Ureases, enzimas que catalisam a hidrólise da ureia formando amônia e dióxido de carbono, são sintetizadas por plantas, fungos e bactérias. A espécie leguminosa Canavalia ensiformis, conhecida em inglês como Jack Bean, produz diferentes isoformas de ureases, sendo a chamada Jack Bean Urease (JBU) a isoforma majoritária. Ureases possuem atividade inseticida já comprovada para diferentes espécies de insetos e um dos seus efeitos no animal é o bloqueio neuromuscular. O objetivo deste trabalho foi compreender o mecanismo de ação responsável pela atividade neurotóxica da JBU e pelo bloqueio neuromuscular em insetos. A injeção de JBU em baratas (Nauphoeta cinerea), apesar de não letal, induziu uma inibição da enzima acetilcolinesterase no SNC. A urease, assim como a acetilcolina ou o anticolinérgico neostigmina, também induziu um aumento no ritmo cardíaco das baratas. Insetos tratados com JBU tiveram um aumento no tempo de grooming, efeito comportamental este mimetizado com o tratamento por octopamina. Os resultados acima citados indicam um efeito da JBU no SNC do animal, interferindo com a neurotransmissão colinérgica e octopaminérgica e, possivelmente, também GABAérgica. A atividade de JBU sobre o sistema neuromuscular de insetos também foi estudada através de registros eletrofisiológicos do potencial de ação neural, muscular e de placa motora. Em preparação de músculo tarsal de gafanhoto (Locusta migratoria), a urease reduziu a amplitude do potencial de ação evocado; entretanto quando aplicada diretamente no músculo oviductal isolado, a JBU não alterou a resposta contrátil. Em preparações de placa motora de larvas da mosca-da-fruta Drosophila melanogaster, a urease aumentou a amplitude dos potenciais excitatórios pós-sinápticos (EJPs) e a frequência dos eventos miniaturas (mEJPs). O efeito da JBU sobre a junção neuromuscular de insetos foi reduzido conforme a concentração de cálcio no meio extracelular também foi reduzida e completamente revertido quando o cálcio foi removido do meio (presença de EGTA e cloreto de Co2+), indicando que a mobilidade de íons de cálcio possui um papel importante na toxicidade induzida por JBU no inseto. Experimentos de imagem de cálcio em gânglios de N. cinerea confirmaram um maior influxo de cálcio no neurônio na presença de JBU, indicando que mobilidade do cálcio através da membrana foi alterada. Os resultados obtidos confirmam que a urease induz neurotoxicidade em insetos tanto a nível central como periférico, atuando sobre os gânglios do cordão nervoso, sobre neurônios aferentes e sobre o terminal pré-sináptico de neurônios motores. A neurotoxicidade induzida por JBU aparenta ser dependente do influxo de íons de cálcio no neurônio. / Ureases, enzymes that catalyse the hydrolysis of urea into ammonia and carbon dioxide, are synthesized by plants, fungi and bacteria. The legume Canavalia ensiformis, known as jack bean, produces different isoforms of ureases, being the jack bean urease (JBU) its major isoform. Ureases have insecticidal activity against different insect species and one of effects induced by JBU is a neuromuscular blockage. The aim of this work is to further understand the mechanism of action behind this blockage. The injection of JBU into cockroaches (Nauphoeta cinerea), despite not lethal, caused inhibition of brain acetylcholinesterase enzyme. Urease, as well as acetylcholine or the anticholinesterase drug neostigmine, induced a positive cardiac chronotropism in cockroaches. Similar to octopamine, JBU induced an increase in the time spent on grooming behaviour. These results indicate that JBU may act on the central nervous system of the animal by interfering with neurotransmission, more specifically on the cholinergic, octopaminergic and, possibly, GABAergic pathways. The activity of JBU on the neuromuscular junction of insects was studied through electrophysiological recordings. On the tarsus muscle of locust (Locusta migratoria), JBU reduced the amplitude of evoked muscle potentials, but did not alter the contractile response when applied to the oviduct muscle isolated. When applied on the end-plate of flies (Drosophila melanogaster) JBU led to an increase in the amplitude of Excitatory Junctional Potentials (EJPs), as well as to higher frequency of miniature Excitatory Junctional Potentials (mEJPs). JBU’s effect on the neuromuscular junction was reduced when the extracellular calcium concentrations decreased, and it was completely reversed when in calcium free preparations (in the presence of EGTA and Cobalt chloride), indicating that calcium mobility may play an important role in JBU-induced toxicity. Calcium imaging of cockroach ganglions revealed increased calcium influx upon exposition to JBU. These results indicate that JBU induces a central and peripheral neurotoxicity in insects, by interfering on neurotransmitters release or signalling in the ventral nerve cord, in the afferent neurons and in the motor neurons. Moreover, JBU-induced neurotoxicity depends on the influx of calcium ions into the neurons.

Resumo não disponível.

Ureases (EC 3.5.1.5) são amplamente distribuídas em bactérias, fungos e plantas onde sua função biológica não é completamente conhecida. Acredita-se que ureases estejam envolvidas na biodisponibilidade de nitrogênio e mecanismos de defesa contra predadores e patógenos. Plantas de soja Glycine max (L.) Merril contêm duas isoformas de urease. Neste trabalho, clonamos e seqüenciamos um fragmento de 300 pb que corresponde a uma região interna do gene de urease. Relatamos, também, a utilização de um gene de soja como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. Plantas transgênicas de tabaco (Nicotiana tobacum var. Turkish) contendo o cDNA codificador completo da urease ubíqua de soja sob a regulação do promotor 35S do vírus do mosaico da couveflor (CaMV) e do terminador do gene da nopalina sintase, foram geradas a partir da transformação de discos foliares por Agrobacterium tumefaciens. Extratos proteicos obtidos a partir das folhas das plantas transgênicas foram analisados quanto à atividade ureásica e à imunorreatividade contra anticorpos da urease do feijão-de-porco. A habilidade dos extratos proteicos em inibir o crescimento de fungos fitopatogênicos foi comparada com a atividade fungicida da urease embrião-específica isolada de sementes tipo-selvagem. Nossos resultados demonstraram a atividade antifúngica de ambas as isoformas de urease e apresentaram uma correlação positiva entre a inibição do crescimento de fungos e o conteúdo/atividade da urease ubíqua de soja recombinante. Os dados sugerem que a superexpressão da urease, em plantas transgências, pode auxiliar na resistência das plantas contra fungos fitopatogênicos, além de seus efeitos conhecidos sobre insetos. / Ureases (EC 3.5.1.5) are largely distributed in bacterial, fungi and plants, where theis physiological role is not completely understood. It is thought that ureases are involved in nitrogen bioavailability and defense mechanisms against predators and pathogens. Soybean [Glycine max (L.) Merril] plants contain two isoforms of urease. Here we describe the cloning and sequencing of a fragment of 300 bp corresponding to an internal region of one of the soybean urease genes. Here we also reported the employment of a gene from soybean as a tool to confer resistance to fungal diseases in plants. Transformed tobacco (Nicotiana tobacum var. Turkish) plants harbouring the full length cDNA encoding the soybean ubiquitous urease under the control of the Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S promoter and the nopaline synthase gene (nos) terminator were obtained after leaf disc transformation by Agrobacterium tumefaciens. Leaf protein extracts of transgenic plants were analyzed for urease activity and immunoreactivity against antibodies to the jackbean urease. The ability of leaf protein extracts to impair growth of selected phytopathogens was compared to the fungicidal activity of the embryo-specific urease isolated from wild-type seeds. Our results demonstrated the antifungal activity of both soybean ureases and showed a positive correlation between the inhibiton of fungal growth and content/activity of the recombinant soybean ubiquitous urease in leaves of transgenic tobacco. The data suggest that urease overexpression in transgenic plants may help to improve plant resistance against phytopathogenic fungi, besides its known effect on insects.

Ureases (EC 3.5.1.5) são metaloenzimas que hidrolisam uréia para produzir amônia e dióxido de carbono. Estas enzimas, que são amplamente encontradas em fungos, bactérias e plantas, compartilham de estruturas similares. A presença de urease em várias bactérias patogênicas (Helicobacter pylori e Proteus mirabilis, p.e) está fortemente correlacionada com a patogênese em doenças humanas. Muitos fungos de importância médica possuem atividade ureásica, entre eles citamos Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, e espécies de Trichosporon e Aspergillus. C. neoformans é uma levedura que produz vários fatores de virulência conhecidos, como presença de cápsula polisacarídica, produção de melanina e capacidade de desenvolvimento a 37ºC. A maioria de isolados clínicos produz grandes quantidades de urease e muitos autores sugerem que a urease de Cryptococcus exerça uma função importante na patogênese, porém com mecanismos ainda não esclarecidos. Cryptococcus gattii – sorotipo B, tipo molecular VGII, linhagem R265, com capacidade de infectar pacientes imunocompetentes, causou uma epidemia na Ilha de Vancouver (Canadá) entre 1999 e 2003. Neste trabalho desenvolvemos um procedimento de purificação e apresentamos a caracterização físico-química e cinética da urease de C. gattii, cepa R265, após ter sido purificada na razão de 539 vezes. A massa molecular estimada foi de 120 kDa, Km 2,0 mM para uréia, pH ótimo 8,0. O ácido acetohidroxâmico demonstrou ser um bom inibidor em concentrações micromolares, enquanto ρ-hidroximercuriobenzoato causou inibição em concentrações mais altas, comparado a outras ureases. Espera-se que estudos adicionais com essa urease purificada permitam investigar propriedades biológicas independentes da atividade ureolítica e estabelecer sua contribuição para a patogênese da criptococose. / Ureases (EC 3.5.1.5) are metalloenzymes that hydrolyze urea to produce ammonia and carbon dioxide. These enzymes, which are found in fungi, bacteria, and plants show very similar structures. The presence of urease in many pathogenic bacteria (Helicobacter pylori and Proteus mirabilis) is strongly correlative with pathogenesis in human diseases. Many medically important fungi have urease activity, among which are Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, and species of Trichosporon and Aspergillus. C. neoformans is a heterothallic yeast with several known virulence factors, including a polysaccharide capsule, melanin production, and the ability to grow at 37°C.The majority of clinical isolates produce large amounts of urease and several authors suggest that Cryptococcal urease play an important role in pathogenesis but with unclear mechanisms but probably by different routes dependent and independent of ureolytic activity, althought many questions are unclear. We wanted to further investigate the role of urease in biological properties by using Cryptococcus gattii as a pathogen model. C. gatti – serotype B, molecular type VGII, R265 strain, which has capacity to infect immunocompetent individuals, caused an outbreak on Vancouver Island in Canada from 1999 to 2003. This work presents the physicochemical characterization of a urease from C. gatti strain R265 after a 539 fold purification. The estimated native molecular mass was 120 kDa, Km 2.0 mM urea, pH optimum 8.0. Aceto hydroxamic acid was a strong inhibitor at low concentration while ρ-hidroxy mercuribenzoate needed higher concentrations for inhibition compared to other ureases.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:42:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:01:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 05260.pdf: 3271638 bytes, checksum: 3c81946b610ffe4855554bee4dc14f64 (MD5) / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Ureases são tradicionalmente conhecidas por catalisar a hidrólise da ureia em amônia e dióxido de carbono. Em soja, três isoformas de urease foram descritas: 1) urease ubíqua, codificada pelo gene Eu4; 2) urease embrião específica, codificada pelo gene Eu1; 3) urease SBU-III, codificada por Eu5. O nitrogênio (N) é o nutriente mais limitante para o crescimento e desenvolvimento da planta. Portanto, mecanismos eficientes para capturar o N nas suas diversas formas, e realocá-lo, são necessários para otimizar o uso do nutriente pela planta. O produto N da atividade da urease - a amônia é incorporada em compostos orgânicos, principalmente, pela atividade da glutamina sintetase. Assim, a urease está envolvida na remobilização do N, bem como na assimilação do N primário. Um estudo anterior foi realizado por nossa equipe com o objetivo de superexpressar o gene Eu4 em plantas de soja. Inesperadamente, as plantas transgênicas exibiram cosupressão do transgene Eu4 e de todos os genes endógenos que codificam as isoformas de urease. Foi verificada também, uma diminuição da atividade ureolítica. Visando determinar o papel das ureases no desenvolvimento da soja, foram comparadas plantas transgênicas co-suprimidas, plantas mutantes e seus respectivos controles. O desenvolvimento das plantas foi avaliado 7, 14, 21 e 30 dias após a semeadura. As plantas co-suprimidas apresentaram um atraso no desenvolvimento durante