Desde la inclusión de la miocardiopatía no compactada como subtipo de miocardiopatía no clasificable por la OMS en 1990, existe controversia sobre definición, umbrales de enfermedad, técnica y criterios de medida, prevalencia y pronóstico. Objetivos: Definir la prevalencia de hipertrabeculación y miocardiopatía no compactada del VI en pacientes remitidos para realización de resonancia magnética en nuestro hospital. Valorar la asociación con miocardiopatía dilatada o hipertrófica. Describir la evolución de la FEVI en estos pacientes de forma prospectiva. Validar una herramienta diagnóstica de cuantificación automática que agilice el proceso de medida. Definir puntos de corte cuantitativos para discriminar entre sanos y afectados. Metodología: Se definió hipertrabeculación como existencia de trabéculas en ≥2 cortes y ≥2 segmentos del VI. Para definir miocardiopatía no compactada se usaron los criterios de Jenni y de Petersen, basados en la relación lineal entre la pared compacta y la pared trabeculada. Se contabilizaron los pacientes con hipertrabeculación y con miocardiopatía no compactada entre 2003 y 2010, buscándose las asociaciones con la presencia de hipertrofia, dilatación, ambas o ninguna. Se cuantificó la reducción de la FEVI ente dos estudios por ecocardiografía, calculándose la tasa anual de cambio de la FEVI (variación de la FEVI dividido por años entre ecocardiografías). Se desarrolló una herramienta de cuantificación automática de las trabéculas del VI. Para validar la herramienta se utilizaron pacientes sanos, no portadores (grupo control) y pacientes con MCNC y portadores de mutaciones de distintas miocardiopatías (mho, dilatadas, arritmogénica y displasias) en sus respectivas familias (grupo afectados). La cuantificación de las trabéculas se expresó en masa de miocardio trabeculado y compactado y en porcentaje de trabeculación con respecto a la masa total de miocardio. Se realizó un test subjetivo de calificación de la exactitud de la herramienta para discriminar las trabéculas y la pared compactada. Resultados: Encontramos hipertrabeculación en el VI en 103 de un total de 764 pacientes (13,4%). La prevalencia de miocardiopatía no compactada fue del 6% siguiendo criterios de Jenni o del 5% siguiendo criterios de Petersen. Las miocardiopatías asociadas a hipertrabeculación ó a miocardiopatía no compactada fueron hipertróficas (15% y 11%), dilatadas (21% y 27%) o ambas (12% y 10%). Un 51% de los corazones con hipertrabeculación y un 52% de los no compactados mostraban dimensiones de VI normales. La FEVI de los pacientes con hipertrabeculación (50%) y no compactados (46%) fue algo menor que la de los controles (53%) sin alcanzar diferencias significativas. La hipertrabeculación se asoció con una tasa anual de caída en la FEVI del 1% al año mientras que la no compactación del 2% al año respecto a los pacientes que no tienen trabéculas. La medida automática de la pared del ventrículo izquierdo tuvo una excelente concordancia con la observación subjetiva. Mediante esta herramienta, el porcentaje de trabeculación y la masa global de trabéculas indexada por superficie corporal, con puntos de corte de 27.4% y de 39.9 gr/m2, obtuvieron una sensibilidad del 80% y una especificidad del 78% para el diagnóstico de Miocardiopatía NO Compactada. Conclusiones: La prevalencia de hipertrabeculación en nuestra población general es del 13,4% y de la miocardiopatía no compactada del 5-6%. Las trabéculas son un factor pronóstico independiente de la caída de la FEVI en el seguimiento. La herramienta desarrollada permite identificar a los pacientes con Miocardiopatía No compactada, mediante el porcentaje de trabeculación y el índice de capa trabeculada. / Introduction: Since the inclusion of non-compaction cardiomyopathy as unclassifiable subtype by WHO in 1990, there is controversy about definition, threshold disease, technique and measurement criteria, prevalence and prognosis. Goals: Define the prevalence of hypertrabeculation and non-compaction cardiomyopathy in patients referred for performing MRI in our hospital. Assess the association with dilated or hypertrophic cardiomyopathy. Describe the evolution of LVEF in these patients prospectively. Validate a diagnostic tool for automatic quantification that expedites the measurement process. Define quantitative cutoffs to discriminate between healthy and affected. Methodology: Hypertrabeculation was defined as existence of trabeculae in ≥2 segments and ≥2 slices of the left ventricle. To define non-compaction cardiomyopathy were used Jenni and Petersen criteria, based on the linear relationship between the solid and trabecular wall. Hypertrabeculation and non-compaction cardiomyopathy patients, between 2003 and 2010, were counted. We classified patients according to the presence of dilated, hypertrophic cardiomyopathy (HC), both or neither. Reduction of LVEF between two echocardiographic studies was quantified and calculated the annual rate of change of LVEF (LVEF variation between two echocardiography studies and divided by years between studies). A tool for automatic quantification of trabeculae was developed. To validate the tool, healthy patients non-carriers (control group) and patients with LVNC and mutation carriers of various cardiomyopathies (HC, dilated, and arrhythmogenic dysplasia) in their families (affected group) were used. Quantification of trabeculae was expressed in trabecular and compacted mass and percentage of trabeculae respect to the total mass of the myocardium. A subjective test of qualification for the accuracy of the tool to discriminate trabecular and compacted wall was performed. Results: We found LV hypertrabeculation in 103 of a total of 764 patients (13.4%). The prevalence of non-compaction cardiomyopathy was 6% following Jenni criteria or 5% following Petersen criteria. We detected hypertrabeculation and non-compaction cardiomyopathy associated with hypertrophic cardiomyopathy (15% and 11%), dilated (21% and 27%) or both (12% and 10%). 51% of hearts with hypertrabeculation and 52% of non- compacted showed normal LV dimensions. LVEF in hypertrabeculation patients (50%) and uncompacted patients (46%) was somewhat lower than that of controls (53%) but difference was not significant. Hypertrabeculation was associated with an annual rate of decline in LVEF of 1% per year while non- compaction of 2% per year compared to patients without trabeculae. The automatic measurement of left ventricular wall was excellent agreement with the subjective observation. Using this tool, the percentage of the total mass trabeculation and trabecular indexed by body surface, with cutoffs of 27.4 % and 39.9 g / m2, obtained a sensitivity of 80 % and a specificity of 78% for the diagnosis of non compaction cardiomyopathy. Conclusions: Hypertrabeculation prevalence in our general population is 13.4 % and non -compaction cardiomyopathy 5-6%. The trabeculae are an independent predictor of the decline in LVEF at follow-up. The tool developed can identify patients with non-compaction cardiomyopathy, by the percentage of trabeculation and trabecular index layer. LVNC: Left Ventricular Non Compaction; LVEF: Left Ventricular Ejection Fraction; HC: Hypertrophic Cardiomyopathy; WHO: World Health Organization.

