l'ensemble des régulations transcriptionnelles engagées dans l'adaptation à la source d'azote fournie dans le milieu de culture. Parallèlement, nous avons défini deux grands groupes de sources d'azote en fonction du transcriptome de S. cerevisiae. Le premier groupe rassemble les composés qui exercent une répression catabolique azotée forte et dont la liste a été complétée. Fait nouveau, nous montrons que ces mêmes composés enclenchent aussi l'activation de la réponse aux protéines mal repliées (UPR). Au contraire, lorsque la source d'azote appartient au second groupe que nous avons défini, non seulement la croissance des levures est plus lente, la NCR levée et la réponse aux protéines mal repliées réprimée, mais nous montrons de façon inattendue que le contrôle général de la biosynthèse des acides aminés est activé. Plusieurs autres régulations qui ne sont pas impliquées dans le métabolisme azoté présentent un comportement différent en fonction de la source d'azote fournie. C'est le cas notamment des gènes dont l’expression est régulée selon l’apport en zinc et qui sont moins exprimés sur le milieu urée. De même, les gènes impliqués dans les résistances multiples aux drogues sont activés par le tryptophane.<p>En confrontant nos résultats à ceux obtenus dans le cadre de travaux indépendants, nous avons proposé plus d'une cinquantaine de nouveaux gènes cibles de la NCR. Beaucoup d'entre eux n'ont jamais été caractérisés expérimentalement. En utilisant des techniques avancées d'analyse de séquences primaires de protéines, nous avons pu proposer une fonction pour plusieurs de ces gènes. Ces analyses bioinformatiques et la réalisation d’expériences complémentaires à l’aide de biopuces à ADN nous ont permis de proposer que l'un d'entre eux code pour une protéine impliquée dans la déstabilisation d'ARN messagers lors de la carence azotée. Nous avons aussi identifié plusieurs nouveaux gènes appartenant à des régulons spécifiquement activés en réponse à un nombre restreint de sources d'azote. Il est probable que ces gènes soient impliqués dans le catabolisme des sources d'azote sur lesquelles ils sont activés. / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished