L’obstruction des vaisseaux est responsable d’ischémie tissulaire dans différents territoires périphériques, cardiaques et cérébraux. Un des mécanismes d’adaptation du tissu à l’ischémie est la formation de néo-vaisseaux. Plusieurs données récentes mettent en évidence un rôle de la voie de signalisation Wnt/Frizzled (Fzd) dans le développement vasculaire. Le travail de cette thèse s’est focalisé sur l’étude du récepteur Frizzled7 (Fzd7) et de son rôle dans la formation des vaisseaux. Le modèle des corps embryoïdes, un modèle de différenciation des cellules souches embryonnaires vers le phénotype endothélial, nous a permis de démontrer que Fzd7 était exprimé au cours des différentes étapes de différenciation endothéliale. Des études sur des cellules endothéliales matures nous ont permis de montrer que Fzd7 régulait différentes propriétés des cellules endothéliales dont la migration et la formation de tubes endothéliaux, mais pas la prolifération. De plus, Fzd7 participe à la stabilité des jonctions cellulaires en interagissant avec la VE-cadhérine. Concernant les mécanismes moléculaires mis en jeu par Fzd7, nous avons pu montrer que celui-ci était capable d’activer la voie Wnt/PCP via la phosphorylation de la protéine JNK. Enfin, une étude in vivo dans le modèle du poisson Zèbre, nous a permis de mettre en évidence un rôle de Fzd7 dans la formation des vaisseaux intersomitiques. La deuxième partie de ce travail concerne le rôle de la voie Wnt/Fzd dans les propriétés angiogèniques des cellules souches mésenchymateuses (CSM). L’objectif de cette étude était de définir comment les CSM participaient à la formation des vaisseaux et si le système Wnt/Frizzled était nécessaire. Nous avons pu montrer que sFRP1, un modulateur de la voie Wnt, améliore la fonction cellulaire des CSM et contribue à la maturation des néo-vaisseaux. De plus, nous avons pu montrer que les CSM implantées dans un modèle d’ischémie du membre inférieur amélioraient la réponse angiogénique lorsque celles-ci étaient préconditionnées en hypoxie. Nous avons mis en évidence le rôle de Wnt4 dans ce processus. / The obstruction of the vessels is responsible for ischemia in various outlying areas, heart and brain. One of the mechanisms of tissue adaptation to ischemia is the formation of neo-vessels. Several recent data show a role of Wnt/Frizzled (Fzd) pathway in vascular development.The work of this thesis focused on the study of receptor Frizzled7 (Fzd7) and its role in vessel formation. Using the model of embryoid bodies, a model of embryonic stem cell differentiation toward the endothelial lineage, we demonstrated that Fzd7 was expressed during different stages of endothelial cell differentiation. Studies on mature endothelial cells have shown that Fzd7 regulates endothelial cells properties including migration and endothelial tube formation but not proliferation. In addition, Fzd7 participates in the stability of cell junctions by interacting with VE-cadherin. Regarding the molecular mechanisms involved in Fzd7 signalling, we could show that this receptor was capable of activating the Wnt/PCP pathway via phosphorylation of JNK protein. Finally, an in vivo study in zebrafish model, allowed us to highlight a role of Fzd7 in intersomitic vessel formation.The second part of this work concerns the role of the Wnt/Fzd pathway in the angiogenic properties of mesenchymal stem cells (MSC). The objective of this study was to determine how CSM participated in vessel formation and if the Wnt/Frizzled pathway was necessary. We show that sFRP1, a modulator of the Wnt pathway, improves cellular function of MSCs and contributes to the maturation of neo-vessels. In addition, we have shown that MSCs implanted in a model of lower limb ischemia improved the angiogenic response when they were preconditioned by hypoxia. We have highlighted the role of Wnt4 in this process.