Objetivos: 1. Estudiar el efecto de varios polimorfismos localizados en genes no sarcoméricos en la fibrosis cardiaca en pacientes con miocardiopatía hipertrófica: 1.1 Estudiar la asociación de los polimorfismos con el grado de fibrosis miocárdica mediante resonancia magnética cardiaca utilizando realce de gadolinio. 1.2 Estudiar la implicación de los polimorfismos en el grado de fibrosis miocárdica observado en tejidos miocárdicos de pacientes con MCH obtenidos por miectomía. 2. Estudiar el efecto de varios polimorfismos localizados en genes no sarcoméricos en el desarrollo de fibrilación auricular en pacientes con MCH. 3. Estudiar el efecto de varios polimorfismos localizados en genes no sarcoméricos en el ingreso hospitalario urgente en pacientes con MCH. Metodología: Se realizó un estudio de cohortes incluyendo pacientes estables con MCH en tres hospitales terciarios del sudeste de España. Se incluyó de forma consecutiva todos los pacientes mayores de 18 años con diagnóstico de MCH tras la realización de una resonancia magnética cardiaca. A todos los pacientes se realizó una evaluación clínica con anamnesis, exploración clínica y exploraciones complementarias (electrocardiograma, ecocardiografía, holter-ECG, ergometría, resonancia magnética cardiaca). Se realizó la determinación de 9 polimorfismos en genes no sarcoméricos (ACE D/I, AGTR1 1166A>C, CYP11B2 -344C>T, COL1A1 2046G>T, RETN -420C>G, ADRB1 1165G>C, PPARGC1A 1444G>A, NOS3 894T>G y CALM3 -34T>A). Se determinó la concentración de resistina en suero mediante técnica de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay). Los valores de aldosterona en suero fueron determinados mediante RIA (radioinmuinoassay) directo. Se determinó el grado de fibrosis en muestras de tejido miocárdico procedente de miectomía septal empleando la tinción tricrómica de Masson. Resultados: La población del estudio la constituyeron 168 pacientes y 136 controles con una mediana de seguimiento de 49,5 meses (RIC 25,8 - 77,0). La presencia del polimorfismo RETN -420C>G se mantuvo como predictor independiente del número de segmentos con realce tardío con gadolinio en el análisis multivariante (R² corregido 0,031, p:0,038). La asociación entre el polimorfismo -420C>G del gen RETN y la fibrosis intersticial en el tejido miocárdico fue estadísticamente significativa [Coeficiente B: 0,488 (IC 95% 0,015-0,962), p: 0,044]. En el análisis multivariante la presencia del polimorfismo en la región promotora del gen CYP11B2 (-344T>C) [HR: 3,02 (IC 95% 1,01-8,99); p=0,047], el antecedente de FA previa [HR: 2,81 (IC 95% 1,09-7,23); p=0,033] y el diámetro de la AI ≥42 mm [HR: 2,69 (IC 95% 1,01-7,18); p=0,048] continuaron siendo predictores independientes del desarrollo de la FA. En el análisis multivariado tanto la edad [HR: 1,03 (IC 95% 1,00-1,05); p=0,047] como la ausencia del polimorfismo del gen COL1A1 (genotipo 2046G/G) [HR: 2,76 (1,26-6,05), p=0,011] continuaron asociados de forma independiente con el ingreso hospitalario. Conclusiones: CONCLUSIÓN 1: El polimorfismo en la región promotora del gen de la resistina, RETN -420C>G, se asocia de manera significativa con la fibrosis cardiaca en pacientes con miocardiopatía hipertrófica. Conclusión 1.1: El polimorfismo en la región promotora del gen de la resistina, RETN -420C>G, se asocia de manera significativa con un incremento en el número de segmentos que presentan realce tardío con gadolinio en la resonancia magnética cardiaca. Conclusión 1.2: El polimorfismo en la región promotora del gen de la resistina, RETN -420C>G, se asocia de manera significativa con el grado de fibrosis miocárdica en muestras de tejido miocárdico obtenidas por miectomía. CONCLUSIÓN 2: La presencia del polimorfismo de la región promotora de la aldosterona sintetasa, CYP11B2 -344C>T, se asocia de manera significativa con el desarrollo de fibrilación auricular en los pacientes con miocardiopatía hipertrófica. CONCLUSIÓN 3: El polimorfismo del gen de la cadena α1 del colágeno tipo I, COL1A1 2046G>T, es un predictor independiente del pronóstico en pacientes con miocardiopatía hipertrófica, evaluado mediante la necesidad de ingreso hospitalario urgente. / Objectives: 1. To study the effect of several polymorphisms located in non sarcomeric genes in cardiac fibrosis in patients with hypertrophic cardiomyopathy (HCM): 1.1 To study the association of polymorphisms with the degree of myocardial fibrosis by cardiac MRI using gadolinium enhancement. 1.2 To study the involvement of the polymorphisms in the degree of myocardial fibrosis observed in myocardial tissues obtained from patients with HCM by septal myectomy. 