o primeiro mês após a germinação. Um desenvolvimento mais lento foi observado para o duplo mutante eu1- a/eu4- e o mutante simples eu3-a (este gene codifica uma proteína acessória inativa). A absorção de N nas plantas transgênicas foi significativamente menor do que a das plantas não transgênicas. Entre os mutantes, eu3-a apresentou o menor e eu1-a o maior conteúdo de N. Um número significativamente menor de sementes foi obtido para as plantas transgênicas. Em conjunto estes resultados indicam que o aconteúdo da urease ou da atividade ureolítica desempenham um papel importante no desenvolvimento da planta. A soja (Glycine max) é afetada por vários estresses bióticos e abióticos, que limitam a distribuição geográfica das culturas e levam a reduções significativas de crescimento e produtividade. No Brasil, as doenças causadas por nematoides são um dos estresses bióticos mais prejudiciais para a soja. As principais espécies encontradas no Brasil são Meloidogyne spp. (formadores de galhas), Heterodera glycines (cisto), Pratylenchus brachyurus (lesões radiculares) e Rotylenchulus reniformis (reniforme). Nematoides formadores de galhas e de cisto (nematóides sedentários), os patógenos mais prejudiciais à soja, são muito difíceis de controlar. Neste estudo, foi identificado um peptídeo derivado da urease de soja (nomeado Soyuretox), que exerce efeito tóxico contra fitonematoides formadores de galhas (M. javanica). Soyuretox foi expresso em raízes de plantas compostas plantas transgênicas estáveis de soja. Raízes de plantas compostas e plantas transgênicas estáveis superexpressando Soyuretox exibiram uma redução significativa (50% e 37.5%, respectivamente) no número médio de nematoides e ovos, quando comparado com raízes não transformadas, 45 dias após a inoculação. Este é o primeiro relato de resistência a nematóides causada por um peptideo derivado de uma urease. Soyuretox pode representar uma ferramenta útil bem como uma nova e eficiente alternativa para o controle de pragas e doenças em culturas economicamente importantes. / Ureases are traditionally known for catalyzing the hydrolysis of urea to ammonia and carbon dioxide. In soybean, three urease isoforms have been described: 1) ubiquitous urease, encoded by the Eu4 gene; 2) embryo-specific urease, encoded by Eu1gene; 3) SBU-III urease, encoded by Eu5. Nitrogen (N) is the most limiting nutrient for plant growth and development. Therefore efficient mechanisms both to take up N in its various forms, and to reallocate it, are necessary for optimal N use efficiency. The N product of urease activity- ammonia- is incorporated into organic compounds mainly by glutamine synthase activity. Thus, urease is involved in N remobilization, as well as in primary N assimilation. A previous study was performed by our team aiming to overexpress Eu4 gene in soybean plants. Unexpectedly, the transgenic plants exhibited endogenous (for all three genes) and introduced Eu4 transgene co-suppression and decreased ureolytic activity. Here, we sought to determine urease roles in soybean development by silencing all urease isoforms. Analyses were performed using transgenic co-suppressed and mutant plants. Plant development was evaluated 7, 14, 21 and 30 days after sowing. The cosuppressed plants presented a developmental delay during the first month after germination when compared with control. A slower development was observed for the double eu1-a/eu4-a mutant and the eu3-a (this gene codify an inactive accessory protein) single mutant. The N uptake in transgenic plants was significantly lower than that captured by non-transgenic plants. Among mutants, eu3-a presented the lowest and eu1- a the highest N content. A significantly lower number of seeds was obtained for transgenic plants. Altogether, these results indicate that the urease content and/or ureolytic activity play an important role in plant development. Soybeans (Glycine max) are affected by several abiotic and biotic stresses that limit the geographical distribution of cultures and lead to significant reductions in growth and productivity. In Brazil, the diseases caused by nematodes are one of the most damaging biotic stresses for soybeans.. The main species found in Brazil are Meloidogyne spp. (root-knot), Heterodera glycines (cyst), Pratylenchus brachyurus (root lesion) and Rotylenchulus reniformis (reniform). Root-knot and cyst nematodes (sedentary nematodes), the most damaging soybean pathogens, are very difficult to control. In this study, we identified a soybean urease-derived peptide (named Soyuretox) that exerts toxic effects against the root-knot phytonematode (M. javanica). Soyuretox was expressed in soybean roots of composite plants and complete stable transgenic plants. Roots of composite plants and stable transgenic plants overexpressing Soyuretox exhibited a significant reduction (50% and 37.5%, respectively) in the average number of nematodes and eggs when compared with non-transformed roots, 45 days after inoculation. This is the first report of nematode resistance caused by a urease-derived peptide. Soyuretox may represent a useful tool as a new and efficient alternative to control pests and diseases in economically important crops.

