Uncaria tomentosa (Willd) DC. é uma árvore nativa das Américas Central e do Sul, onde é popularmente conhecida como "unha-de-gato". Sua casca é largamente utilizada na medicina tradicional para o tratamento de diversas doenças, como gastrite, asma e artrite. Quanto à sua composição química é descrita a presença de alcalóides indólicos e oxindólicos, compostos polifenólicos e derivados do ácido quinóvico. Este trabalho teve como objetivo obter em separado frações enriquecidas dos referidos grupos químicos de Uncaria tomentosa, empregando o procedimento de extração em fase sólida, bem como a validação dos métodos analíticos aplicados a cada fração bioativa. Adicionalmente, as frações enriquecidas foram avaliadas quanto ao potencial efeito antiproliferativo contra linhagens de células de glioma e atividade imunoadjuvante empregando como modelo vacinas virais contendo BoHV-5, respectivamente em ensaios in vitro e in vivo. Todos os métodos de análise necessários para o acompanhamento e controle de qualidade da matéria-prima e produtos de transformação foram validados de forma satisfatória. O procedimento de separação/purificação empregando resina de poliestireno demonstrou resultados robustos e reprodutíveis e permitiu a separação de frações ricas em compostos fenólicos, alcalóides e triterpenos. Em outro plano, foi possível constatar a isomerização dos alcalóides pentacíclicos em meio aquoso por efeito do processo de secagem empregando elevadas temperaturas. O método de análise para a quantificação de polifenóis foi discriminatório quando aplicado aos extratos obtidos de diferentes órgãos de U. tomentosa. As frações fenólica e alcaloídica foram capazes de diminuir a porcentagem de células viáveis das linhagens de glioma C6 e U138-MG após período de tratamento de 48 e 72 h, respectivamente. Complementarmente, estas frações não afetaram as células não-tumorais na mesma extensão em que afetam as células cancerosas. No tocante à avaliação da atividade imunoadjuvante, um pequeno efeito foi observado apenas na resposta imune dos animais imunizados com a fração triterpênica. / Uncaria tomentosa (Willd) DC. is a climbing tree native from Central and South America, where is commonly known as “uña-de-gato” or “cat’s claw”. Its bark is widely used in traditional medicine for the treatment of gastritis, asthma and arthritis. Concerning its chemical composition is worth mentioning the presence of indole and oxindole alkaloids, phenolic compounds and quinovic acid derivatives. This work aims to obtain enriched fractions of the three main chemical groups of Uncaria tomentosa above described using solid phase extraction procedure, as well as the validation of specific assay methods. In parallel, potential antiproliferative effect against glioma cell lines and imunoadjuvant activity using BoHV-5 viral vaccine are evaluated by in-vitro and in-vivo models, in that order. All analytical methods required for monitoring and end-process quality control were validated satisfactorily. The separation/purification procedure using a polystyrene resin gave promising results and allowed the separation of phenolics, alkaloids and triterpenes fractions. Fractions yield were in all satisfactory and the processes were robust and reproducible. It could confirm the alkaloid isomerization in aqueous milieu by effect of the temperature process. The LC method for assay of polyphenols was discriminatory when applied to extracts from different organs of U. tomentosa. The fractions of phenolic and alkaloids compounds were able to decrease the percentage of cells in C6 and U138-MG glioma lineages after a 48h and 72h-treatment, respectively. Moreover, these fractions did not affect non-tumoral cells to the extent that they affect tumor cells. With regard to the imunoadjuvant activity evaluation a moderate effect was detected on immune responses of immunized animals with triterpenes fraction.

A espécie Uncaria tomentosa (Rubiaceae) é reconhecida por diversos povos sul-americanos, devido a sua importância etnofarmacológica. Na sua maioria, os estudos realizados com U. tomentosa empregam como matéria prima vegetal a casca, devido à fração rica em alcalóides. Entre os constituintes químicos relatados para a espécie destacam-se os flavonóides, triterpenos e alcalóides, aos quais é atribuído um número significativo de propriedades terapêuticas. A escassez de metodologias analíticas para o doseamento do teor de alcalóides de U. tomentosa motivou a realização do presente trabalho, que visa à validação de metodologia analítica para matéria prima vegetal (DVSM), extrato seco (ESC) e cápsulas contendo extrato seco de Uncaria tomentosa DC. O estudo propôs a utilização de metodologia espectrofotométrica e cromatográfica para a quantificação de teores totais de alcalóides. Para fins de identificação da espécie foram utilizados métodos cromatográficos por CCD, preconizados para flavonóides e alcalóides. O perfil por CCD encontrado para a DVSM, liofilizado e ESC foi diferente do relatado na bibliografia. O teor de alcalóides do extrato seco comercial (ESC), utilizando método espectrofométrico foi de 8,41 mg/g, apresentando uma taxa de recuperação de 100,45%. Paralelamente, foi desenvolvido e validado um método de análise por CLAE para o ESC, que permitiu a quantificação da fração alcaloídica, expressa como isomitrafilina. O teor de alcalóides totais encontrado foi de 14,58 mg/g e apresentou taxa de recuperação de 99,95 a 100,44%. No teste de robustez do método analítico por CLAE, o ESC apresentou variações significativas com a variação do pH e da temperatura. O ESC contido em cápsulas de gelatina foi testado quanto à estabilidade térmica, por um período de 90 dias, a 50 ± 2 ºC e 90 ± 5% de umidade relativa. O perfil de alcalóides totais foi obtido por CLAE e ao ser comparado com o ESC, não exposto a condições extremas, apresentou teores equivalentes, porém, com mudança no perfil da fração alcaloídica, o que pode caracterizar produtos de degradação. Um perfil similar foi observado quando o ESC foi exposto à luz UVC por 90 dias. / Uncaria tomentosa DC (Rubiaceae; cat’s claw) is a climbing bush widespreads in the tropical South American countries, in which its etnopharmacological importance is largely recognized. The main phytochemical studies on U. tomentosa revealed a meaningful alkaloid fraction in its aerial parts and especially on its bark. Besides that, other relevant components were also isolated from its bark, including flavonoids and triterpenes, to which several pharmacological properties were formerly ascribed. Notwithstanding the crescent importance in the research of novel drugs, it is to denote the lack of official and validated analytical methods intended for the determination of the alkaloids content in U. tomentosa. Thus, the aim of this work was the development and validation of analytical method which allow the analysis and content determination of the main alkaloids in the vegetal raw material (DVSM), a commercial dry extract as well as in gelatin hard capsules containing it. For this purpose, a spectrophotometric method and a chromatographic one were developed and afterwards validated. In both cases the total alkaloids content was expressed as isomitraphiline (reference standard). The identification by CCD analysis was carried out on basis to several methods related earlier in the literature for flavonoids and alkaloids. In general, the comparison from CCD profiles of genuine samples of U. tomentosa bark depicted in the literature, DVSM, dry extract and ESC profiles led to partial dissimilar results, which reinforce the need of additional efforts in this way. The alkaloids content calculated spectrophotometrically for the commercial dry extract (ESC) was 8,41 mg/g, with a recover of 100,45%. For the HPLC method, the total alkaloids content correspond to the sum of the area under the peaks previously characterized as alkaloids. The alkaloids content calculated for the same extract by HPLC was 14.58 mg/g, with a recover rate of 99,95 to 100,44%. The method as a whole fulfills the usual ICH validation requirements. The stability test under stress conditions of pH and temperature for the ESC presented a significant variation of the individual area of some peaks. The original peaks assigned to isomitraphiline, pteropodine and isopteropodine showed a decrease in intensity and a concomitant appearance of new peaks, originated from breakdown process presumably. A similar profile was observed by exposing ESC samples to the wave short UV radiation during 90 days. There are also evidences in favor of degradation signals in non-treated ESC samples.