2. Study the effect of several polymorphisms located in non sarcomeric genes in the development of atrial fibrillation in patients with HCM. 3. Study the effect of several polymorphisms located in non sarcomeric genes in urgent hospitalization in patients with HCM. Methods: A cohort study including patients with stable HCM in three tertiary hospitals in southeastern Spain was performed. All patients older than 18 years diagnosed with HCM were consecutively included after completion of a cardiac MRI. All patients underwent a clinical evaluation: anamnesis, clinical examination and complementary examinations (electrocardiogram, echocardiography, Holter-ECG, effort test and cardiac MRI). The presence of nine polymorphisms in non sarcomeric genes were determined (ACE D/I, AGTR1 1166A>C, CYP11B2 -344C>T, COL1A1 2046G>T, RETN -420C>G, ADRB1 1165G>C, PPARGC1A 1444G>A, NOS3 894T>G y CALM3 -34T>A). The serum resistin concentration is determined by ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay). Aldosterone levels in serum were determined by direct radioinmuinoassay. The fibrosis is determined in tissue samples from myocardial septal myectomy using the Masson's trichrome staining. Results: The study population was constituted by 168 patients and 136 controls with a median follow up of 49.5 months (IQR 25.8 to 77.0). The presence of the polymorphism RETN -420C>G gene remained an independent predictor of the number of segments with late gadolinium enhancement in the multivariate analysis (adjusted R² 0.031, p: 0.038). The association between polymorphism RETN -420C>G gene and interstitial fibrosis in myocardial tissue was statistically significant [B coefficient: 0.488 (95% CI 0.015 to 0.962), p: 0.044]. In the multivariate analysis, the presence of the polymorphism in the promoter region of CYP11B2 (-344T> C) [HR: 3.02 (95% CI 1.01 to 8.99); p = 0.047], the history of previous AF [HR: 2.81 (95% CI 1.09 to 7.23); p = 0.033] and the diameter of the AI ≥42 mm [HR: 2.69 (95% CI 1.01 to 7.18); p = 0.048] remained independent predictors of the development of AF. In the multivariate analysis, both age [HR 1.03 (95% CI 1.00-1.05); p = 0.047] and the absence of COL1A1 gene polymorphism (genotype 2046G / G) [HR: 2.76 (1.26 to 6.05), p = 0.011] remained independently associated with hospitalization. Conclusions: CONCLUSION 1: The polymorphism in the promoter region of the resistin gene, RETN -420C> G, was significantly associated with cardiac fibrosis in patients with hypertrophic cardiomyopathy. Conclusion 1.1: The polymorphism in the promoter region of the resistin gene, RETN -420C> G, was significantly associated with an increase in the number of segments presenting late gadolinium enhancement on cardiac MRI. Conclusion 1.2: The polymorphism in the promoter region of resistin gene, RETN -420C> G is associated significantly with the degree of myocardial fibrosis in myocardial tissue samples obtained by Myectomy. CONCLUSION 2: The presence of the polymorphism in the promoter region of aldosterone synthase gene, CYP11B2 -344C> T, was significantly associated with the development of atrial fibrillation in patients with hypertrophic cardiomyopathy. CONCLUSION 3: The polymorphism of α1 chain of type I collagen, COL1A1 2046G> T, is an independent predictor of prognosis in patients with hypertrophic cardiomyopathy, assessed by the need for urgent hospitalization.

En esta tesis, se estudiaron tres aspectos relacionados con el campo de la hemostasia y se presentan en tres capítulos independientes con un nexo común; el papel de los miRNA como nuevos reguladores del sistema hemostático. Objetivos: 1) Evaluar la regulación de FXI por miRNA en hígado humano. 2) Identificar SNP en el 3'UTR de factores de coagulación que desestabilicen la unión de miRNA con consecuencias en los niveles plasmáticos y riesgo de sufrir trombosis. 3) Estudiar el papel indirecto de miRNA sobre la regulación de las proteínas hemostáticas a través de HNF4α. Métodos: Se realizaron microarrays y búsquedas in silico de miRNAs. Líneas celulares humanas, cultivo primario de hepatocitos murinos se emplearon para transfecciones y ensayos de luciferasa. Correlaciones entre los niveles de expresión de miRNAs y mRNAs se realizaron en muestras de hígados. Se incluyeron sujetos de los estudios MEGA y LETS. Para la identificación de variantes en el 3'UTR, se seleccionaron los sujetos con niveles extremos para su secuenciación y genotipado. Resultados: 1. MiR-181a-5p regula la expresión de FXI Predicciones in silico identifican cuatro miRNA como potenciales candidatos a regular la expresión de FXI. Sólo miR-181a-5p redujo los niveles de mRNA y proteína de FXI, y el anti-miR-181-5p aumentó los niveles de mRNA y proteína de FXI en células hepáticas. Los ensayos de luciferasa demostraron una interacción directa entre miR-181-5p y el 3’UTR de F11. En hígados humanos sanos se mostró una correlación inversa y significativa entre los niveles de mRNA de F11 y de miR-181a-5p. 2. Identificación de una variante en el 3’UTR del F11 potencialmente regulada por miRNA En dos estudios caso-control, se secuenciaron los 3'UTR de 9 genes hemostáticos en sujetos con niveles plasmáticos extremos. Se identificaron 26 variantes, 4 de ellas con diferencias significativas entre los grupos de los extremos [F2: rs1799963 (previamente descrita) y F11: rs4253429, rs4253430 y rs1062547]. Los SNP de F11 mostraron un alto desequilibrio de ligamiento con las variantes funcionales descritas rs2289252 y rs2036914. El análisis en controles con el alelo silvestre para estas variantes conocidas de F11 mostró que rs1062547 y rs4253430 se asociaban con un aumento significativo de la actividad FXI. Se evaluaron aquellos SNP que pudieran perturbar la unión de miRNA in silico e in vitro. La predicción in silico reveló que la presencia de estos SNP podrían interferir en la unión de 2 miRNA (rs1062547 con miR-513a-5p y rs4253430 con miR-544). Los ensayos de luciferasa mostraron que sólo miR-544 disminuía significativamente su actividad. Dicha inhibición no se observó cuando se utilizó un vector mutado con rs4253430. 