Ureases, enzimas que catalisam a hidrólise da ureia formando amônia e dióxido de carbono, são sintetizadas por plantas, fungos e bactérias. A espécie leguminosa Canavalia ensiformis, conhecida em inglês como Jack Bean, produz diferentes isoformas de ureases, sendo a chamada Jack Bean Urease (JBU) a isoforma majoritária. Ureases possuem atividade inseticida já comprovada para diferentes espécies de insetos e um dos seus efeitos no animal é o bloqueio neuromuscular. O objetivo deste trabalho foi compreender o mecanismo de ação responsável pela atividade neurotóxica da JBU e pelo bloqueio neuromuscular em insetos. A injeção de JBU em baratas (Nauphoeta cinerea), apesar de não letal, induziu uma inibição da enzima acetilcolinesterase no SNC. A urease, assim como a acetilcolina ou o anticolinérgico neostigmina, também induziu um aumento no ritmo cardíaco das baratas. Insetos tratados com JBU tiveram um aumento no tempo de grooming, efeito comportamental este mimetizado com o tratamento por octopamina. Os resultados acima citados indicam um efeito da JBU no SNC do animal, interferindo com a neurotransmissão colinérgica e octopaminérgica e, possivelmente, também GABAérgica. A atividade de JBU sobre o sistema neuromuscular de insetos também foi estudada através de registros eletrofisiológicos do potencial de ação neural, muscular e de placa motora. Em preparação de músculo tarsal de gafanhoto (Locusta migratoria), a urease reduziu a amplitude do potencial de ação evocado; entretanto quando aplicada diretamente no músculo oviductal isolado, a JBU não alterou a resposta contrátil. Em preparações de placa motora de larvas da mosca-da-fruta Drosophila melanogaster, a urease aumentou a amplitude dos potenciais excitatórios pós-sinápticos (EJPs) e a frequência dos eventos miniaturas (mEJPs). O efeito da JBU sobre a junção neuromuscular de insetos foi reduzido conforme a concentração de cálcio no meio extracelular também foi reduzida e completamente revertido quando o cálcio foi removido do meio (presença de EGTA e cloreto de Co2+), indicando que a mobilidade de íons de cálcio possui um papel importante na toxicidade induzida por JBU no inseto. Experimentos de imagem de cálcio em gânglios de N. cinerea confirmaram um maior influxo de cálcio no neurônio na presença de JBU, indicando que mobilidade do cálcio através da membrana foi alterada. Os resultados obtidos confirmam que a urease induz neurotoxicidade em insetos tanto a nível central como periférico, atuando sobre os gânglios do cordão nervoso, sobre neurônios aferentes e sobre o terminal pré-sináptico de neurônios motores. A neurotoxicidade induzida por JBU aparenta ser dependente do influxo de íons de cálcio no neurônio. / Ureases, enzymes that catalyse the hydrolysis of urea into ammonia and carbon dioxide, are synthesized by plants, fungi and bacteria. The legume Canavalia ensiformis, known as jack bean, produces different isoforms of ureases, being the jack bean urease (JBU) its major isoform. Ureases have insecticidal activity against different insect species and one of effects induced by JBU is a neuromuscular blockage. The aim of this work is to further understand the mechanism of action behind this blockage. The injection of JBU into cockroaches (Nauphoeta cinerea), despite not lethal, caused inhibition of brain acetylcholinesterase enzyme. Urease, as well as acetylcholine or the anticholinesterase drug neostigmine, induced a positive cardiac chronotropism in cockroaches. Similar to octopamine, JBU induced an increase in the time spent on grooming behaviour. These results indicate that JBU may act on the central nervous system of the animal by interfering with neurotransmission, more specifically on the cholinergic, octopaminergic and, possibly, GABAergic pathways. The activity of JBU on the neuromuscular junction of insects was studied through electrophysiological recordings. On the tarsus muscle of locust (Locusta migratoria), JBU reduced the amplitude of evoked muscle potentials, but did not alter the contractile response when applied to the oviduct muscle isolated. When applied on the end-plate of flies (Drosophila melanogaster) JBU led to an increase in the amplitude of Excitatory Junctional Potentials (EJPs), as well as to higher frequency of miniature Excitatory Junctional Potentials (mEJPs). JBU’s effect on the neuromuscular junction was reduced when the extracellular calcium concentrations decreased, and it was completely reversed when in calcium free preparations (in the presence of EGTA and Cobalt chloride), indicating that calcium mobility may play an important role in JBU-induced toxicity. Calcium imaging of cockroach ganglions revealed increased calcium influx upon exposition to JBU. These results indicate that JBU induces a central and peripheral neurotoxicity in insects, by interfering on neurotransmitters release or signalling in the ventral nerve cord, in the afferent neurons and in the motor neurons. Moreover, JBU-induced neurotoxicity depends on the influx of calcium ions into the neurons.

