A urease de Canavalia ensiformis é de relevância histórica tendo sido a primeira proteína a ser cristalizada, feito realizado por Sumner em 1926 comprovando assim a natureza protéica das enzimas. Essa proteína também foi a primeira enzima contendo níquel a ser identificada. As ureases são amplamente encontradas em vegetais, bactérias e fungos, apresentando um alto grau de homologia entre si. Esta similaridade de seqüência primária indica um processo conservativo durante a Evolução e um papel fisiológico importante destas enzimas. As ureases microbianas estão envolvidas em processos patogênicos como formação de cálculos urinários, incrustação de catéter, pielonefrites, úlceras pépticas e possivelmente, na formação de tumores de estômago. Em vegetais, pouco se sabe a respeito da função biológica das ureases, embora sua presença em tecidos vegetais seja freqüente. Postula-se seu envolvimento na biodisponibilidade de nitrogênio; ou mesmo como mecanismo de defesa dos vegetais. A canatoxina, uma isoforma de urease isolada da C. ensiformis, é tóxica para insetos e possui outras atividades biológicas de interesse, dentre as quais destacam-se: 1) atividade secretagoga e pró-agregante em plaquetas de coelho; 2) atividade hemaglutinante indireta para hemácias de coelho; 3) propriedade próinflamatória, evidenciada nos modelos de edema de pata e pleuresia em ratos. Este estudo propõe-se a investigar se ureases bacterianas apresentariam propriedades biológicas como as da canatoxina; e se essas propriedades são dependentes ou não da atividade enzimática dessas ureases.

Ureases, apesar de sua importância histórica para a Bioquímica, ainda são enigmáticas. Pouco se sabe a respeito de suas propriedades não-catalíticas, por exemplo. Nesse contexto, o presente trabalho submeteu uma urease de Canavalia ensiformis (JBURE-IIB) a simulações de dinâmica molecular, nos níveis de detalhamento atomístico e coarse-grained, buscando obter uma caracterização conformacional dessa urease, tanto como monômero quanto como trímero. Os dados assim obtidos sugerem que os domínios da proteína apresentam diferentes mobilidades, sendo o domínio γ o mais flexível. Esse domínio é também o principal responsável pela compactação do monômero da urease isolado, quando comparado à sua conformação cristalográfica. A mobilidade do domínio γ foi também associada ao processo de oligomerização da enzima. A forma trimérica da urease de C. ensiformis também se tornou mais compacta após a simulação, apontando as ureases como moléculas altamente flexíveis, principalmente devido às regiões de alças que conectam domínios estruturais, no caso de ureases vegetais. Sendo uma propriedade não necessariamente associada à catálise, a análise de tal flexibilidade pode auxiliar tentativas futuras de explicar a participação não-catalítica da urease em suas propriedades multifuncionais. / Ureases, despite their historical importance in biochemistry, are still enigmatic. For instance, little is known about their non-catalytic properties. In this context, the current work submitted a Canavalia ensiformis urease (JBURE-IIB) to molecular dynamics simulations at both atomistic and coarse-grained levels in order to obtain a conformational characterization of such urease in both monomeric and trimeric forms. The data suggest that the domains of the protein present different mobilities, with the γ domain being the most flexible one. This domain is also the main responsible for the compactness of the isolated urease monomer when compared to its crystallographic conformation. The γ domain mobility was also associated with the oligomerization process of the enzyme. The trimeric form of C. ensiformis urease also became more compact after simulation, pointing to ureases as highly flexible molecules, mainly due to coiled regions connecting the structural domains, in the case of plant ureases. As a property not necessarily related to catalysis, the analysis of this flexibility may enlighten further efforts to solve the non-catalytic aspects of urease in its moonlighting properties.