3. MiR-24 y miR-34a regulan la expresión de proteínas hemostáticas a través de HNF4α Se encontraron correlaciones positivas y muy significativas entre los niveles de expresión de HNF4A y dianas hepáticas de la coagulación. Los hígados con niveles extremos de miRNA mostraron asociaciones inversas con los niveles de expresión de factores de coagulación. Estos resultados sugieren que las diferencias en la expresión de mRNA de HNF4A pueden explicar, en parte, las variaciones individuales observadas en la expresión de factores de coagulación en el hígado humano. MiR-24 y miR-34a se unen a varios sitios en HNF4A humano. MiR-24 y miR-34a redujo los niveles diferentes proteínas hemostaticas en HepG2. En tejido hepático sano se observaron correlaciones negativas entre los niveles de HNF4A, miR-24 y miR-34a. Además, miR-24 y miR-34a redujeron los niveles del HNF4α y los niveles de expresión de diferentes proteínas hemostáticas en hepatocitos murinos. Conclusiones: Aproximaciones in silico, in vitro y ex vivo, han mostrado que ciertos miRNA funcionan como reguladores de la expresión de diversos factores hemostáticos. Las consecuencias patológicas de estas regulaciones quedan por ser exploradas. / In the present Thesis, I have addressed three points of investigation in the thrombosis field that have been reported as independent Chapters with a common nexus, the role of miRNAs as new regulators of the hemostatic system. Aims: 1) To investigate the potential relevance of miRNAs as new elements that may modulate FXI in human liver. 2) To identify 3’UTR variants in coagulation genes that influence coagulation factor levels and deep vein thrombosis risk through miRNA modulation. 3) To gain a deeper insight into the physiological modulator role of miRNAs in the expression of coagulation factors regulated by HNF4α. Methods: Microarray and in silico search of miRNAs were performed. Human cell lines and Murine hepatocyte primary culture were used for transfections (in vitro validation). Luciferase assays were used. Ex vivo correlations between miRNAs and mRNAs expression levels were performed in liver samples. Study subjects from MEGA and LETS studies were included. For the identification of 3’UTR variants, we selected subjects with extreme levels. Sequencing and genotyping were performed in 3’UTR of hemostatic factors genes. Results: 1. MiR-181a-5p regulates FXI expression in human liver In silico predictions suggest that 4 miRNAs may bind to F11 mRNA. However, only miR-181a-5p inhibits FXI by decreasing levels of both F11 mRNA and protein expression, anti-miR-181-5p increased both mRNA and protein levels of FXI in human. The expression of F11 mRNA in human liver is inversely correlated with the expression of miR-181a-5p, demonstrating for the first time that F11 expression may be regulated by miRNAs. This new regulatory mechanism of F11 expression could partially explain the interindividual variability of plasma FXI found in population. 2. Identification of a variant in the F11 3'UTR potentially regulated by miRNA In two case-control studies, 3’ UTRs of selected coagulation factor genes were sequenced. Four (in F2 and F11) of the 28 variants identified, were clearly more prevalent in low than high levels. F11 SNPs were in partial, inverse linkage (0.4 ≤r2<0.5) with functional variants rs2289252 & rs2036914 previously described. In wildtype carriers of the known variants, rs1062547 and rs4253430 were associated with plasma F11 activity, but none of the variants were associated with venous thrombosis risk. In silico prediction revealed that certain SNPs might disturb the binding sites of miRNAs. In vitro data, confirmed that only miR-544 showed a significant decrease of the luciferase activity in comparison with a scrambled control. This inhibition was not observed when using a mutated vector with rs4253430. 3. MiR-24 and miR-34a regulate several hemostatic proteins expression through HNF4α modulation In human healthy livers we observed significant and positive correlations between expression levels of both HNF4A and several hemostatic proteins. In samples with extreme levels of miR-24 and miR34a, we observed that HNF4A and hemostatic factors transcript levels were inversely correlated. Variations in the expression of these miRNAs could partly explain differences of HNF4A expression levels and therefore levels of several hemostatic factors in healthy subjects. MiR-24 and miR-34a bind to several sites on human HNF4A. In HepG2 cells, miR-24 transfections reduced expression levels of F10, F12, PROC, and PROS1, these latter were also reduced with miR-34a as well asSERPINC1 and PROZ transcript levels. HNF4A transcripts levels were negatively correlated with miR-24 and miR-34a levels in human healthy livers. In murine hepatocytes, miR-24 and miR-34a transfections reduced HNF4α levels and the expression levels of various hemostatic proteins. Conclusions: The present thesis identifies diverse mechanisms implicating miRNAs in the control of hemostasis. Further studies will help in linking these gene-silencing processes with pathologic processes as well as translating them into practical application.