Ureases, apesar de sua importância histórica para a Bioquímica, ainda são enigmáticas. Pouco se sabe a respeito de suas propriedades não-catalíticas, por exemplo. Nesse contexto, o presente trabalho submeteu uma urease de Canavalia ensiformis (JBURE-IIB) a simulações de dinâmica molecular, nos níveis de detalhamento atomístico e coarse-grained, buscando obter uma caracterização conformacional dessa urease, tanto como monômero quanto como trímero. Os dados assim obtidos sugerem que os domínios da proteína apresentam diferentes mobilidades, sendo o domínio γ o mais flexível. Esse domínio é também o principal responsável pela compactação do monômero da urease isolado, quando comparado à sua conformação cristalográfica. A mobilidade do domínio γ foi também associada ao processo de oligomerização da enzima. A forma trimérica da urease de C. ensiformis também se tornou mais compacta após a simulação, apontando as ureases como moléculas altamente flexíveis, principalmente devido às regiões de alças que conectam domínios estruturais, no caso de ureases vegetais. Sendo uma propriedade não necessariamente associada à catálise, a análise de tal flexibilidade pode auxiliar tentativas futuras de explicar a participação não-catalítica da urease em suas propriedades multifuncionais. / Ureases, despite their historical importance in biochemistry, are still enigmatic. For instance, little is known about their non-catalytic properties. In this context, the current work submitted a Canavalia ensiformis urease (JBURE-IIB) to molecular dynamics simulations at both atomistic and coarse-grained levels in order to obtain a conformational characterization of such urease in both monomeric and trimeric forms. The data suggest that the domains of the protein present different mobilities, with the γ domain being the most flexible one. This domain is also the main responsible for the compactness of the isolated urease monomer when compared to its crystallographic conformation. The γ domain mobility was also associated with the oligomerization process of the enzyme. The trimeric form of C. ensiformis urease also became more compact after simulation, pointing to ureases as highly flexible molecules, mainly due to coiled regions connecting the structural domains, in the case of plant ureases. As a property not necessarily related to catalysis, the analysis of this flexibility may enlighten further efforts to solve the non-catalytic aspects of urease in its moonlighting properties.

Nematóides entomopatogênicos (NEPS) e bactérias simbiontes representam uma das estratégias não-químicas mais bem sucedidas para o controle de insetos. Os juvenis infectivos dos nematóides Heterorhabditis sp. e Steinernema sp. buscam o hospedeiro no solo, o penetram através de aberturas naturais e rapidamente matam o inseto pela liberação, na hemocele, de bactérias entomopatogênicas dos gêneros Photorhabdus sp. e Xenorhabdus sp., respectivamente. A lagarta militar, Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) é uma das principais pragas da cultura do milho (Zea mays) no Brasil e os danos provocados pelo inseto reduzem o rendimento da cultura em até 39% e perdas de 500 milhões de dólares anuais. Isolados nativos de nematóides entomopatogênicos ativos contra S. frugiperda representam uma alternativa promissora ao uso intensivo de inseticidas químicos para o controle da lagarta-militar nas plantações de milho. Este estudo caracterizou a patogenicidade de oito isolados NEPs de incidência regional (denominados NEPETs) para o controle da praga em estádios associados ao solo. Os testes foram realizados com larvas de último ínstar (in vitro) e na fase de pré-pupa (in vitro e no solo). Os dados indicam que os percentuais de mortalidade mais elevados, tanto para lagartas como para pré-pupas, foram produzidos por isolados da família Heterorhabditidae. Estes isolados também foram os que produziram maior número de juvenis infectivos/larva mostrando a capacidade de multiplicação de NEPETs neste hospedeiro. As bactérias simbióticas associada aos nematóides entomopatogênicos foram isoladas, caracterizadas por testes bioquímicos e classificadas com base no seqüenciamento do 16S rDNA. Os isolados bacterianos, identificados como Photorhabdus e Xenorhabdus, quando injetados na hemocele de S. frugiperda produziram altos níveis de letalidade particularmente aqueles obtidos a partir dos nematóides da família Heterorhabditidae. Também avaliou-se a produção de urease de quatro bactérias