Uncaria tomentosa (Willd) DC. é uma liana tropical nativa da Amazônia brasileira e peruana. A espécie é reconhecida pelas suas propriedades antiinflamatória imunoestimulante, antiviral e antitumoral, geralmente atribuídas aos polifenóis e, principalmente, à fração de alcaloides oxindólicos pentacíclicos. No âmbito tecnológico, visando o desenvolvimento de produtos derivados com maior valor agregado, são poucos os subsídios encontrados na literatura científica, afora alguns relatos atrelados a patentes e registros de produtos. Nesse contexto, o presente trabalho objetivou a obtenção e caracterização de frações enriquecidas de alcaloides, saponinas e polifenóis a partir das cascas de U. tomentosa, mediante o emprego de técnicas de separação em fase sólida e de métodos analíticos validados. A matéria prima foi extraída por maceração em EtOH a 40%, por quatro dias. Depois de filtrado e concentrado, o extrato bruto foi liofilizado (EBL). Para fins analíticos, o EBL foi reconstituído em EtOH a 40% e caracterizado quanto a presença de alcaloides oxindólicos, saponinas triterpênicas e polifenóis. Os quatro principais picos relativos aos alcaloides oxindólicos presentes no EBL foram quantificados por CLAE-UV e o teor total, expresso em mitrafilina, foi de 1,48 g%. Os principais picos atribuídos às saponinas foram analisados por CLAE-DAD e o teor total, expresso em α-hederina, foi de 18,37 g%. O teor de polifenóis totais, determinado pelo método colorimétrico de Folin-Ciocalteu, foi estimado em 31,93 g%. Para a separação da fração polifenólica, o emprego de PVPP mostrou ser mais eficiente do que bentonita, carvão ativado ou caseína. A fração enriquecida de alcaloides oxindólicos foi obtida por separação em resina fortemente aniônica. O teor de alcaloides totais corresponde por cerca de 90% (m/m) desta fração. A fração de saponinas triterpênicas foi obtida mediante separação em resina fortemente catiônica, com teor aproximado de 78% (m/m), considerando o somatório das áreas dos picos de interesse. A proposta de uma técnica comparativa, fazendo uso de resina hidrofóbica, resultou em uma fração saponosídica enriquecida com um rendimento superior, porém com um menor teor de saponinas totais, em torno de 75% (m/m). / Uncaria tomentosa is a tropical liana native form Brazilian and Peruvian rain forests. The specie is recognized by its immune stimulant, anti-viral, anti- inflammatory and anti-cancer properties often attributed to the polyphenolic fraction and manly to the peculiar pentaciclic oxindole alkaloidal fraction. On the technological field, aiming the transformation of the raw material into standardized and high aggregate value products a few efforts can be encountered in the literature, excepting a couple of patents and product registration related information. In this context the present work aimed to the obtainment and characterization of enriched fractions of alkaloids, saponins and polyphenols from the stem barks of U. tomentosa, through solid phase separations techniques and validated analytical methods. The raw material extraction was extracted by a four days maceration in a 40% hydroethanolic solution. After the filtration and concentration, the crude extract was lyophilized (EBL). For analytical purposes the EBL was resuspended in a 40% hydroethanolic solution and characterized for the presence of oxindole alkaloids, triterpenic saponins and polyphenols. The four main peaks attributed to the oxindole alkaloids in EBL were quantified by UV-HPLC and the total content, expressed as mitraphiline, was about 1.48 g%. The main peaks attributed to the saponins were analysed by DAD-HPLC and the total content, expressed as α-hederin, was about 18.37 g%. The total polyphenolic content, determined by the Folin-Ciocalteu colorimetric assay, was estimated at 31.93 g%. For the polyphenols separation the use of PVPP showed to be more efficient than bentonite, active carbon or casein treatment. The enriched fractions of the oxindole alkaloids was obtained through a strongly anionic resin separation. The total alkaloid content of this fraction was about 90% (w/w). The saponin enriched fraction was obtained through a strongly cationic resin separation and the total saponin content was about 78% (w/w). The suggestion of a comparative technique employing a hydrophobic resin resulted on a saponosidic enriched fraction with higher yield but a lower saponin content of about 75% (w/w).