Fundamento y objetivos. El valor de los polimorfismos PON1-Q192R, CYP2C19*2 y *17 en la identificación del paciente pobre respondedor a clopidogrel es controvertido. Evaluamos la relación de estos polimorfismos con la reactividad plaquetar y el pronóstico a medio plazo en pacientes con síndrome coronario agudo sometidos a doble antiagregación remitidos para cateterismo cardíaco. Además, con intención de valorar la utilidad clínica de los dispositivos “a pie de cama” de medición de agregabilidad plaquetaria, realizamos un subestudio comparativo entre los dos principales dispositivos de medida de agregabilidad plaquetar: VerifyNow y Multiplate. Material y métodos. Se incluyeron prospectivamente 247 pacientes con síndrome coronario agudo. En todos se dispuso del genotipo (CYP2C19*2, CYP2C19*17, PON1-Q192R). Medimos la reactividad plaquetar con VerifyNow. Se registraron eventos adversos intrahospitalarios (muerte e infarto periprocedimiento) y durante el seguimiento (muerte, infarto miocardio, angina, accidente cerebrovascular y trombosis del stent). Para el subestudio se reclutaron 168 pacientes de nuestro centro y 83 en el Hospital de San Juan (Alicante) con diagnóstico de síndrome coronario agudo o angina estable a los que se les realizó medida de actividad plaquetar mediante los sistemas VerifyNow y Multiplate. El seguimiento y los eventos adversos registrados durante el mismo fueron similares a los del estudio principal. Resultados. Los portadores de alelos *2 de CYP2C19 presentaron una mayor reactividad plaquetar residual (PRU, media [DE], 252[76] vs. 287[74], p=0.002). Los portadores de alelos *17 de CYP2C19*17 o de alelos T (Q) de PON1-Q192R no presentaron una reactividad distinta (p>0.05). En un modelo multivariado para la predicción de pobre respuesta a clopidogrel, la contribución de CYP2C19*2 fue modesta (Wald=7.5; OR para ≥ 1 alelo *2 = 2.786, IC 95% 1.337-5.808). Fueron factores protectores independientes la hemoglobina basal (g/dL, OR 0.666, IC 95% 0.555-0.801) y el uso concomitante de estatinas (OR=0.376, IC95% 0.162-0.873). El índice de masa corporal fue un factor de riesgo (OR=1.074, IC 95% 1.005-1.148). Los polimorfismos estudiados no predijeron eventos adversos. En el caso del subestudio comparativo, identificamos como pobres respondedores a 173 (68.9%) pacientes con PRU > 235 U y 147 (58.6%) con porcentaje de inhibición < 15%, mediante VerifyNow®; mientras con Multiplate®, identificamos a 48 (19.1%) con ABC del ADP test > 53 y 89 (35.5%) con ABC del ADPhs test > 31. La proporción de pacientes no inhibidos fue significativa y sustancialmente más alta con VerifyNow® respecto a su comparador (p<0.05). En el caso de la aspirina, se identificaron a 38 (15.3%) pacientes no inhibidos mediante ARU > 550 y sólo 6 (2.4%) mediante ABC del Aspi Test > 74. Respecto de los tests de respuesta a clopidogrel, la concordancia mayor fue la del porcentaje de inhibición (VerifyNow®) y el ADPhs Test (Multiplate®) siendo κ de -0.266 (p<0.001). En el resto de las comparaciones el valor de κ fue inferior a 0.2. Para los salicilatos, la concordancia observada entre los dos analizadores fue igualmente baja (κ=0.194, p=0.001). En cuanto al evento combinado, tan solo PRU base y TRAP test mostraron un ABC ROC significativamente distinta del 0.5 (ABC ROC = 0.66, IC 95% 0.55-0.76 y 0.66, IC 95% 0.54-0.77 respectivamente). Conclusiones. El polimorfismo de CYP2C19*2 influenció la respuesta a clopidogrel de forma modesta, pero no condicionó un pronóstico distinto en pacientes con síndrome coronario agudo. Los polimorfismos de PON1-Q192R y CYP2C19*17 no influenciaron la reactividad plaquetar ni el pronóstico. En cuanto al subestudio comparativo, el grado de acuerdo en el diagnóstico de pobre respuesta a la aspirina y clopidogrel entre los sistemas VerifyNow® y Multiplate® fue globalmente pobre. La mayor reactividad plaquetar "basal" se asoció con una mayor ocurrencia de eventos adversos. / ABSTRACT Background and objectives. Previous studies have shown that the metabolism of P2Y12 receptor blockers is influenced not only by CYP2C19*2 but also by PON1-Q192R alelles. We aimed to evaluate the impact of CYP2C19*2 and PON1-Q192R polymorphisms carriage in platelet reactivity and clinical outcome in patients with ischemic heart disease undergoing cardiac catheterization. In addition, intending to evaluate the clinical utility of the devices "bedside " measuring platelet aggregation , we conducted a sub-study comparison between the two main measurement devices platelet aggregability: VerifyNow and Multiplate Methods. We recruited prospectively patients with acute coronary syndrome undergoing cardiac catheterization (n=247). We evaluated the genotype (CYP2C19*2, CYP2C19*17, PON1-Q192R) with TaqMan assay and platelet aggregometry in all patients. We assessed both in and out-of-hospital events (unstable angina, periprocedural and spontaneous myocardial infarction, myocardial infarction, all-cause death, stent thrombosis and stroke) during follow-up. For the substudy 168 patients of our hospital and 83 patients in the San Juan Hospital (Alicante) were enrolled with acute coronary syndrome or stable angina who underwent platelet activity measured by the VerifyNow and Multiplate systems. Monitoring and adverse events recorded during the same were similar to those of the main study. Results. Carriers of CYP2C19*2 alleles showed a significant higher residual platelet reactivity (PRU, mean [SD], 252[76] vs. 287[74], p=0.002). Carriers of PON1-Q192R CT (RQ) and TT(QQ) alleles and CYP2C19*17 did not present a different response to clopidogrel. In a multivariable setting for the prediction of platelet reactivity, the contribution of CYP2C19*2 was modest (Wald=7.5; OR para ≥ 1 alelo *2 = 2.786, 95% CI 1.337-5.808). Independent predictors were baseline hemoglobine levels (g/dL, OR 0.666, 95% CI 0.555-0.801) and the use of statins (OR=0.376, 95% CI 0.162-0.873). Body mass index was a risk factor (OR=1.074, CI 95% 1.005-1.148). Studied polymorphisms did not predict an adverse outcome. In the case of comparative sub-study, we identified as poor responders to 173 (68.9%) patients with PRU> 235 U and 147 (58.6%) percent inhibition with <15% by VerifyNow®; while with Multiplate®, we identified 48 (19.1%) with ABC ADP test> 53 and 89 (35.5%) with ABC test ADPhs> 31. The proportion of patients was not inhibited significantly and substantially higher with respect to VerifyNow® the comparator (p <0.05). In the case of aspirin, they were identified 38 (15.3%) patients not inhibited by ARU> 550 and only 6 (2.4%) by ABC Aspi Test> 74. Regarding tests response to clopidogrel, as agreement was the percent inhibition (VerifyNow®) and ADPhs Test (Multiplate®) being κ of -0266 (p <0.001). In other comparisons κ value was less than 0.2. To salicylates, the observed agreement between the two analyzers was also low (κ = 0.194, p = 0.001). As for the combined event, just PRU base and TRAP test they showed significantly different ABC 0.5 ROC (AUC ROC = 0.66, 95% CI 0.55 to 0.76 and 0.66, 95% CI from 0.54 to 0.77 respectively) Conclusions. CYP2C19*2 polymorphism influenced moderately platelet reactivity but did not show an impact on clinical outcome in patients with acute coronary syndrome. CYP2C19*17 nor PON1-Q192R polymorphisms showed an impact upon platelet reactivity or outcome. As for the comparative substudy, the degree of agreement in the diagnosis of poor response to aspirin and clopidogrel among VerifyNow® and Multiplate® systems was generally poor. Most platelet reactivity "basal" was associated with an increased occurrence of adverse events. Key words. Ischemic cardiac disease, platelets, genetics, aggregometry.