entomopatogênicas, duas Photorhabdus e duas Xenorhabdus, in vitro e ao longo da infecção promovida pela injeção de bactérias. O padrão de produção de urease in vitro seguiu a curva de crescimento bacteriano e houve acúmulo da enzima na fase estacionária. Os dados sugerem uma correlação positiva entre a produção de urease pela bactéria e os efeitos entomopatogênicos sobre as lagartas. Há correlação direta entre a atividade específica alcançada por ureases ácidas na fase estacionária e mortalidade induzida por bactérias injetadas em lagartas de S. frugiperda. / Entomopathogenic nematodes (EPNs) and symbiotic bacteria represent one of the best non-chemical strategies for insect control. Infective juveniles of Heterorhabditis sp. and Steinernema sp. nematodes actively seek the host in the soil, penetrating through insect’s natural openings to reach the hemocoel where symbiotic bacteria Photorhabdus sp. and Xenorhabdus sp., respectively, are released and rapidly kill the insect host. The fall armyworm Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) is one of the major insect pests in corn (Zea mays) crops in Brazil, with infestations resulting in reduction up to 39% yield and losses amounting US$ 500 millions annually. Native strains of entomopathogenic nematodes active against S. frugiperda represent a promising alternative to the intensive use of chemical insecticides to control fall armyworm population in corn plantations. This study characterized the pathogenicity of eight EPNs isolates of regional incidence (denominated NEPETs) in stages where pest is associated to the soil. Tests were conducted with last instar larvae (in vitro) and in prepupae stage (in vitro and in soil). Data indicate that the highest mortality percentages, either for worms or prepupae, were produced by isolates of the Heterorhabditidae family. These isolates were also the ones that produced higher amounts of IJs/larvae showing the multiplication capacity of NEPETs on the host insect. Symbiotic bacteria associated to the entomopathogenic nematodes were successfully isolated and classified taxonomically both by phenotypic-biochemical criteria and sequencing of 16S rDNA. Isolated bacteria, identified as Photorhabdus and Xenorhabdus, injected into S. frugiperda hemocoel produced high levels of lethality particularly those from Heterorhabditidae family. We also studied the urease production of four entomopathogenic bacteria, two Photorhabdus and two Xenorhabdus, both in vitro and during the course of infection caused by injection of the bacteria. The pattern of urease production in vitro followed the bacteria growth curve accumulating in high levels towards the stationary phase. The data suggest a positive correlation between urease production by the bacteria and their entomopathogenic effect. There is direct correlation between the specific activity reached by acidic ureases at the stationary phase and mortality induced by injecting bacteria into S. frugiperda larvae.

Ureases (EC 3.5.1.5.) catalisam a hidrólise de ureia em NH3 e CO2, sendo sintetizadas por plantas, fungos e bactérias. No solo, a urease é encontrada em microrganismos, raízes de plantas e como uma enzima extracelular ligada a compostos orgânicos e inorgânicos. Em plantas e fungos, as ureases consistem em trímeros ou hexâmeros formados por uma subunidade de 90 kDa, enquanto que enzimas bacterianas são complexos com duas ou três subunidades. A inserção de dois átomos de níquel no sítio ativo requer pelo menos três proteínas acessórias, UreD, UreF e UreG em bactérias, ou seus ortólogos em plantas e fungos. Bradyrhizobium japonicum é uma bactéria do solo que forma nódulos fixadores de nitrogênio em plantas de soja. Esse microrganismo produz uma urease, e seu papel na sinalização, tanto para a planta de soja quanto para outros organismos no complexo ambiente da rizosfera, ainda não foi investigado. Desta forma, o presente estudo objetivou purificar e caracterizar a urease de B. japonicum (BJU), bem como avaliar o papel desta enzima, tanto a de origem vegetal quanto a de origem bacteriana, no processo de nodulação da soja. A capacidade da enzima em induzir exocitose/secreção foi avaliada no teste de agregação plaquetária, utilizando-se plasma rico em plaquetas obtido de sangue de coelho e monitorando-se a agregação por turbidimetria. Observamos que a urease de B. japonicum possui a propriedade de agregar plaquetas, implicando em uma provável atividade indutora de exocitose. Ensaios de quimiotaxia