Nematóides entomopatogênicos (NEPS) e bactérias simbiontes representam uma das estratégias não-químicas mais bem sucedidas para o controle de insetos. Os juvenis infectivos dos nematóides Heterorhabditis sp. e Steinernema sp. buscam o hospedeiro no solo, o penetram através de aberturas naturais e rapidamente matam o inseto pela liberação, na hemocele, de bactérias entomopatogênicas dos gêneros Photorhabdus sp. e Xenorhabdus sp., respectivamente. A lagarta militar, Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) é uma das principais pragas da cultura do milho (Zea mays) no Brasil e os danos provocados pelo inseto reduzem o rendimento da cultura em até 39% e perdas de 500 milhões de dólares anuais. Isolados nativos de nematóides entomopatogênicos ativos contra S. frugiperda representam uma alternativa promissora ao uso intensivo de inseticidas químicos para o controle da lagarta-militar nas plantações de milho. Este estudo caracterizou a patogenicidade de oito isolados NEPs de incidência regional (denominados NEPETs) para o controle da praga em estádios associados ao solo. Os testes foram realizados com larvas de último ínstar (in vitro) e na fase de pré-pupa (in vitro e no solo). Os dados indicam que os percentuais de mortalidade mais elevados, tanto para lagartas como para pré-pupas, foram produzidos por isolados da família Heterorhabditidae. Estes isolados também foram os que produziram maior número de juvenis infectivos/larva mostrando a capacidade de multiplicação de NEPETs neste hospedeiro. As bactérias simbióticas associada aos nematóides entomopatogênicos foram isoladas, caracterizadas por testes bioquímicos e classificadas com base no seqüenciamento do 16S rDNA. Os isolados bacterianos, identificados como Photorhabdus e Xenorhabdus, quando injetados na hemocele de S. frugiperda produziram altos níveis de letalidade particularmente aqueles obtidos a partir dos nematóides da família Heterorhabditidae. Também avaliou-se a produção de urease de quatro bactérias entomopatogênicas, duas Photorhabdus e duas Xenorhabdus, in vitro e ao longo da infecção promovida pela injeção de bactérias. O padrão de produção de urease in vitro seguiu a curva de crescimento bacteriano e houve acúmulo da enzima na fase estacionária. Os dados sugerem uma correlação positiva entre a produção de urease pela bactéria e os efeitos entomopatogênicos sobre as lagartas. Há correlação direta entre a atividade específica alcançada por ureases ácidas na fase estacionária e mortalidade induzida por bactérias injetadas em lagartas de S. frugiperda. / Entomopathogenic nematodes (EPNs) and symbiotic bacteria represent one of the best non-chemical strategies for insect control. Infective juveniles of Heterorhabditis sp. and Steinernema sp. nematodes actively seek the host in the soil, penetrating through insect’s natural openings to reach the hemocoel where symbiotic bacteria Photorhabdus sp. and Xenorhabdus sp., respectively, are released and rapidly kill the insect host. The fall armyworm Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) is one of the major insect pests in corn (Zea mays) crops in Brazil, with infestations resulting in reduction up to 39% yield and losses amounting US$ 500 millions annually. Native strains of entomopathogenic nematodes active against S. frugiperda represent a promising alternative to the intensive use of chemical insecticides to control fall armyworm population in corn plantations. This study characterized the pathogenicity of eight EPNs isolates of regional incidence (denominated NEPETs) in stages where pest is associated to the soil. Tests were conducted with last instar larvae (in vitro) and in prepupae stage (in vitro and in soil). Data indicate that the highest mortality percentages, either for worms or prepupae, were produced by isolates of the Heterorhabditidae family. These isolates were also the ones that produced higher amounts of IJs/larvae showing the multiplication capacity of NEPETs on the host insect. Symbiotic bacteria associated to the entomopathogenic nematodes were successfully isolated and classified taxonomically both by phenotypic-biochemical criteria and sequencing of 16S rDNA. Isolated bacteria, identified as Photorhabdus and Xenorhabdus, injected into S. frugiperda hemocoel produced high levels of lethality particularly those from Heterorhabditidae family. We also studied the urease production of four entomopathogenic bacteria, two Photorhabdus and two Xenorhabdus, both in vitro and during the course of infection caused by injection of the bacteria. The pattern of urease production in vitro followed the bacteria growth curve accumulating in high levels towards the stationary phase. The data suggest a positive correlation between urease production by the bacteria and their entomopathogenic effect. There is direct correlation between the specific activity reached by acidic ureases at the stationary phase and mortality induced by injecting bacteria into S. frugiperda larvae.

Resumo não disponível.