L’implication des protéines tyrosines phosphatases (PTPs) dans la régulation de la signalisation et la médiation des fonctions cellulaires a été bien établie dans les dernières années. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels les PTPs régulent les processus fondamentaux tels que l’angiogenèse demeurent méconnus. Il a été rapporté que l’expression de la PTP DEP-1 (Density-enhanced phosphatase 1) augmente avec la densité cellulaire et corrèle avec la déphosphorylation du récepteur VEGFR2. Cette déphosphorylation contribue à l’inhibition de contact dans les cellules endothéliales à confluence et diminue l’activité du VEGFR2 en déphosphorylant spécifiquement ses résidus catalytiques Y1054/1059. De plus, la plupart des voies de signalisation en aval du VEGFR2 sont diminuées sauf la voie Src-Gab1-AKT. DEP-1 déphosphoryle la Y529 de Src et contribue à la promotion de la survie dans les cellules endothéliales. L’objectif de cette thèse est de mieux définir le rôle de DEP-1 dans la régulation de l’activité de Src et les réponses biologiques dans les cellules endothéliales. Nous avons identifié les résidus Y1311 et Y1320 dans la queue C-terminale de DEP-1 comme sites majeurs de phosphorylation en réponse au VEGF. La phosphorylation de ces résidus est requise pour l’activation de Src et médie le remodelage des jonctions cellules-cellules dépendantes de Src. Ce remodelage induit la perméabilité, l’invasion et la formation de capillaires en réponse au VEGF. Nos résultats démontrent que la phosphorylation de DEP-1 sur résidu tyrosine est requise pour diriger la spécificité de DEP-1 vers son substrat Src. Les travaux révèlent pour la première fois un rôle positif de DEP-1 sur l’induction du programme angiogénique des cellules endothéliales. En plus de la phosphorylation sur tyrosine, DEP-1 est constitutivement phosphorylé sur la thréonine 1318 situé à proximité de la Y1320 en C-terminal. Cette localisation de la T1318 suggère que ce résidu pourrait être impliqué dans la régulation de la Y1320. En effet, nous avons observé que la T1318 de DEP-1 est phosphorylée potentiellement par CK2, et que cette phosphorylation régule la phosphorylation de DEP-1 sur tyrosine et sa capacité de lier et d’activer Src. En accord avec ces résultats, nos travaux révèlent que la surexpression du mutant DEP-1 T1318A diminue le remodelage des jonctions cellules-cellules et par conséquent la perméabilité. Nos résultats suggèrent donc que la T1318 de DEP-1 constitue un nouveau mécanisme de contrôle de la phosphorylation sur tyrosine et que ceci résulte en l’activation de Src et l’induction des fonctions biologiques des cellules endothéliales en réponse au VEGF. Suite à ces travaux dans les cellules endothéliales qui démontrent un rôle positif de DEP-1 dans la médiation des réponses angiogéniques, nous avons voulu approfondir nos connaissances sur l’implication potentielle de DEP-1 dans les cellules cancéreuses où l’activité de Src est requise pour la progression tumorale. Malgré le rôle connu de DEP-1 comme suppresseur tumoral dans différents types de cancer, nous avons émis l’hypothèse que DEP-1 pourrait promouvoir les fonctions biologiques dépendantes de Src telles que la migration et l’invasion dans les cellules cancéreuses. Ainsi, nous avons observé que l’expression de DEP-1 est plus élevée dans les lignées basales de cancer du sein qui sont plus invasives comparativement aux lignées luminales peu invasives. Dans les lignées basales, DEP-1 active Src, médie la motilité cellulaire dépendante de Src et régule la localisation des protéines impliquées dans l’organisation du cytosquelette. L’analyse d’un micro-étalage de tissu a révélé que l’expression de DEP-1 est associée avec une réduction tendencielle de survie des patients. Nos résultats proposent donc, un rôle de promoteur tumoral pour DEP-1 dans la progression du cancer du sein. Les travaux présentés dans cette thèse démontrent pour la première fois que DEP-1 peut agir comme promoteur des réponses angiogéniques et du phénotype pro-invasif des lignées basales du cancer du sein probablement du à sa capacité d’activer Src. Nos résultats suggèrent ainsi que l’expression de DEP-1 pourrait contribuer à la progression tumorale et la formation de métastases. Ces découvertes laissent donc entrevoir que DEP-1 représente une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour contrer l’angiogenèse et le développement du cancer. / The implication of protein tyrosine phosphatases (PTPs) in the regulation of cell signalling events and the mediation of cellular functions in response to growth factors such as VEGF has been well-established in the last years. Nonetheless, molecular mechanisms by which PTPs regulate fundamental processes such as angiogenesis are not well-characterized. Expression of the PTP DEP-1 (Density-enhanced phosphatase 1) was reported to increase with cell density and was associated with VEGFR2 dephosphorylation contributing to cell contact inhibition in confluent endothelial cells. We previously demonstrated that DEP-1 attenuates VEGFR2 activity by dephosphorylation of its Y1054/1059 leading to decreased activation of major signalling pathways downstream of VEGFR2 with exception of the Src-Gab1-AKT pathway. Increasing Src activity due to DEP-1-mediated dephosphorylation of its Y529 promotes endothelial cell survival. The objective of this thesis was to gain a better understanding of the role of DEP-1 in the regulation of the Src activity and of biological responses in endothelial cells. We identified tyrosine Y1311 and Y1320 in the C-terminal tail of DEP-1 as major phosphorylation sites in response to VEGF. These residues are required for Src activation and mediate the Src-dependent remodelling of endothelial cell junctions inducing permeability, invasion and capillary formation upon VEGF stimulation. We showed that VEGF-induced DEP-1 tyrosine phosphorylation directs DEP-1 specificity towards its substrate Src. Our results thus highlighted for the first time the promoting role of DEP-1 on the angiogenic program in endothelial cells. In addition to tyrosine phosphorylation, DEP-1 is constitutively phosphorylated on a threonine residue (T1318) proximal to Y1320 in its C-terminal tail suggesting it might be involved in the regulation of Y1320. Indeed, we found that DEP-1 T1318 is phosphorylated, potentially by CK2, and regulates the tyrosine phosphorylation of DEP-1 and its ability to bind to and activate Src. Consistent with this, remodelling of endothelial cell junctions and permeability are impaired in endothelial cells expressing the DEP-1 T1318 mutant. Thus, DEP-1 phosphorylation on T1318 displays a regulatory control over DEP-1 tyrosine phosphorylation and subsequently Src activation and endothelial cell functions in response to VEGF. Our results demonstrating that DEP-1 promotes angiogenic cell responses in endothelial cells, prompted us to consider a possible involvement of DEP-1 in cancer cells, where Src activation has been linked to cancer progression. Thus, although, DEP-1 is believed to act as a tumour suppressor in different cancer types, we hypothesized that it might also promote Src-dependent functions such as migration and invasion in cancer cells. Interestingly, we found that DEP-1 is higher expressed in more invasive basal-like breast cancer cells than in luminal-like cell lines. Moreover, DEP-1 is implicated in the regulation of Src activity, Src-mediated cell motility and appropriate localization of proteins mediating cytoskeletal organization in basal-like breast cancer cell lines. To further support these results, analysis of a breast cancer tissue microarray revealed that DEP-1 expression is associated with a tendency towards reduced overall survival. Thus, our results provide first evidence for a tumour-promoting role of DEP-1 in breast cancer. Altogether, the work performed in the context of this thesis revealed that DEP-1 can similarly behave as a promoter of the angiogenic response and of the pro-invasive phenotype in basal-like breast cancer cell lines, most likely due to its ability to activate Src. This suggests for the first time that DEP-1 expression could contribute to tumour progression and the formation of metastases, and as such, represent a potential new target for anti-angiogenic and anti-cancer therapy.