A espécie Uncaria tomentosa (Rubiaceae) é reconhecida por diversos povos sul-americanos, devido a sua importância etnofarmacológica. Na sua maioria, os estudos realizados com U. tomentosa empregam como matéria prima vegetal a casca, devido à fração rica em alcalóides. Entre os constituintes químicos relatados para a espécie destacam-se os flavonóides, triterpenos e alcalóides, aos quais é atribuído um número significativo de propriedades terapêuticas. A escassez de metodologias analíticas para o doseamento do teor de alcalóides de U. tomentosa motivou a realização do presente trabalho, que visa à validação de metodologia analítica para matéria prima vegetal (DVSM), extrato seco (ESC) e cápsulas contendo extrato seco de Uncaria tomentosa DC. O estudo propôs a utilização de metodologia espectrofotométrica e cromatográfica para a quantificação de teores totais de alcalóides. Para fins de identificação da espécie foram utilizados métodos cromatográficos por CCD, preconizados para flavonóides e alcalóides. O perfil por CCD encontrado para a DVSM, liofilizado e ESC foi diferente do relatado na bibliografia. O teor de alcalóides do extrato seco comercial (ESC), utilizando método espectrofométrico foi de 8,41 mg/g, apresentando uma taxa de recuperação de 100,45%. Paralelamente, foi desenvolvido e validado um método de análise por CLAE para o ESC, que permitiu a quantificação da fração alcaloídica, expressa como isomitrafilina. O teor de alcalóides totais encontrado foi de 14,58 mg/g e apresentou taxa de recuperação de 99,95 a 100,44%. No teste de robustez do método analítico por CLAE, o ESC apresentou variações significativas com a variação do pH e da temperatura. O ESC contido em cápsulas de gelatina foi testado quanto à estabilidade térmica, por um período de 90 dias, a 50 ± 2 ºC e 90 ± 5% de umidade relativa. O perfil de alcalóides totais foi obtido por CLAE e ao ser comparado com o ESC, não exposto a condições extremas, apresentou teores equivalentes, porém, com mudança no perfil da fração alcaloídica, o que pode caracterizar produtos de degradação. Um perfil similar foi observado quando o ESC foi exposto à luz UVC por 90 dias. / Uncaria tomentosa DC (Rubiaceae; cat’s claw) is a climbing bush widespreads in the tropical South American countries, in which its etnopharmacological importance is largely recognized. The main phytochemical studies on U. tomentosa revealed a meaningful alkaloid fraction in its aerial parts and especially on its bark. Besides that, other relevant components were also isolated from its bark, including flavonoids and triterpenes, to which several pharmacological properties were formerly ascribed. Notwithstanding the crescent importance in the research of novel drugs, it is to denote the lack of official and validated analytical methods intended for the determination of the alkaloids content in U. tomentosa. Thus, the aim of this work was the development and validation of analytical method which allow the analysis and content determination of the main alkaloids in the vegetal raw material (DVSM), a commercial dry extract as well as in gelatin hard capsules containing it. For this purpose, a spectrophotometric method and a chromatographic one were developed and afterwards validated. In both cases the total alkaloids content was expressed as isomitraphiline (reference standard). The identification by CCD analysis was carried out on basis to several methods related earlier in the literature for flavonoids and alkaloids. In general, the comparison from CCD profiles of genuine samples of U. tomentosa bark depicted in the literature, DVSM, dry extract and ESC profiles led to partial dissimilar results, which reinforce the need of additional efforts in this way. The alkaloids content calculated spectrophotometrically for the commercial dry extract (ESC) was 8,41 mg/g, with a recover of 100,45%. For the HPLC method, the total alkaloids content correspond to the sum of the area under the peaks previously characterized as alkaloids. The alkaloids content calculated for the same extract by HPLC was 14.58 mg/g, with a recover rate of 99,95 to 100,44%. The method as a whole fulfills the usual ICH validation requirements. The stability test under stress conditions of pH and temperature for the ESC presented a significant variation of the individual area of some peaks. The original peaks assigned to isomitraphiline, pteropodine and isopteropodine showed a decrease in intensity and a concomitant appearance of new peaks, originated from breakdown process presumably. A similar profile was observed by exposing ESC samples to the wave short UV radiation during 90 days. There are also evidences in favor of degradation signals in non-treated ESC samples.