Ureases (EC 3.5.1.5) são amplamente distribuídas em bactérias, fungos e plantas onde sua função biológica não é completamente conhecida. Acredita-se que ureases estejam envolvidas na biodisponibilidade de nitrogênio e mecanismos de defesa contra predadores e patógenos. Plantas de soja Glycine max (L.) Merril contêm duas isoformas de urease. Neste trabalho, clonamos e seqüenciamos um fragmento de 300 pb que corresponde a uma região interna do gene de urease. Relatamos, também, a utilização de um gene de soja como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. Plantas transgênicas de tabaco (Nicotiana tobacum var. Turkish) contendo o cDNA codificador completo da urease ubíqua de soja sob a regulação do promotor 35S do vírus do mosaico da couveflor (CaMV) e do terminador do gene da nopalina sintase, foram geradas a partir da transformação de discos foliares por Agrobacterium tumefaciens. Extratos proteicos obtidos a partir das folhas das plantas transgênicas foram analisados quanto à atividade ureásica e à imunorreatividade contra anticorpos da urease do feijão-de-porco. A habilidade dos extratos proteicos em inibir o crescimento de fungos fitopatogênicos foi comparada com a atividade fungicida da urease embrião-específica isolada de sementes tipo-selvagem. Nossos resultados demonstraram a atividade antifúngica de ambas as isoformas de urease e apresentaram uma correlação positiva entre a inibição do crescimento de fungos e o conteúdo/atividade da urease ubíqua de soja recombinante. Os dados sugerem que a superexpressão da urease, em plantas transgências, pode auxiliar na resistência das plantas contra fungos fitopatogênicos, além de seus efeitos conhecidos sobre insetos. / Ureases (EC 3.5.1.5) are largely distributed in bacterial, fungi and plants, where theis physiological role is not completely understood. It is thought that ureases are involved in nitrogen bioavailability and defense mechanisms against predators and pathogens. Soybean [Glycine max (L.) Merril] plants contain two isoforms of urease. Here we describe the cloning and sequencing of a fragment of 300 bp corresponding to an internal region of one of the soybean urease genes. Here we also reported the employment of a gene from soybean as a tool to confer resistance to fungal diseases in plants. Transformed tobacco (Nicotiana tobacum var. Turkish) plants harbouring the full length cDNA encoding the soybean ubiquitous urease under the control of the Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S promoter and the nopaline synthase gene (nos) terminator were obtained after leaf disc transformation by Agrobacterium tumefaciens. Leaf protein extracts of transgenic plants were analyzed for urease activity and immunoreactivity against antibodies to the jackbean urease. The ability of leaf protein extracts to impair growth of selected phytopathogens was compared to the fungicidal activity of the embryo-specific urease isolated from wild-type seeds. Our results demonstrated the antifungal activity of both soybean ureases and showed a positive correlation between the inhibiton of fungal growth and content/activity of the recombinant soybean ubiquitous urease in leaves of transgenic tobacco. The data suggest that urease overexpression in transgenic plants may help to improve plant resistance against phytopathogenic fungi, besides its known effect on insects.

Ureases (EC 3.5.1.5) são metaloenzimas que hidrolisam uréia para produzir amônia e dióxido de carbono. Estas enzimas, que são amplamente encontradas em fungos, bactérias e plantas, compartilham de estruturas similares. A presença de urease em várias bactérias patogênicas (Helicobacter pylori e Proteus mirabilis, p.e) está fortemente correlacionada com a patogênese em doenças humanas. Muitos fungos de importância médica possuem atividade ureásica, entre eles citamos Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, e espécies de Trichosporon e Aspergillus. C. neoformans é uma levedura que produz vários fatores de virulência conhecidos, como presença de cápsula polisacarídica, produção de melanina e capacidade de desenvolvimento a 37ºC. A maioria de isolados clínicos produz grandes quantidades de urease e muitos autores sugerem que a urease de Cryptococcus exerça uma função importante na patogênese, porém com mecanismos ainda não esclarecidos. Cryptococcus gattii – sorotipo B, tipo molecular VGII, linhagem R265, com capacidade de infectar pacientes imunocompetentes, causou uma epidemia na Ilha de Vancouver (Canadá) entre 1999 e 2003. Neste trabalho desenvolvemos um procedimento de purificação e apresentamos a caracterização físico-química e cinética da urease de C. gattii, cepa R265, após ter sido purificada na razão de 539 vezes. A massa molecular estimada foi de 120 kDa, Km 2,0 mM para uréia, pH ótimo 8,0. O ácido acetohidroxâmico demonstrou ser um bom inibidor em concentrações micromolares, enquanto ρ-hidroximercuriobenzoato causou inibição em concentrações mais altas, comparado a outras ureases. Espera-se que estudos adicionais com essa urease purificada permitam investigar propriedades biológicas independentes da atividade ureolítica e estabelecer sua contribuição para a patogênese da criptococose. / Ureases (EC 3.5.1.5) are metalloenzymes that hydrolyze urea to produce ammonia and carbon dioxide. These enzymes, which are found in fungi, bacteria, and plants show very similar structures. The presence of urease in many pathogenic bacteria (Helicobacter pylori and Proteus mirabilis) is strongly correlative with pathogenesis in human diseases. Many medically important fungi have urease activity, among which are Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, and species of Trichosporon and Aspergillus. C. neoformans is a heterothallic yeast with several known virulence factors, including a polysaccharide capsule, melanin production, and the ability to grow at 37°C.The majority of clinical isolates produce large amounts of urease and several authors suggest that Cryptococcal urease play an important role in pathogenesis but with unclear mechanisms but probably by different routes dependent and independent of ureolytic activity, althought many questions are unclear. We wanted to further investigate the role of urease in biological properties by using Cryptococcus gattii as a pathogen model. C. gatti – serotype B, molecular type VGII, R265 strain, which has capacity to infect immunocompetent individuals, caused an outbreak on Vancouver Island in Canada from 1999 to 2003. This work presents the physicochemical characterization of a urease from C. gatti strain R265 after a 539 fold purification. The estimated native molecular mass was 120 kDa, Km 2.0 mM urea, pH optimum 8.0. Aceto hydroxamic acid was a strong inhibitor at low concentration while ρ-hidroxy mercuribenzoate needed higher concentrations for inhibition compared to other ureases.