OBJETIVOS: La finalidad del presente estudio es identificar variables relacionadas con el cáncer de mama como factores predictivos de respuesta a la Terapia Sistémica Primaria, estudiar la correlación entre las respuesta clínica, radiológica y patológica y tratar de definir subgrupos de pacientes “respondedores” y “no respondedores” a la TSP basados en las variables analizadas. MATERIAL Y MÉTODO: Se realizó un estudio retrospectivo sobre 64 pacientes diagnosticas de cáncer de mama y tratadas con TSP entre mayo de 2010 y febrero 2015. Se registraron variables clínico-epidemiológicas, diagnósticas, patológicas, inmunológicas y terapéuticas. La respuesta a la TSP se evaluó considerando la respuesta clínica (mediante exploración física); la respuesta radiológica en la mama y la axila (RNM) y la respuesta patológica en la mama y la axila (sistema de Miller y Payne). Los datos fueron analizados utilizando el test y la T de Student. Se consideraron significativos aquellos resultados con valor p<0,05. Se realizó análisis univariante y multivariante para determinar el valor predictivo de respuesta. RESULTADOS: De las 64 pacientes el 65,6% presentó respuesta clínica, el 68,8% respuesta radiológica en la mama; 70,3% respuesta radiológica en la axila; el 73,4% obtuvo respuesta patológica en la mama y el 53,1% respuesta patológica en la axila. El 90,5% de las pacientes que obtuvieron respuesta clínica consiguieron respuesta patológica en la mama frente al 40,9% en los casos sin respuesta clínica (p=0,001), y el 88,1% de los casos que alcanzaron respuesta clínica presentaron respuesta radiológica frente al 31,8% de los casos sin respuesta clínica (p=0,001). Los inmunofenotipos HER2 y triple negativo se asociaban con mayor tasa de respuesta clínica (p=0,018); Ki67 positivo consiguió una respuesta clínica del 76,2% frente al 45,5% de los casos negativos (p=0,014); el 86,4% de los tumores RP- obtuvieron respuesta clínica frente al 54,8% de los casos RP+ (p=0,011). Los fenotipos RNM “bien definidos” (tipos 1, 2, y 3) consiguieron mayor porcentaje de respuesta clínica (p=0,001), respuesta patológica en la mama (p=0,022), respuesta radiológica en la mama (p=0,001) y radiológica en la axila (p=0,008) comparados con los fenotipos “mal definidos”. En el análisis multivariante, el grado histológico 3 se asoció de forma significativa a la respuesta patológica en la mama (p=0,045; OR: 2,82; IC: 1,022-7,816) y el fenotipo RNM “bien definido” mostró asociación significativa con la respuesta clínica (p=0,001; OR: 0,41; IC: 0,24-0,70); respuesta radiológica en la mama (p=0,016; OR: 0,564; IC: 0,354-0,899); radiológica en axila (p=0,048; OR: 0,631; IC: 0,401-0,996) y con la respuesta patológica en la axila (p=0,011; OR: 0,520; IC: 0,315-0,860) CONCLUSIONES: La respuesta clínica, radiológica y patológica en mama tras la TSP se correlacionan entre ellas. El fenotipo RNM predice de forma independiente la aparición de respuesta clínica, radiológica en la mama y axila y respuesta patológica en la axila. El grado histológico predice de forma independiente la aparición de respuesta patológica en la mama. Los pacientes con fenotipo RNM “bien definido” y grado histológico 3 pueden definirse como “respondedores”. / OBJECTIVE: The purpose of the study is to identify features related to breast cancer as predictive factors of response to the Primary Systemic Therapy (PST), studying the correlation between clinical, radiological and pathological response and trying to identify groups of “responsive patients” and "non- responsive patients" to the PST. MATERIAL AND METHOD: A retrospective study was performed from May 2010 to February 2015 and 64 patients were included. Clinical, epidemiological, diagnostic, pathological, immunological and therapeutic features were registered. The PST response was assessed in clinical response (by physical exploration); radiological breast response and axillary response (MRI); and pathologic breast response and axillary response (Miller and Payne system). Data were analyzed using both and Student tests. The results with p<0.05 were considered statisticaly significant. Univariate and multivariate analysis were performed to determine the predictive value of features. RESULTS: 65.6% of the 64 patients showed clinical response; 68.8% radiological breast response; 70.3% radiological axillary response; 73.4% obtained pathological breast response and 53.1% pathological axillary response; 90.5% of patients who achieved clinical response also obtained pathological breast response vs. 40.9% in patients without clinical response (p = 0.001) and 88.1% of patients who achieved clinical response also obtained radiological response compared to 31.8% of cases without clinical response (p = 0.001). HER2 and triple negative tumors were associated with higher rates of clinical response (p = 0.018); Ki67 positive tumors achived a 76,2% of clinical response vs. 45.5% in the negative cases (p = 0.014); 86.4% of RP- tumors achived clinical response while RP+ tumors obtained a 54.8% (p = 0.011). The "well-defined" MRI phenotypes (types 1, 2, and 3) showed higher percentage of clinical response (p = 0.001), pathologic breast response (p = 0.022), radiological breast response (p = 0.001) and radiological axillary response (p = 0.008) when we compare them with the "no-defined" MRI phenotypes. In multivariate analysis, nuclear grade 3 was significantly associated with pathologic breast response (p = 0.045; OR: 2.82, CI: 1.022 to 7.816) and MRI phenotype "well-defined" showed association with clinical response (p = 0.001; OR: 0.41, CI 0.24 to 0.70); radiological breast response (p = 0.016, OR: 0.564, CI 0.354 to 0.899); radiological axillary response (p = 0.048; OR: 0.631, CI 0.401 to 0.996) and pathologic axillary response (p = 0.011; OR: 0.520, CI 0.315 to 0.860). CONCLUSIONS: The clinical, radiological and pathologic response in breast cancer after PST achive a good correlation among them. The RNM phenotype independently predicts clinical, radiological breast and axillary response as well as pathologic axillary response. Nuclear grade independently predicts pathologic breast response. Patients with MRI phenotype " well-defined " and nuclear grade 3 are more likely to be defined as "responsive patients”.