Les jonctions adhérentes (JA) sont nécessaires à l’élaboration d’une barrière vasculaire sélective dans laquelle la VE-cadhérine joue un rôle crucial. En effet, la VE-cadhérine est une molécule d’adhérence entrant dans la constitution des JA et présente spécifiquement au sein de l’endothélium. Lorsque la VE-cadhérine est exprimée à la surface des cellules endothéliales, l’intégrité de la barrière est préservée. En revanche, des modifications de la VE-cadhérine, comme par exemple sa phosphorylation, provoquent son internalisation, la dissociation des complexes adhésifs ou la désorganisation générale des jonctions endothéliales, défavorisant ainsi la sélectivité de la barrière. De manière générale, une perméabilité vasculaire élevée peut être observée au cours de l’activation de l’endothélium, telle que l’angiogenèse ou la réponse inflammatoire, en conditions physiologiques comme pathologiques. Par exemple, la phosphorylation de la VE-cadhérine provoquée par le facteur VEGF (vascular growth endothelial facteur) entraîne l’augmentation de la perméabilité vasculaire. En outre, une molécule pro-inflammatoire telle que l’interleukine-8 (IL-8) peut également provoquer la phosphorylation de la VE-cadhérine, aboutissant ainsi à l’augmentation de la perméabilité vasculaire. Tandis que les voies de signalisation régissant les effets pro-angiogéniques ou pro-inflammatoires du VEGF et de l’IL-8, respectivement, sont bien caractérisées, les mécanismes moléculaires sous-tendant spécifiquement l’augmentation de perméabilité endothéliale sont moins bien connus. Au cours de mon doctorat, je me suis donc attachée à examiner les interactions moléculaires entre la VE-cadhérine phosphorylée et la molécule d’échafaudage β-arrestine1, dans les cellules endothéliales humaines exposées au VEGF. J’ai également exploré la distribution de la VE-cadhérine dans les cellules endothéliales cérébrales dans un contexte tumoral, récapitulé par le sécrétome de cellules gliomateuses (GB). Mon travail a permis d’identifier la partie C-terminale (C-tail) de la β-arrestine1 qui comporte 43 acides aminés, comme une région interagissant directement avec la VE-cadhérine lorsqu’elle est phosphorylée sur le résidu S665. Cette liaison pourrait conduire alors à l’internalisation de la VE-cadhérine, lors de la stimulation par le VEGF. En outre, nous avons démontré le rôle inattendu du domaine C-tail de la β-arrestine1 dans la régulation négative de l’activité du promoteur de la VE-cadhérine. Ceci se traduit par une réduction des niveaux d’expression de la VE-cadhérine, contribuant ainsi à l’affaiblissement de la barrière endothéliale en réponse au VEGF. En outre, nous avons voulu évaluer l’effet des différents facteurs secrétés par le GB sur la perméabilité vasculaire. L’étude du sécrétome du GB a révélé une production abondante et majoritaire d’IL-8, qui provoque l’internalisation de la VE-cadhérine et la désorganisation des jonctions endothéliales. En plus de son action sur la perméabilité, l’IL-8 favorise la tubulogenèse des cellules endothéliales cérébrales. En conclusion, nous avons mis en évidence un rôle nouveau de la β-arrestine1 dans la régulation de la VE-cadhérine dans les cellules endothéliales humaines. Nous avons également démontré que la sécrétion d’IL-8 par le GB entraîne le remodelage des jonctions de la VE-cadhérine et conduit à une perte de la fonction de barrière des cellules endothéliales cérébrales. L’ensemble de nos résultats a donc permis d’améliorer nos connaissances des mécanismes moléculaires modulant la perméabilité endothéliale. / VE-cadherin is a major adhesion molecule composing endothelial adherens junctions (AJ), which ensure selectivity of the endothelial barrier. Stabilization of the VE-cadherin complex at the surface of endothelial cells plays a pivotal role in the maintenance of vascular homeostasis. Conversely, the disorganization or internalisation of VE-cadherin is a frequent consequence of VE-cadherin modifications (e.g phosphorylation), which promotes in turn vascular permeability. In general, vascular leakage can be observed in both physiological and pathological conditions. Indeed, VE-cadherin phosphorylation caused by pro-angiogenic and pro-permeability factors, among which vascular endothelial growth factor (VEGF) is the prototype, occurs during physiological angiogenesis, as well as tumour-associated angiogenesis. Besides, pro-inflammatory molecules, such as interleukin-8 (IL-8) can also participate in the phosphorylation of VE-cadherin and thereby promote vascular permeability. To best characterise VE-cadherin-mediated increase in vascular permeability under physiological VEGF challenge, we notably investigated the molecular interactions between serine (S665) phosphorylated VE-cadherin and the scaffolding molecule β-arrestin. We also studied the distribution of VE-cadherin in brain endothelial cells under pathological