O patógeno gástrico Helicobacter pylori é uma espiroqueta microaerofílica que infecta o estômago humano, causando gastrite, úlcera e até câncer gástrico. Esta bactéria produz grandes quantidades da enzima urease, essencial para a sobrevivência deste organismo no ambiente ácido do estômago. No entanto, nosso grupo já demonstrou que ureases possuem propriedades independentes de sua atividade ureolítica em modelos mamíferos, através de rotas mediadas por derivados de lipoxigenases. Neste trabalho avaliamos o potencial pró-inflamatório da urease de H. pylori, além de seus efeitos em células epiteliais gástricas. A urease induz edema de pata em camundongos com intensa infiltração de neutrófilos. In vitro, a urease a 100 nM foi quimiotática para neutrófilos humanos, induzindo a produção de espécies reativas de oxigênio. Neutrófilos ativados por urease mostraram um aumento de meia-vida, com a inibição de apoptose sendo acompanhada por alterações nos conteúdos das proteínas Bcl-XL e Bad. Estes efeitos da urease persistem na ausência de atividade enzimática. Os efeitos de edema de pata em camundongos, quimiotaxia e proteção contra a apoptose em neutrófilos humanos foram revertidos na presença de inibidores de lipoxigenase, como esculetina e AA861. Neutrófilos expostos a urease mostraram elevados níveis de 5-lipoxigenase, e nenhuma alteração nos níveis de ciclo-oxigenases. Também observamos que a urease é endocitada por células AGS de epitélio gástrico, que ocorre via endossomos EEA1 e Lamp1-positivos e é dependente de colesterol. Adicionalmente, a urease induz a migração de células AGS em um experimento que simula o ensaio de wound-healing. A urease também estimula a expressão de GM-CSF. Juntos, estes dados indicam que a urease, além do papel na sobrevivência no ambiente ácido do estômago, tem um papel importante nas doenças inflamatórias estomacais causadas por H. pylori. / The gastric pathogen Helicobacter pylori produces large amounts of urease, whose enzyme activity enables the bacterium to survive in the stomach. We have previously shown that ureases display enzyme-independent effects in mammalian models, most through lipoxygenases-mediated pathways. Here, we evaluated potential pro-inflammatory properties of H. pylori urease and its effects in epithelial gastric cells. Urease induced paw edema with intense neutrophil infiltration. In vitro 100 nM urease was chemotactic to human neutrophils, inducing production of reactive oxygen species. Urease-activated neutrophils showed increased lifespan, with inhibition of apoptosis accompanied by alterations of Bcl-XL and Bad contents. These effects of urease persisted in the absence of enzyme activity. Urease-induced paw edema, neutrophil chemotaxis and apoptosis inhibition reverted in the presence of the lipoxygenase inhibitors esculetin or AA861. Neutrophils exposed to urease showed increased content of lipoxygenase(s) and no alteration of cyclooxygenase(s). We observed that the endocytosis occur via EEA1 and Lamp1 endosomes, and is dependent of lipid rafts. Additionally, the urease induces the migration of AGS cells in an experiment that simulates the wound healing assay. Urease also stimulates the over-expression of GM-CSF by AGS cells. Altogether, our data indicate that the urease, besides allowing the bacterial survival in the stomach, could play an important role in the pathogenesis of the gastrointestinal inflammatory disease caused by H. pylori.