Uncaria tomentosa (Willd) DC. é uma árvore nativa das Américas Central e do Sul, onde é popularmente conhecida como "unha-de-gato". Sua casca é largamente utilizada na medicina tradicional para o tratamento de diversas doenças, como gastrite, asma e artrite. Quanto à sua composição química é descrita a presença de alcalóides indólicos e oxindólicos, compostos polifenólicos e derivados do ácido quinóvico. Este trabalho teve como objetivo obter em separado frações enriquecidas dos referidos grupos químicos de Uncaria tomentosa, empregando o procedimento de extração em fase sólida, bem como a validação dos métodos analíticos aplicados a cada fração bioativa. Adicionalmente, as frações enriquecidas foram avaliadas quanto ao potencial efeito antiproliferativo contra linhagens de células de glioma e atividade imunoadjuvante empregando como modelo vacinas virais contendo BoHV-5, respectivamente em ensaios in vitro e in vivo. Todos os métodos de análise necessários para o acompanhamento e controle de qualidade da matéria-prima e produtos de transformação foram validados de forma satisfatória. O procedimento de separação/purificação empregando resina de poliestireno demonstrou resultados robustos e reprodutíveis e permitiu a separação de frações ricas em compostos fenólicos, alcalóides e triterpenos. Em outro plano, foi possível constatar a isomerização dos alcalóides pentacíclicos em meio aquoso por efeito do processo de secagem empregando elevadas temperaturas. O método de análise para a quantificação de polifenóis foi discriminatório quando aplicado aos extratos obtidos de diferentes órgãos de U. tomentosa. As frações fenólica e alcaloídica foram capazes de diminuir a porcentagem de células viáveis das linhagens de glioma C6 e U138-MG após período de tratamento de 48 e 72 h, respectivamente. Complementarmente, estas frações não afetaram as células não-tumorais na mesma extensão em que afetam as células cancerosas. No tocante à avaliação da atividade imunoadjuvante, um pequeno efeito foi observado apenas na resposta imune dos animais imunizados com a fração triterpênica. / Uncaria tomentosa (Willd) DC. is a climbing tree native from Central and South America, where is commonly known as “uña-de-gato” or “cat’s claw”. Its bark is widely used in traditional medicine for the treatment of gastritis, asthma and arthritis. Concerning its chemical composition is worth mentioning the presence of indole and oxindole alkaloids, phenolic compounds and quinovic acid derivatives. This work aims to obtain enriched fractions of the three main chemical groups of Uncaria tomentosa above described using solid phase extraction procedure, as well as the validation of specific assay methods. In parallel, potential antiproliferative effect against glioma cell lines and imunoadjuvant activity using BoHV-5 viral vaccine are evaluated by in-vitro and in-vivo models, in that order. All analytical methods required for monitoring and end-process quality control were validated satisfactorily. The separation/purification procedure using a polystyrene resin gave promising results and allowed the separation of phenolics, alkaloids and triterpenes fractions. Fractions yield were in all satisfactory and the processes were robust and reproducible. It could confirm the alkaloid isomerization in aqueous milieu by effect of the temperature process. The LC method for assay of polyphenols was discriminatory when applied to extracts from different organs of U. tomentosa. The fractions of phenolic and alkaloids compounds were able to decrease the percentage of cells in C6 and U138-MG glioma lineages after a 48h and 72h-treatment, respectively. Moreover, these fractions did not affect non-tumoral cells to the extent that they affect tumor cells. With regard to the imunoadjuvant activity evaluation a moderate effect was detected on immune responses of immunized animals with triterpenes fraction.