conditions, as provided by the secretome of glioblastoma (GB) brain tumour cells. My work allows the identification of a 43 amino-acid sequence within the C-terminus tail of β-arrestin1 (C-tail) that can directly bind to (S665) phosphorylated VE-cadherin and further triggers its internalisation upon VEGF stimulation. Moreover, we demonstrated the unexpected role of β-arrestin1 C-tail in the down-regulation of the VE-cadherin promoter activity, which results in reduction of VE-cadherin RNA and protein levels, thus contributing to the endothelial barrier properties. Furthermore, in order to evaluate the effects of tumour-secreted factors on the hyper-permeability associated with the tumour microenvironment, we explored the composition and function of the GB secretome on brain endothelial cells. We found that abundant secretion of IL-8 by GB cells causes VE-cadherin-mediated endothelial junction disorganization. Moreover, IL-8 promotes both brain endothelial cell permeability and tubulogenesis. In conclusion, we established a new role for β-arrestin1 in the control of VE-cadherin-based junctions in human endothelial cells. Likewise, we demonstrated that tumour cell-released IL-8 chemokine provokes VE-cadherin-dependent junction remodelling and thereby increases the permeability of human brain endothelial cells. Our results reinforce the central role of VE-cadherin in the modulation of the vascular barrier function in physiological and pathological conditions.

L’implication des protéines tyrosines phosphatases (PTPs) dans la régulation de la signalisation et la médiation des fonctions cellulaires a été bien établie dans les dernières années. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels les PTPs régulent les processus fondamentaux tels que l’angiogenèse demeurent méconnus. Il a été rapporté que l’expression de la PTP DEP-1 (Density-enhanced phosphatase 1) augmente avec la densité cellulaire et corrèle avec la déphosphorylation du récepteur VEGFR2. Cette déphosphorylation contribue à l’inhibition de contact dans les cellules endothéliales à confluence et diminue l’activité du VEGFR2 en déphosphorylant spécifiquement ses résidus catalytiques Y1054/1059. De plus, la plupart des voies de signalisation en aval du VEGFR2 sont diminuées sauf la voie Src-Gab1-AKT. DEP-1 déphosphoryle la Y529 de Src et contribue à la promotion de la survie dans les cellules endothéliales. L’objectif de cette thèse est de mieux définir le rôle de DEP-1 dans la régulation de l’activité de Src et les réponses biologiques dans les cellules endothéliales. Nous avons identifié les résidus Y1311 et Y1320 dans la queue C-terminale de DEP-1 comme sites majeurs de phosphorylation en réponse au VEGF. La phosphorylation de ces résidus est requise pour l’activation de Src et médie le remodelage des jonctions cellules-cellules dépendantes de Src. Ce remodelage induit la perméabilité, l’invasion et la formation de capillaires en réponse au VEGF. Nos résultats démontrent que la phosphorylation de DEP-1 sur résidu tyrosine est requise pour diriger la spécificité de DEP-1 vers son substrat Src. Les travaux révèlent pour la première fois un rôle positif de DEP-1 sur l’induction du programme angiogénique des cellules endothéliales. En plus de la phosphorylation sur tyrosine, DEP-1 est constitutivement phosphorylé sur la thréonine 1318 situé à proximité de la Y1320 en C-terminal. Cette localisation de la T1318 suggère que ce résidu pourrait être impliqué dans la régulation de la Y1320. En effet, nous avons observé que la T1318 de DEP-1 est phosphorylée potentiellement par CK2, et que cette phosphorylation régule la phosphorylation de DEP-1 sur tyrosine et sa capacité de lier et d’activer Src. En accord avec ces résultats, nos travaux révèlent que la surexpression du mutant DEP-1 T1318A diminue le remodelage des jonctions cellules-cellules et par conséquent la perméabilité. Nos résultats suggèrent donc que la T1318 de DEP-1 constitue un nouveau mécanisme de contrôle de la phosphorylation sur tyrosine et que ceci résulte en l’activation de Src et l’induction des fonctions biologiques des cellules endothéliales en réponse au VEGF. Suite à ces travaux dans les cellules endothéliales qui démontrent un rôle positif de DEP-1 dans la médiation des réponses angiogéniques, nous avons voulu approfondir nos connaissances sur l’implication potentielle de DEP-1 dans les cellules cancéreuses où l’activité de Src est requise pour la progression tumorale. Malgré le rôle connu de DEP-1 comme suppresseur tumoral dans différents types de cancer, nous avons émis l’hypothèse que DEP-1 pourrait promouvoir les fonctions biologiques dépendantes de Src telles que la migration et l’invasion dans les cellules cancéreuses. Ainsi, nous avons observé que l’expression de DEP-1 est plus élevée dans les lignées basales de cancer du sein qui sont plus invasives comparativement aux lignées