As urease de plantas catalisam a hidrólise da ureia e apresentam efeitos tóxicos a fungos patogênicos e insetos fitófagos. Em soja [Glycine max L. Merrill] foram descritas duas ureases estruturais: a embrião-específica, codificada pelo gene Eu1, e a ubíqua, codificada pelo gene Eu4. Sabe-se que a urease embrião-específica purificada apresenta efeito inibitório sobre o crescimento in vitro de fungos filamentosos e desenvolvimento de insetos. A urease ubíqua é responsável pela reciclagem de toda a ureia proveniente do metabolismo, mas não há informações sobre seu envolvimento no sistema de defesa das plantas. A transformação genética é uma ferramenta importante em estudos de genômica funcional e, portanto, a disponibilidade de sistemas eficientes é um pré-requisito essencial. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas estavelmente transformadas a partir de embriões somáticos de soja submetidos ao sistema integrado bombardeamento/Agrobacterium, bem como a identificação e caracterização funcional dos genes que codificam as ureases estruturais de soja, especialmente a urease ubíqua em relação aos processos de resposta a fungos patogênicos. Inicialmente, testamos a eficiência de transformação de embriões somáticos secundários por um método que combina o bombardeamento de partículas livres de DNA com o sistema Agrobacterium. Plantas transgênicas férteis foram regeneradas de vários experimentos independentes de transformação utilizando diferentes plasmídios. Posteriormente, foi realizada a caracterização dos genes que codificam ureases presentes no genoma da soja. O gene Eu4 apresentou um padrão de expressão diferencial para genótipos suscetível e resistente ao longo do período de infecção por Phakopsora pachyrhizi, o agente etiológico da ferrugem asiática. Plantas transgênicas foram geradas visando a superexpressão de Eu4. Contudo, apenas uma planta apresentou níveis aumentados de expressão desse gene, enquanto que as demais plantas apresentaram o fenômeno de co-supressão dos genes endógeno e transgene. Avaliou-se o crescimento vegetativo dos fungos Rhizoctonia solani, Phomopsis sp., Fusarium solani, Colletotrichum gossypii e Penicillium herguei em meio de cultura contendo extrato protéico bruto de plantas transgênicas expressando maiores e menores níveis de urease e de plantas não-transgênicas. O crescimento dos fungos foi inversamente proporcional a quantidade da urease presente no extrato protéico das plantas. Quando infectadas por uredósporos de P. pachyrhizi, folhas destacadas das plantas co-suprimidas desenvolveram um número significativamente maior de lesões, pústulas e pústulas abetas do que folhas com níveis normais da enzima. Em conjunto estes resultados indicam um 15 importante envolvimento da urease ubíqua da soja na resposta à infecção da planta por fungos patogênicos. Além disso, um terceiro gene que codifica urease foi encontrado no banco de dados com a sequência completa do genoma da soja. O gene foi denominado Eu5 e seu produto SBU-III. A análise filogenética mostra que SBU-III está fortemente relacionada à isoforma embrião-específica. Apesar da grande similaridade na seqüência primária da proteína, SBU-III apresenta uma mutação em um aminoácido altamente conservado entre as ureases, sugerindo ausência da atividade ureolítica. O padrão de expressão do gene Eu5 em diferentes órgãos e estágios de desenvolvimento foi determinado por RT-qPCR. Transcritos foram detectados em sementes um dia após a quebra de dormência, em raízes de plantas jovens e em embriões em desenvolvimento. As evidências sugerem que SBU-III não está envolvida na disponibilização de nitrogênio para as plantas, mas esta pode ter função de defesa. / Plants ureases catalyze urea hydrolysis and display toxic effects against pathogenic fungi and phytophagous insects. For soybean [Glycine max L. Merrill] two structural ureases have been described: the embryo-specific, encoded by Eu1 gene, and the ubiquitous, encoded by Eu4 gene. The toxic property of purified embryo-specific urease against filamentous fungi and insects was demonstrated in vitro. The ubiquitous urease is responsible for recycling all metabolically-derived urea, but there were no information about its putative defense role. Plant genetic transformation offers significant advancement in functional genomics. Therefore an efficient transformation system is required. This study aims to obtain stable transformed plants derived from somatic embryos submitted to the integrated bombardment/ Agrobacterium system, as well as identify and functionally characterize the soybean structural urease-encoding genes, specially the ubiquitous urease gene response to fungi. First, the transformation of soybean proliferating somatic embryos by a procedure that combines DNA-free particle bombardment and Agrobacterium was evaluated. Transgenic fertile plants were