demonstraram a atração exercida pela urease ubíqua recombinante de soja sobre células de B. japonicum. Para os ensaios de nodulação, sementes pré-germinadas de soja tiposelvagem (Williams 82) e de mutantes deficientes na proteína urease (eu1-sun/eu4) foram expostas a culturas de B. japonicum USDA110 (tipo selvagem), B. japonicum ΔureG (ausência de atividade ureásica) ou B. japonicum ΔureABC (ausência de urease), e semeadas em vasos de Leonard modificados. Os nódulos foram contados e pesados em diferentes tempos após a inoculação. Além disso, foi determinado o conteúdo de leghemoglobina destes nódulos e o conteúdo de nitrogênio na parte aérea das plantas, como uma maneira de estimar a eficiência da fixação biológica de nitrogênio. Plantas deficientes em urease formam nódulos maiores e em menor número que as selvagens, independente do fenótipo da bactéria. O pico de produção de leghemoglobina em plantas tipo-selvagem é maior e anterior ao pico observado nas plantas mutantes. Inibição de toda a atividade enzimática de urease nas plantas selvagens pelo inibidor fenilfosforodiamidato não causou as alterações observadas pela ausência da proteína urease nas plantas mutantes. Esses resultados sugerem que o desenvolvimento do nódulo em plantas requer a proteína urease, de maneira independente de sua atividade enzimática. Em contraste, a urease da bactéria parece não influenciar a nodulação ou a fixação biológica de N2 na planta. Concluímos que a urease da soja apresenta um papel relevante na simbiose planta - B. japonicum, independente de sua atividade ureolítica, e não compartilhado com a urease bacteriana. / Ureases (EC 3.5.1.5.) catalyze the hydrolysis of urea in NH3 and CO2, and are synthesized by plants, fungi and bacteria. In the soil, urease occurs in microorganisms and plant roots, and as an extracellular enzyme bound to organic and inorganic compounds. In plants and fungi, ureases consist of trimers or hexamers formed by a subunit of 90 kDa, whereas bacterial enzymes are complexes with two or three subunits. The insertion of two nickel atoms into the active site requires at least three accessory proteins, ureD, ureF, and ureG in bacteria, or their orthologs in plants and fungi. Bradyrhizobium japonicum is a soil bacterium that forms nitrogen fixing nodules on soybean plants. This bacterium produces a urease, and its role in signaling for both the soybean plant and other organisms in the complex environment of the rhizosphere, has not yet been investigated. Thus, the present study aimed to purify and characterize B. japonicum urease (BJU), and to evaluate the role of this enzyme, from both plant and bacteria, in the process of soybean nodulation. The induction of secretion was assessed by the ability of the enzyme to induce platelet aggregation in rabbit platelet-rich plasma monitored by turbidimetry. We found that the urease of B. japonicum possesses the property of aggregating platelets, implying a secretion inducing activity. Chemotaxis assays demonstrated the attraction of recombinant soybean ubiquitous urease upon B. japonicum cells. For nodulation assays, pre-germinated seeds of wild-type soybeans (Williams 82) and of mutants deficient in the urease protein (eu1-sun/eu4) were exposed to cultures of B. japonicum USDA110 (wild-type), B. japonicum ΔureG (lack of urease activity) or B. japonicum ΔureABC (no urease), and planted in modified Leonard jars. The nodules were counted and weighed at different times after inoculation. Additionally, we determined the leghemoglobin content of nodules and the nitrogen content in the shoots, as a way to estimate the efficiency of biological nitrogen fixation. Plants deficient in urease (eu1-sun/eu4) form fewer but larger nodules than wildtype plants, regardless of the phenotype of the bacteria. The peak of leghemoglobin production in wild-type plants is higher and earlier than the peak observed in mutant plants. Inhibition of all the enzymatic activity of urease in wild-type plants by phenylphosphorodiamidate did not result in the alterations seen in mutant plants lacking urease. These results suggest that the development of nodule requires the protein urease, but not its enzyme activity. In contrast, the bacterial urease seems to play no roles in the nodulation and biological N2 fixation in the plant. We conclude that the soybean urease plays an important role in the soybean - B. japonicum symbiosis, which is independent of its ureolytic activity and is not shared by the bacterial urease.