luminales peu invasives. Dans les lignées basales, DEP-1 active Src, médie la motilité cellulaire dépendante de Src et régule la localisation des protéines impliquées dans l’organisation du cytosquelette. L’analyse d’un micro-étalage de tissu a révélé que l’expression de DEP-1 est associée avec une réduction tendencielle de survie des patients. Nos résultats proposent donc, un rôle de promoteur tumoral pour DEP-1 dans la progression du cancer du sein. Les travaux présentés dans cette thèse démontrent pour la première fois que DEP-1 peut agir comme promoteur des réponses angiogéniques et du phénotype pro-invasif des lignées basales du cancer du sein probablement du à sa capacité d’activer Src. Nos résultats suggèrent ainsi que l’expression de DEP-1 pourrait contribuer à la progression tumorale et la formation de métastases. Ces découvertes laissent donc entrevoir que DEP-1 représente une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour contrer l’angiogenèse et le développement du cancer. / The implication of protein tyrosine phosphatases (PTPs) in the regulation of cell signalling events and the mediation of cellular functions in response to growth factors such as VEGF has been well-established in the last years. Nonetheless, molecular mechanisms by which PTPs regulate fundamental processes such as angiogenesis are not well-characterized. Expression of the PTP DEP-1 (Density-enhanced phosphatase 1) was reported to increase with cell density and was associated with VEGFR2 dephosphorylation contributing to cell contact inhibition in confluent endothelial cells. We previously demonstrated that DEP-1 attenuates VEGFR2 activity by dephosphorylation of its Y1054/1059 leading to decreased activation of major signalling pathways downstream of VEGFR2 with exception of the Src-Gab1-AKT pathway. Increasing Src activity due to DEP-1-mediated dephosphorylation of its Y529 promotes endothelial cell survival. The objective of this thesis was to gain a better understanding of the role of DEP-1 in the regulation of the Src activity and of biological responses in endothelial cells. We identified tyrosine Y1311 and Y1320 in the C-terminal tail of DEP-1 as major phosphorylation sites in response to VEGF. These residues are required for Src activation and mediate the Src-dependent remodelling of endothelial cell junctions inducing permeability, invasion and capillary formation upon VEGF stimulation. We showed that VEGF-induced DEP-1 tyrosine phosphorylation directs DEP-1 specificity towards its substrate Src. Our results thus highlighted for the first time the promoting role of DEP-1 on the angiogenic program in endothelial cells. In addition to tyrosine phosphorylation, DEP-1 is constitutively phosphorylated on a threonine residue (T1318) proximal to Y1320 in its C-terminal tail suggesting it might be involved in the regulation of Y1320. Indeed, we found that DEP-1 T1318 is phosphorylated, potentially by CK2, and regulates the tyrosine phosphorylation of DEP-1 and its ability to bind to and activate Src. Consistent with this, remodelling of endothelial cell junctions and permeability are impaired in endothelial cells expressing the DEP-1 T1318 mutant. Thus, DEP-1 phosphorylation on T1318 displays a regulatory control over DEP-1 tyrosine phosphorylation and subsequently Src activation and endothelial cell functions in response to VEGF. Our results demonstrating that DEP-1 promotes angiogenic cell responses in endothelial cells, prompted us to consider a possible involvement of DEP-1 in cancer cells, where Src activation has been linked to cancer progression. Thus, although, DEP-1 is believed to act as a tumour suppressor in different cancer types, we hypothesized that it might also promote Src-dependent functions such as migration and invasion in cancer cells. Interestingly, we found that DEP-1 is higher expressed in more invasive basal-like breast cancer cells than in luminal-like cell lines. Moreover, DEP-1 is implicated in the regulation of Src activity, Src-mediated cell motility and appropriate localization of proteins mediating cytoskeletal organization in basal-like breast cancer cell lines. To further support these results, analysis of a breast cancer tissue microarray revealed that DEP-1 expression is associated with a tendency towards reduced overall survival. Thus, our results provide first evidence for a tumour-promoting role of DEP-1 in breast cancer. Altogether, the work performed in the context of this thesis revealed that DEP-1 can similarly behave as a promoter of the angiogenic response and of the pro-invasive phenotype in basal-like breast cancer cell lines, most likely due to its ability to activate Src. This suggests for the first time that DEP-1 expression could contribute to tumour progression and the formation of metastases, and as such, represent a potential new target for anti-angiogenic and anti-cancer therapy.