recovered from many transformation experiments using different plasmids. After, a study of ureases enconding genes present in the soybean genome was carried out. In the present work, Eu4 gene showed a differential expression pattern in susceptible and resistant genotypes over the course of Phakopsora pachyrhizi infection, the Asian rust causal agent. Transgenic plants aiming Eu4 overexpression were obtained. However, a single transgenic plant exhibited Eu4 overexpression, whereas the other ones showed co-suppression of endogenous and transgenes urease genes. The growth of Rhizoctonia solani, Phomopsis sp., Fusarium solani, Colletotrichum gossypii and Penicillium herguei in media containing crude protein extract from either transgenic or non-transgenic leaves was evaluated. Fugal growth was inversely proportional to ubiquitous urease amount in plant crude extracts. When infected by P. pachyrhizi uredospores, detached leaves of co-suppressed plants developed a significantly higher number of lesions, pustules and erupted pustules than leaves containing normal levels of the enzyme. These results suggested an important role of soybean ubiquitous urease in plant response against fungal infection. Furthermore, by searching the completed soybean genome sequence, a third urease-encoding locus was identified. The gene was designated Eu5 and its product, SBU-III. Phylogenetic analysis shows that SBU-III is closely related to the embryo-specific isoform. Although a high similarity in amino acid sequence was observed, a mutation in a highly conserved residue suggests absence of ureolytic activity. Expression profile of Eu5 gene in different organs and developmental stages was determined by RT-qPCR. Transcripts were detected in seeds one day after dormancy break, roots of young plants and embryos of developing seeds. Evidences suggest that SBU-III may not be involved in nitrogen availability to plants, but a defense role was proposed.

Ureases (EC 3.5.1.5.) catalisam a hidrólise de ureia em NH3 e CO2, sendo sintetizadas por plantas, fungos e bactérias. No solo, a urease é encontrada em microrganismos, raízes de plantas e como uma enzima extracelular ligada a compostos orgânicos e inorgânicos. Em plantas e fungos, as ureases consistem em trímeros ou hexâmeros formados por uma subunidade de 90 kDa, enquanto que enzimas bacterianas são complexos com duas ou três subunidades. A inserção de dois átomos de níquel no sítio ativo requer pelo menos três proteínas acessórias, UreD, UreF e UreG em bactérias, ou seus ortólogos em plantas e fungos. Bradyrhizobium japonicum é uma bactéria do solo que forma nódulos fixadores de nitrogênio em plantas de soja. Esse microrganismo produz uma urease, e seu papel na sinalização, tanto para a planta de soja quanto para outros organismos no complexo ambiente da rizosfera, ainda não foi investigado. Desta forma, o presente estudo objetivou purificar e caracterizar a urease de B. japonicum (BJU), bem como avaliar o papel desta enzima, tanto a de origem vegetal quanto a de origem bacteriana, no processo de nodulação da soja. A capacidade da enzima em induzir exocitose/secreção foi avaliada no teste de agregação plaquetária, utilizando-se plasma rico em plaquetas obtido de sangue de coelho e monitorando-se a agregação por turbidimetria. Observamos que a urease de B. japonicum possui a propriedade de agregar plaquetas, implicando em uma provável atividade indutora de exocitose. Ensaios de quimiotaxia demonstraram a atração exercida pela urease ubíqua recombinante de soja sobre células de B. japonicum. Para os ensaios de nodulação, sementes pré-germinadas de soja tiposelvagem (Williams 82) e de mutantes deficientes na proteína urease (eu1-sun/eu4) foram expostas a culturas de B. japonicum USDA110 (tipo selvagem), B. japonicum ΔureG (ausência de atividade ureásica) ou B. japonicum ΔureABC (ausência de urease), e semeadas em vasos de Leonard modificados. Os nódulos foram contados e pesados em diferentes tempos após a inoculação. Além disso, foi determinado o conteúdo de leghemoglobina destes nódulos e o conteúdo de nitrogênio na parte aérea das plantas, como uma maneira de estimar a eficiência da fixação biológica de nitrogênio. Plantas deficientes em urease formam nódulos maiores e em menor número que as selvagens, independente do fenótipo da bactéria. O pico de produção de leghemoglobina em plantas tipo-selvagem é maior e anterior ao pico observado nas plantas mutantes. Inibição de toda a atividade enzimática de urease nas plantas selvagens pelo inibidor fenilfosforodiamidato não causou as alterações observadas pela ausência da proteína urease nas plantas mutantes. Esses resultados sugerem que o desenvolvimento do nódulo em plantas requer a proteína urease, de maneira independente de sua atividade enzimática. Em contraste, a urease da bactéria parece não influenciar a nodulação ou