La insuficiència cardíaca (IC) constitueix un problema de primera magnitud als països desenvolupats per la seva alta prevalença, morbi-mortalitat i impacte socio-econòmic. Estimar el risc individual dels pacients amb IC segueix sent un repte per l’heterogeneïtat del seu curs clínic que es veu modulat per múltiples factors i les imprecisions dels facultatius en les prediccions de risc. L’estratificació del pronòstic és important ja que condiciona el tractament i seguiment. La tesi doctoral sorgeix de la necessitat de millorar l’estratificació pronòstica en pacients amb insuficiència cardíaca crònica controlats a una Unitat d’Insuficiència Cardíaca Multidisciplinària, tot incorporant l’ús de biomarcadors (substàncies circulants en sang perifèrica) de diferents processos fisiopatològics. Els resultats de la investigació es presenten en forma de compendi de 6 articles fonamentals i 2 no fonamentals però que formen part de la mateixa línia d’investigació. Utilitzant metodologia estadística rigorosa i sobre un model de variables clíniques pronòstiques establertes, s’ha valorat el valor complementari de diferents biomarcadors en una població amb IC crònica. El primer objectiu va ser valorar el valor de biomarcadors emergents. L’ST2 (marcador de fibrosi) i troponina T d’alta sensibilitat (hs-cTnT) (marcador de lesió miocardíaca) per separat i en combinació, presentaren valor pronòstic additiu sobre els pèptids natriurètics (NT-proBNP). El model amb l’ST2 i la hs-cTnT ofereix una precisió pronòstica igual o lleugerament superior al d’un model amb tres biomarcadors incloent l’NT-pro-BNP (estratègia multimarcador). Això suggereix que potser no és tan important afegir múltiples biomarcadors, sinó identificar les combinacions amb millor rendiment. El segon objectiu fou compara entre si marcadors d’un mateix mecanismes biològic de la IC, per tal d’ estimar quins ofereixen la millor precisió pronòstica. Es van analitzar dos marcadors de lesió miocardíaca (hs-cTnT i la troponina I amb sensibilitat contemporània [sc-cTnI]), dos marcadors de fibrosi (ST2 i galectina-3) i dos de funció renal (cistatina-C i filtrat glomerular estimat). Així, s’obtingueren millors resultats amb la hs-cTnT, tot i que los dues troponines foren predictives de mortalitat. Tant l’ST2 com la galectina-3 es van associar a un augment de mortalitat global, però només l’ST2 es va associar a la mortalitat de causa cardiovascular i va aportar valor complementari sobre els factors de risc establerts. La cistatina-C i el filtrat glomerular renal estimat per Cockroft-Gault van mostrar un rendiment pronòstic similar, i quan es van associar, la cistatina només fa afegir capacitat predictiva al subgrup de pacients amb insuficiència renal moderada. La relació entre la funció renal i alguns dels nous biomarcadors no és ben coneguda, pel es va explorar el comportament de l’ST2 en pacients amb insuficiència renal. La capacitat pronòstica de l’ST2 no es va veure afectada per la funció renal i inclús va estratificar millor en el subgrup amb insuficiència renal. Finalment, s’elaborà una calculadora de risc de mortalitat accessible online (www.bcnbiohfcalculator.cat), innovadora en quant que incorpora tres biomarcadors (ST2, hs-cTnT, NT-proBNP) que milloren significativament la precisió pronòstica de les variables clíniques i aporta l’estimació de risc de mort a 1,2 i 3 anys i l’esperança de vida. Els resultats esmentats aporten informació nova en el camp dels biomarcadors i potencialment aplicable a la pràctica clínica que podria contribuir a millorar l’estratificació pronòstica individual dels pacients amb IC crònica. / Heart failure (HF) is a major health problem due to its high prevalence, morbidity and mortality and its rising healthcare costs. One of the challenges of treating heart failure is predicting disease severity. There is a great heterogeneity in the course of illness as it may be influenced bay many factors. Estimating prognosis is important as it determines the appropriate treatment and follow-up. This thesis arises from the need to improve prognostic stratification in patients with chronic HF followed up at a Heart Failure Clinic and incorporates the use of biomarkers (circulating substances in peripheral blood) reflecting different pathophysiological mechanisms of HF. The results are presented as a collection of six fundamental articles and 2 non-fundamental articles, which follow the same investigation line. Using robust statistical methodology and on top of a comprehensive model of established prognostic clinical variables we assessed the complementary value of biomarkers in risk stratification in a population with chronic IC. The first objective was to evaluate the role of emerging biomarkers. The addition of ST2 (fibrosis marker) and high-sensitivity troponin T (hs-ctnT), a marker of cardiac injury, separately and combined to a clinical model improved risk stratification, and this improvement was additive to natriuretic peptides (NT-proBNP). However, the model with ST2 and hs-cTnT (mulimarker strategy) provided prognostic accuracy equal or slightly higher than a model with three biomarkers (NT-pro-BNP), which suggests that the combination of an increasing number of biomarkers does not necessarily improve risk stratification. The second objective was to evaluate how two markers of the same biological mechanism of HF compare in terms of prognostic accuracy. For this purpose two markers of myocardial injury (hs-cTnT and sc-cTnI), two markers of fibrosis (ST2 and galectin-3) and two markers of renal function (estimated glomerular filtration rate with the Cockroft-Gault formula and cystatin-C) were assessed. Both troponins predicted mortality but hs-cTnT showed better measures of performance. ST2 and galectin-3 were both associated with increased overall mortality, but only ST2 was associated with cardiovascular mortality and provided additional value to established risk factors. Cystatin-C and estimated glomerular filtration rate showed similar long-term predictive value. When analysed in combination Cystatin-C seemed to offer improved prognostication in HF patients with moderate renal dysfunction. Thirdly, due to the scare information regarding renal function and emerging biomarkers, we explored the performance of ST2 in patients with heart and renal failure. The prognostic capacity of ST2 was not affected by renal function and performed even better in the subgroup of patients with renal failure. Finally, we developed a new mortality HF risk-calculator that incorporates three biomarkers (ST2, hs-cTnT and NT-proBNP), which significantly improved prognostic accuracy. It provides individual prediction of death at 1, 2 and 3 years and life expectancy and its available online (www.bcnbiohfcalculator.cat). The above results provide new information in the field of biomarkers and offer a new prognostic tool, which can be used in clinical practice to assist physicians to improve the prognostic stratification of individual patients with chronic IC.