Les capillaires cérébraux sont caractérisés par une structure et une organisation particulière au sein de l’unité neurovasculaire. Au travers de jonctions endothéliales particulièrement sélectives, la barrière hémato-encéphalique (BHE) orchestre les échanges de cellules, fluides, protéines et métabolites plasmatiques entre le sang et le compartiment cérébral. La VE-cadhérine, protéine transmembranaire des jonctions endothéliales, est particulièrement importante dans l’intégrité vasculaire puisque sa déstabilisation entraine un affaiblissement de la BHE et conduit à sa rupture dans certaines pathologies. Le glioblastome est une tumeur cérébrale extrêmement agressive et associée à un haut degré de vascularisation dont la perméabilité est anormalement élevée. Ceci contribue à la formation d’œdèmes vasculaires péri-tumoraux préjudiciables pour la santé du patient. Depuis la dernière décennie, un grand nombre d’études ont relié la présence d’une sous-population de cellules souches gliomateuses (CSG) à l’initiation, la récurrence et l’agressivité du glioblastome. De façon importante, ces CSG sont localisées dans un microenvironnement particulier, appelé niche vasculaire, dans lequel elles communiquent étroitement et échangent de manière bidirectionnelle avec l’endothélium cérébral. Sur la base d’un modèle de coculture entre CSG issues de patients, et cellules endothéliales cérébrales récapitulant les propriétés de la BHE, notre laboratoire a porté son attention sur la Sémaphorine 3A (Séma3A). Cette protéine est en effet sécrétée par les CSG et exerce, via son corécepteur Neuropiline-1 (Nrp-1), une action positive sur la perméabilité vasculaire par déstabilisation de la VE-cadhérine. Durant mes travaux de thèse, nous avons identifié et caractérisé la présence de la Séma3A à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) produites par les CSG. Un nombre grandissant d’études met en exergue l’implication de ces vésicules dans la biologie tumorale. Dans ce sens, nous avons démontré que les EV des CSG peuvent pénétrer dans les cellules endothéliales, et moduler leurs propriétés intrinsèques. Au travers de modèles in vivo originaux et de la combinaison de stratégies génétiques (ARN interférent) et pharmacologiques (anticorps bloquant humanisés), nous avons d’une part montré que la Séma3A, portée par les EV, agit spécifiquement via la Nrp-1 exprimée par les cellules endothéliales afin d’augmenter leur perméabilité. D’autre part, dans un modèle de xénogreffe orthotopique de CSG, nous avons identifié une augmentation significative du taux de Séma3A dans la fraction de EV circulantes. De manière intéressante, des résultats similaires ont été obtenus à partir de prélèvements de patients glioblastome nouvellement diagnostiqués. La Séma3A de ces vésicules, apte à augmenter la perméabilité vasculaire à distance, in vitro et in vivo au travers de la Nrp-1, représenterait donc un bon candidat en tant que futur marqueur théranostique du glioblastome. / Brain microvessels are characterized by specific structure and organization within the neurovascular unit. Through highly selective endothelial junctions, the blood-brain barrier (BBB) controls exchanges of cells, fluids, plasmatic proteins and metabolites between blood and the cerebral compartment. VE-cadherin, a transmembrane protein of endothelial junctions, is of most importance in the vascular integrity. Indeed, its destabilization leads to BBB weakening and also breaking in some pathology. Glioblastoma is a highly aggressive brain tumour characterized by a high vascularization rate and abnormal vascular permeability. These properties promote in turn perivascular œdema, harmful for the patient. Since the last decade, a growing number of studies link glioblastoma stem-like cell (GSC) population to the initiation, recurrence and aggressiveness of such cancer. Interestingly, GSCs are located within the vascular niche, a specific microenvironment where they survive, communicate and exchange factors with the microvascular endothelium. On the base of a coculture model between patient-derived GSCs and brain microvascular endothelial cells which recapitulate BBB properties, our laboratory has focused on Semaphorin 3A (Sema3A). Sema3A is a GSC secreted protein and acts through its coreceptor Neuropilin-1 (Nrp-1) which in turn destabilizes VE-cadherin and promotes vascular permeability. During my thesis, we have identified and characterized Sema3A at the membrane of GSC secreted extracellular vesicles (EVs). A growing number of studies highlight EVs as important actors of tumour biology, in this way we have demonstrated that GSC-derived EVs can be uptake by endothelial cells and modulate their intrinsic properties. Through original in vivo models in combination with genetic (RNA interference) and pharmacologic strategies (humanised blocking antibodies), we have demonstrated that EV-carried Sema3A acts specifically through endothelial cells Nrp-1 to promote permeability. Furthermore, in orthotopic GSC xenograft we have identified a significant increase in the Sema3A EV-fraction collected from peripheral blood. Interestingly, similar results were obtained from newly diagnosed glioblastoma blood samples. Moreover, Sema3A from this fraction is a potent propermeability factor that can act at distance through Nrp-1 both in vitro and in vivo. Altogether, our results suggest that EV-carried Sema3A orchestrates loss of barrier integrity in glioblastoma and may be of interest for prognostic purposes.