a fixação biológica de N2 na planta. Concluímos que a urease da soja apresenta um papel relevante na simbiose planta - B. japonicum, independente de sua atividade ureolítica, e não compartilhado com a urease bacteriana. / Ureases (EC 3.5.1.5.) catalyze the hydrolysis of urea in NH3 and CO2, and are synthesized by plants, fungi and bacteria. In the soil, urease occurs in microorganisms and plant roots, and as an extracellular enzyme bound to organic and inorganic compounds. In plants and fungi, ureases consist of trimers or hexamers formed by a subunit of 90 kDa, whereas bacterial enzymes are complexes with two or three subunits. The insertion of two nickel atoms into the active site requires at least three accessory proteins, ureD, ureF, and ureG in bacteria, or their orthologs in plants and fungi. Bradyrhizobium japonicum is a soil bacterium that forms nitrogen fixing nodules on soybean plants. This bacterium produces a urease, and its role in signaling for both the soybean plant and other organisms in the complex environment of the rhizosphere, has not yet been investigated. Thus, the present study aimed to purify and characterize B. japonicum urease (BJU), and to evaluate the role of this enzyme, from both plant and bacteria, in the process of soybean nodulation. The induction of secretion was assessed by the ability of the enzyme to induce platelet aggregation in rabbit platelet-rich plasma monitored by turbidimetry. We found that the urease of B. japonicum possesses the property of aggregating platelets, implying a secretion inducing activity. Chemotaxis assays demonstrated the attraction of recombinant soybean ubiquitous urease upon B. japonicum cells. For nodulation assays, pre-germinated seeds of wild-type soybeans (Williams 82) and of mutants deficient in the urease protein (eu1-sun/eu4) were exposed to cultures of B. japonicum USDA110 (wild-type), B. japonicum ΔureG (lack of urease activity) or B. japonicum ΔureABC (no urease), and planted in modified Leonard jars. The nodules were counted and weighed at different times after inoculation. Additionally, we determined the leghemoglobin content of nodules and the nitrogen content in the shoots, as a way to estimate the efficiency of biological nitrogen fixation. Plants deficient in urease (eu1-sun/eu4) form fewer but larger nodules than wildtype plants, regardless of the phenotype of the bacteria. The peak of leghemoglobin production in wild-type plants is higher and earlier than the peak observed in mutant plants. Inhibition of all the enzymatic activity of urease in wild-type plants by phenylphosphorodiamidate did not result in the alterations seen in mutant plants lacking urease. These results suggest that the development of nodule requires the protein urease, but not its enzyme activity. In contrast, the bacterial urease seems to play no roles in the nodulation and biological N2 fixation in the plant. We conclude that the soybean urease plays an important role in the soybean - B. japonicum symbiosis, which is independent of its ureolytic activity and is not shared by the bacterial urease.

Ureases são tradicionalmente conhecidas por catalisar a hidrólise da ureia em amônia e dióxido de carbono. Em soja, três isoformas de urease foram descritas: 1) urease ubíqua, codificada pelo gene Eu4; 2) urease embrião específica, codificada pelo gene Eu1; 3) urease SBU-III, codificada por Eu5. O nitrogênio (N) é o nutriente mais limitante para o crescimento e desenvolvimento da planta. Portanto, mecanismos eficientes para capturar o N nas suas diversas formas, e realocá-lo, são necessários para otimizar o uso do nutriente pela planta. O produto N da atividade da urease - a amônia é incorporada em compostos orgânicos, principalmente, pela atividade da glutamina sintetase. Assim, a urease está envolvida na remobilização do N, bem como na assimilação do N primário. Um estudo anterior foi realizado por nossa equipe com o objetivo de superexpressar o gene Eu4 em plantas de soja. Inesperadamente, as plantas transgênicas exibiram cosupressão do transgene Eu4 e de todos os genes endógenos que codificam as isoformas de urease. Foi verificada também, uma diminuição da atividade ureolítica. Visando determinar o papel das ureases no desenvolvimento da soja, foram comparadas plantas transgênicas co-suprimidas, plantas mutantes e seus respectivos controles. O desenvolvimento das plantas foi avaliado 7, 14, 21 e 30 dias após a semeadura. As plantas co-suprimidas apresentaram um atraso no desenvolvimento durante o primeiro mês após a germinação. Um desenvolvimento mais lento foi observado para o duplo mutante eu1- a/eu4- e o mutante simples eu3-a (este gene codifica uma proteína acessória inativa). A absorção de N nas plantas transgênicas foi significativamente menor do que a das plantas não transgênicas. Entre os mutantes, eu3-a apresentou o menor e eu1-a