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La búsqueda de nuevas estrategias para combatir el cáncer, ha conducido al estudio de la Angiogénesis o formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de otros preexistentes. El conocimiento de este proceso utilizado por la células tumorales para crecer y expandirse, permitiría interferir y evitar sus efectos. La terapia antiangiogénica aparece como una gran oportunidad para el tratamiento de esta y otras patologías cuyo desarrollo descansa en la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de otros preexistentes. Con el objetivo de estudiar el efecto de la Talidomida, molécula derivada del ácido glutámico, con efecto antiangiogénico directo sobre el lecho vascular tumoral, se utilizó un modelo tumoral de presentación natural: el tumor venéreo trasmisible canino. Para ello, se utilizaron seis perros que presentaron este tumor, y se les administró Talidomida durante 14 días por vía oral. Se tomaron controles hematológicos, muestras para biopsias, y se realizó las evaluaciones clínicas de los pacientes. Las muestras para biopsias, fueron teñidas mediante técnicas simples para su estudio histológico. Una disminución significativa en el área del lecho vascular y el número de vasos sanguíneos, se observó en las muestras tumorales obtenidas posterior al tratamiento con Talidomida, en comparación con las muestras tumorales antes del tratamiento. No se observó efectos secundarios en la condición clínica, ni en los componentes sanguíneos ni en la bioquímica clinica.

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / La búsqueda de nuevas terapias contra el cáncer, tanto en medicina humana como en medicina veterinaria, ha llevado al desarrollo de un nuevo grupo de drogas, denominadas anti-angiogénicas, por su efecto negativo sobre la vasculatura tumoral. La angiogénesis se define como el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos pre-existentes. Además de estar presente en el cáncer, donde la génesis de nuevos vasos sanguíneos es fundamental para el crecimiento y la proliferación hacia otros tejidos (metástasis), este fenómeno se presenta en otras patologías y en procesos fisiológicos. Con el objetivo de estudiar el efecto de estas drogas sobre el lecho vascular tumoral se analizó el efecto de la dexametasona, corticoide que posee una probada actividad negativa sobre los vasos sanguíneos tumorales, en un modelo tumoral canino de presentación natural. Para ello se utilizaron 7 perros que presentaban tumor venéreo transmisible (TVT), a los cuales se les administró dexametasona durante 14 días, tiempo durante el cual se obtuvieron mediciones del tamaño tumoral, además de muestras de sangre y biopsias. Estas últimas para análisis del área del lecho vascular mediante técnica inmunohistoquímica, utilizando como marcador de células endoteliales anticuerpos contra el factor de vonWillebrand. Luego del tratamiento, se observó una disminución significativa del área del lecho vascular en las muestras tumorales, con respecto a las muestras tomadas antes de comenzar el tratamiento, sin embargo esto no ocurrió con el tamaño tumoral, que registró una disminución pequeña al final del tratamiento

Este estudo investigou o efeito da obesidade sobre a resposta de artérias mesentéricas a agonistas canabinóides. Ratos obesos Zucker (OZRs) apresentaram reduzido relaxamento à anandamida, aos agonistas CB1 e CB2 e à capsaicina (agonista vanilóide) comparados aos controles (LZRs). A expressão dos receptores CB1 e CB2 foi menor em OZRs. O bloqueio de canais de K+, a inibição da NOS, da COX ou do transporte de canabinóides reduziu a resposta à anandamida em LZRs. A resposta à anandamida em OZRs foi corrigida após: inibição da degradação de anandamida, ativação da via do cAMP e da AMPK, e inibição da ERK1/2. A anandamida aumentou a fosforilação da AMPK, da ACC e da eNOS em LZRs, mas reduziu em OZRs. A expressão da ERK1/2 fosforilada, maior em OZRs, foi potencializada pela anandamida. A obesidade diminui o relaxamento à anandamida por: reduzir a expressão de receptores CB1 e CB2; prejudicar respostas mediadas por receptores vanilóides; reduzir a captação e aumentar a degradação de anandamida; reduzir a ativação da AMPK e da eNOS e aumentar da ativação da ERK1/2. / This study aimed to investigate the effects of obesity on the response of mesenteric arteries to cannabinoid agonists. Obese Zucker rats (OZRs) displayed decreased relaxation to anandamide, to CB1 and CB2 agonists as well as to capsaicin (vanilloid agonist) compared to lean rats (LZRs). The CB1 and CB2 expression was decreased in OZRs. Anandamide response was decreased in LZRs after blockade of K+ channels and inhibition of NOS, COX or cannabinoid transport. Anandamide response in OZRs was corrected by: inhibition of anandamide degradation, activation of cAMP and AMPK pathway and inhibition of ERK1/2. Anandamide increased AMPK, ACC and eNOS phosphorylation in LZRs, but it reduced in OZRs. The expression of phosphorylated ERK1/2, increased in OZRs, was potentiated by anandamide. In conclusion, obesity decreases anandamide relaxation through: reduction of CB1 and CB2 receptors; impairment of signaling pathways mediated by vanilloid receptors; reduced uptake and increased degradation of anandamide; reduction of AMPK/eNOS activation and increase in ERK1/2 activation.

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