Les capillaires cérébraux sont caractérisés par une structure et une organisation particulière au sein de l’unité neurovasculaire. Au travers de jonctions endothéliales particulièrement sélectives, la barrière hémato-encéphalique (BHE) orchestre les échanges de cellules, fluides, protéines et métabolites plasmatiques entre le sang et le compartiment cérébral. La VE-cadhérine, protéine transmembranaire des jonctions endothéliales, est particulièrement importante dans l’intégrité vasculaire puisque sa déstabilisation entraine un affaiblissement de la BHE et conduit à sa rupture dans certaines pathologies. Le glioblastome est une tumeur cérébrale extrêmement agressive et associée à un haut degré de vascularisation dont la perméabilité est anormalement élevée. Ceci contribue à la formation d’œdèmes vasculaires péri-tumoraux préjudiciables pour la santé du patient. Depuis la dernière décennie, un grand nombre d’études ont relié la présence d’une sous-population de cellules souches gliomateuses (CSG) à l’initiation, la récurrence et l’agressivité du glioblastome. De façon importante, ces CSG sont localisées dans un microenvironnement particulier, appelé niche vasculaire, dans lequel elles communiquent étroitement et échangent de manière bidirectionnelle avec l’endothélium cérébral. Sur la base d’un modèle de coculture entre CSG issues de patients, et cellules endothéliales cérébrales récapitulant les propriétés de la BHE, notre laboratoire a porté son attention sur la Sémaphorine 3A (Séma3A). Cette protéine est en effet sécrétée par les CSG et exerce, via son corécepteur Neuropiline-1 (Nrp-1), une action positive sur la perméabilité vasculaire par déstabilisation de la VE-cadhérine. Durant mes travaux de thèse, nous avons identifié et caractérisé la présence de la Séma3A à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) produites par les CSG. Un nombre grandissant d’études met en exergue l’implication de ces vésicules dans la biologie tumorale. Dans ce sens, nous avons démontré que les EV des CSG peuvent pénétrer dans les cellules endothéliales, et moduler leurs propriétés intrinsèques. Au travers de modèles in vivo originaux et de la combinaison de stratégies génétiques (ARN interférent) et pharmacologiques (anticorps bloquant humanisés), nous avons d’une part montré que la Séma3A, portée par les EV, agit spécifiquement via la Nrp-1 exprimée par les cellules endothéliales afin d’augmenter leur perméabilité. D’autre part, dans un modèle de xénogreffe orthotopique de CSG, nous avons identifié une augmentation significative du taux de Séma3A dans la fraction de EV circulantes. De manière intéressante, des résultats similaires ont été obtenus à partir de prélèvements de patients glioblastome nouvellement diagnostiqués. La Séma3A de ces vésicules, apte à augmenter la perméabilité vasculaire à distance, in vitro et in vivo au travers de la Nrp-1, représenterait donc un bon candidat en tant que futur marqueur théranostique du glioblastome. / Brain microvessels are characterized by specific structure and organization within the neurovascular unit. Through highly selective endothelial junctions, the blood-brain barrier (BBB) controls exchanges of cells, fluids, plasmatic proteins and metabolites between blood and the cerebral compartment. VE-cadherin, a transmembrane protein of endothelial junctions, is of most importance in the vascular integrity. Indeed, its destabilization leads to BBB weakening and also breaking in some pathology. Glioblastoma is a highly aggressive brain tumour characterized by a high vascularization rate and abnormal vascular permeability. These properties promote in turn perivascular œdema, harmful for the patient. Since the last decade, a growing number of studies link glioblastoma stem-like cell (GSC) population to the initiation, recurrence and aggressiveness of such cancer. Interestingly, GSCs are located within the vascular niche, a specific microenvironment where they survive, communicate and exchange factors with the microvascular endothelium. On the base of a coculture model between patient-derived GSCs and brain microvascular endothelial cells which recapitulate BBB properties, our laboratory has focused on Semaphorin 3A (Sema3A). Sema3A is a GSC secreted protein and acts through its coreceptor Neuropilin-1 (Nrp-1) which in turn destabilizes VE-cadherin and promotes vascular permeability. During my thesis, we have identified and characterized Sema3A at the membrane of GSC secreted extracellular vesicles (EVs). A growing number of studies highlight EVs as important actors of tumour biology, in this way we have demonstrated that GSC-derived EVs can be uptake by endothelial cells and modulate their intrinsic properties. Through original in vivo models in combination with genetic (RNA interference) and pharmacologic strategies (humanised blocking antibodies), we have demonstrated that EV-carried Sema3A acts specifically through endothelial cells Nrp-1 to promote permeability. Furthermore, in orthotopic GSC xenograft we have identified a significant increase in the Sema3A EV-fraction collected from peripheral blood. Interestingly, similar results were obtained from newly diagnosed glioblastoma blood samples. Moreover, Sema3A from this fraction is a potent propermeability factor that can act at distance through Nrp-1 both in vitro and in vivo. Altogether, our results suggest that EV-carried Sema3A orchestrates loss of barrier integrity in glioblastoma and may be of interest for prognostic purposes.