Uncaria tomentosa (Willd) DC. é uma liana tropical nativa da Amazônia brasileira e peruana. A espécie é reconhecida pelas suas propriedades antiinflamatória imunoestimulante, antiviral e antitumoral, geralmente atribuídas aos polifenóis e, principalmente, à fração de alcaloides oxindólicos pentacíclicos. No âmbito tecnológico, visando o desenvolvimento de produtos derivados com maior valor agregado, são poucos os subsídios encontrados na literatura científica, afora alguns relatos atrelados a patentes e registros de produtos. Nesse contexto, o presente trabalho objetivou a obtenção e caracterização de frações enriquecidas de alcaloides, saponinas e polifenóis a partir das cascas de U. tomentosa, mediante o emprego de técnicas de separação em fase sólida e de métodos analíticos validados. A matéria prima foi extraída por maceração em EtOH a 40%, por quatro dias. Depois de filtrado e concentrado, o extrato bruto foi liofilizado (EBL). Para fins analíticos, o EBL foi reconstituído em EtOH a 40% e caracterizado quanto a presença de alcaloides oxindólicos, saponinas triterpênicas e polifenóis. Os quatro principais picos relativos aos alcaloides oxindólicos presentes no EBL foram quantificados por CLAE-UV e o teor total, expresso em mitrafilina, foi de 1,48 g%. Os principais picos atribuídos às saponinas foram analisados por CLAE-DAD e o teor total, expresso em α-hederina, foi de 18,37 g%. O teor de polifenóis totais, determinado pelo método colorimétrico de Folin-Ciocalteu, foi estimado em 31,93 g%. Para a separação da fração polifenólica, o emprego de PVPP mostrou ser mais eficiente do que bentonita, carvão ativado ou caseína. A fração enriquecida de alcaloides oxindólicos foi obtida por separação em resina fortemente aniônica. O teor de alcaloides totais corresponde por cerca de 90% (m/m) desta fração. A fração de saponinas triterpênicas foi obtida mediante separação em resina fortemente catiônica, com teor aproximado de 78% (m/m), considerando o somatório das áreas dos picos de interesse. A proposta de uma técnica comparativa, fazendo uso de resina hidrofóbica, resultou em uma fração saponosídica enriquecida com um rendimento superior, porém com um menor teor de saponinas totais, em torno de 75% (m/m). / Uncaria tomentosa is a tropical liana native form Brazilian and Peruvian rain forests. The specie is recognized by its immune stimulant, anti-viral, anti- inflammatory and anti-cancer properties often attributed to the polyphenolic fraction and manly to the peculiar pentaciclic oxindole alkaloidal fraction. On the technological field, aiming the transformation of the raw material into standardized and high aggregate value products a few efforts can be encountered in the literature, excepting a couple of patents and product registration related information. In this context the present work aimed to the obtainment and characterization of enriched fractions of alkaloids, saponins and polyphenols from the stem barks of U. tomentosa, through solid phase separations techniques and validated analytical methods. The raw material extraction was extracted by a four days maceration in a 40% hydroethanolic solution. After the filtration and concentration, the crude extract was lyophilized (EBL). For analytical purposes the EBL was resuspended in a 40% hydroethanolic solution and characterized for the presence of oxindole alkaloids, triterpenic saponins and polyphenols. The four main peaks attributed to the oxindole alkaloids in EBL were quantified by UV-HPLC and the total content, expressed as mitraphiline, was about 1.48 g%. The main peaks attributed to the saponins were analysed by DAD-HPLC and the total content, expressed as α-hederin, was about 18.37 g%. The total polyphenolic content, determined by the Folin-Ciocalteu colorimetric assay, was estimated at 31.93 g%. For the polyphenols separation the use of PVPP showed to be more efficient than bentonite, active carbon or casein treatment. The enriched fractions of the oxindole alkaloids was obtained through a strongly anionic resin separation. The total alkaloid content of this fraction was about 90% (w/w). The saponin enriched fraction was obtained through a strongly cationic resin separation and the total saponin content was about 78% (w/w). The suggestion of a comparative technique employing a hydrophobic resin resulted on a saponosidic enriched fraction with higher yield but a lower saponin content of about 75% (w/w).