o maior conteúdo de N. Um número significativamente menor de sementes foi obtido para as plantas transgênicas. Em conjunto estes resultados indicam que o aconteúdo da urease ou da atividade ureolítica desempenham um papel importante no desenvolvimento da planta. A soja (Glycine max) é afetada por vários estresses bióticos e abióticos, que limitam a distribuição geográfica das culturas e levam a reduções significativas de crescimento e produtividade. No Brasil, as doenças causadas por nematoides são um dos estresses bióticos mais prejudiciais para a soja. As principais espécies encontradas no Brasil são Meloidogyne spp. (formadores de galhas), Heterodera glycines (cisto), Pratylenchus brachyurus (lesões radiculares) e Rotylenchulus reniformis (reniforme). Nematoides formadores de galhas e de cisto (nematóides sedentários), os patógenos mais prejudiciais à soja, são muito difíceis de controlar. Neste estudo, foi identificado um peptídeo derivado da urease de soja (nomeado Soyuretox), que exerce efeito tóxico contra fitonematoides formadores de galhas (M. javanica). Soyuretox foi expresso em raízes de plantas compostas plantas transgênicas estáveis de soja. Raízes de plantas compostas e plantas transgênicas estáveis superexpressando Soyuretox exibiram uma redução significativa (50% e 37.5%, respectivamente) no número médio de nematoides e ovos, quando comparado com raízes não transformadas, 45 dias após a inoculação. Este é o primeiro relato de resistência a nematóides causada por um peptideo derivado de uma urease. Soyuretox pode representar uma ferramenta útil bem como uma nova e eficiente alternativa para o controle de pragas e doenças em culturas economicamente importantes. / Ureases are traditionally known for catalyzing the hydrolysis of urea to ammonia and carbon dioxide. In soybean, three urease isoforms have been described: 1) ubiquitous urease, encoded by the Eu4 gene; 2) embryo-specific urease, encoded by Eu1gene; 3) SBU-III urease, encoded by Eu5. Nitrogen (N) is the most limiting nutrient for plant growth and development. Therefore efficient mechanisms both to take up N in its various forms, and to reallocate it, are necessary for optimal N use efficiency. The N product of urease activity- ammonia- is incorporated into organic compounds mainly by glutamine synthase activity. Thus, urease is involved in N remobilization, as well as in primary N assimilation. A previous study was performed by our team aiming to overexpress Eu4 gene in soybean plants. Unexpectedly, the transgenic plants exhibited endogenous (for all three genes) and introduced Eu4 transgene co-suppression and decreased ureolytic activity. Here, we sought to determine urease roles in soybean development by silencing all urease isoforms. Analyses were performed using transgenic co-suppressed and mutant plants. Plant development was evaluated 7, 14, 21 and 30 days after sowing. The cosuppressed plants presented a developmental delay during the first month after germination when compared with control. A slower development was observed for the double eu1-a/eu4-a mutant and the eu3-a (this gene codify an inactive accessory protein) single mutant. The N uptake in transgenic plants was significantly lower than that captured by non-transgenic plants. Among mutants, eu3-a presented the lowest and eu1- a the highest N content. A significantly lower number of seeds was obtained for transgenic plants. Altogether, these results indicate that the urease content and/or ureolytic activity play an important role in plant development. Soybeans (Glycine max) are affected by several abiotic and biotic stresses that limit the geographical distribution of cultures and lead to significant reductions in growth and productivity. In Brazil, the diseases caused by nematodes are one of the most damaging biotic stresses for soybeans.. The main species found in Brazil are Meloidogyne spp. (root-knot), Heterodera glycines (cyst), Pratylenchus brachyurus (root lesion) and Rotylenchulus reniformis (reniform). Root-knot and cyst nematodes (sedentary nematodes), the most damaging soybean pathogens, are very difficult to control. In this study, we identified a soybean urease-derived peptide (named Soyuretox) that exerts toxic effects against the root-knot phytonematode (M. javanica). Soyuretox was expressed in soybean roots of composite plants and complete stable transgenic plants. Roots of composite plants and stable transgenic plants overexpressing Soyuretox exhibited a significant reduction (50% and 37.5%, respectively) in the average number of nematodes and eggs when compared with non-transformed roots, 45 days after inoculation. This is the first report of nematode resistance caused by a urease-derived peptide. Soyuretox may represent a useful tool as a new and efficient alternative to control pests and diseases in economically important crops.