Les capillaires cérébraux sont caractérisés par une structure et une organisation particulière au sein de l’unité neurovasculaire. Au travers de jonctions endothéliales particulièrement sélectives, la barrière hémato-encéphalique (BHE) orchestre les échanges de cellules, fluides, protéines et métabolites plasmatiques entre le sang et le compartiment cérébral. La VE-cadhérine, protéine transmembranaire des jonctions endothéliales, est particulièrement importante dans l’intégrité vasculaire puisque sa déstabilisation entraine un affaiblissement de la BHE et conduit à sa rupture dans certaines pathologies. Le glioblastome est une tumeur cérébrale extrêmement agressive et associée à un haut degré de vascularisation dont la perméabilité est anormalement élevée. Ceci contribue à la formation d’œdèmes vasculaires péri-tumoraux préjudiciables pour la santé du patient. Depuis la dernière décennie, un grand nombre d’études ont relié la présence d’une sous-population de cellules souches gliomateuses (CSG) à l’initiation, la récurrence et l’agressivité du glioblastome. De façon importante, ces CSG sont localisées dans un microenvironnement particulier, appelé niche vasculaire, dans lequel elles communiquent étroitement et échangent de manière bidirectionnelle avec l’endothélium cérébral. Sur la base d’un modèle de coculture entre CSG issues de patients, et cellules endothéliales cérébrales récapitulant les propriétés de la BHE, notre laboratoire a porté son attention sur la Sémaphorine 3A (Séma3A). Cette protéine est en effet sécrétée par les CSG et exerce, via son corécepteur Neuropiline-1 (Nrp-1), une action positive sur la perméabilité vasculaire par déstabilisation de la VE-cadhérine. Durant mes travaux de thèse, nous avons identifié et caractérisé la présence de la Séma3A à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) produites par les CSG. Un nombre grandissant d’études met en exergue l’implication de ces vésicules dans la biologie tumorale. Dans ce sens, nous avons démontré que les EV des CSG peuvent pénétrer dans les cellules endothéliales, et moduler leurs propriétés intrinsèques. Au travers de modèles in vivo originaux et de la combinaison de stratégies génétiques (ARN interférent) et pharmacologiques (anticorps bloquant humanisés), nous avons d’une part montré que la Séma3A, portée par les EV, agit spécifiquement via la Nrp-1 exprimée par les cellules endothéliales afin d’augmenter leur perméabilité. D’autre part, dans un modèle de xénogreffe orthotopique de CSG, nous avons identifié une augmentation significative du taux de Séma3A dans la fraction de EV circulantes. De manière intéressante, des résultats similaires ont été obtenus à partir de prélèvements de patients glioblastome nouvellement diagnostiqués. La Séma3A de ces vésicules, apte à augmenter la perméabilité vasculaire à distance, in vitro et in vivo au travers de la Nrp-1, représenterait donc un bon candidat en tant que futur marqueur théranostique du glioblastome. / Brain microvessels are characterized by specific structure and organization within the neurovascular unit. Through highly selective endothelial junctions, the blood-brain barrier (BBB) controls exchanges of cells, fluids, plasmatic proteins and metabolites between blood and the cerebral compartment. VE-cadherin, a transmembrane protein of endothelial junctions, is of most importance in the vascular integrity. Indeed, its destabilization leads to BBB weakening and also breaking in some pathology. Glioblastoma is a highly aggressive brain tumour characterized by a high vascularization rate and abnormal vascular permeability. These properties promote in turn perivascular œdema, harmful for the patient. Since the last decade, a growing number of studies link glioblastoma stem-like cell (GSC) population to the initiation, recurrence and aggressiveness of such cancer. Interestingly, GSCs are located within the vascular niche, a specific microenvironment where they survive, communicate and exchange factors with the microvascular endothelium. On the base of a coculture model between patient-derived GSCs and brain microvascular endothelial cells which recapitulate BBB properties, our laboratory has focused on Semaphorin 3A (Sema3A). Sema3A is a GSC secreted protein and acts through its coreceptor Neuropilin-1 (Nrp-1) which in turn destabilizes VE-cadherin and promotes vascular permeability. During my thesis, we have identified and characterized Sema3A at the membrane of GSC secreted extracellular vesicles (EVs). A growing number of studies highlight EVs as important actors of tumour biology, in this way we have demonstrated that GSC-derived EVs can be uptake by endothelial cells and modulate their intrinsic properties. Through original in vivo models in combination with genetic (RNA interference) and pharmacologic strategies (humanised blocking antibodies), we have demonstrated that EV-carried Sema3A acts specifically through endothelial cells Nrp-1 to promote permeability. Furthermore, in orthotopic GSC xenograft we have identified a significant increase in the Sema3A EV-fraction collected from peripheral blood. Interestingly, similar results were obtained from newly diagnosed glioblastoma blood samples. Moreover, Sema3A from this fraction is a potent propermeability factor that can act at distance through Nrp-1 both in vitro and in vivo. Altogether, our results suggest that EV-carried Sema3A orchestrates loss of barrier integrity in glioblastoma and may be of interest for prognostic purposes.