Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est responsable du syndrome de l’immunodéficience acquise (SIDA). Il faut identifier de nouvelles cibles pour le développement d’agents anti-VIH-1, car ce virus développe une résistance aux agents présentement utilisés. Notre but est d’approfondir la caractérisation de l’étape du changement de cadre de lecture ribosomique en -1 (déphasage -1) nécessaire à la production du précurseur des enzymes du VIH-1. Ce déphasage est programmé et effectué par une minorité de ribosomes lorsqu’ils traduisent la séquence dite glissante à un endroit spécifique de l’ARN messager (ARNm) pleine-longueur du VIH-1. L’efficacité de déphasage est contrôlée par le signal stimulateur de déphasage (SSF), une tige-boucle irrégulière située en aval de la séquence glissante. La structure du SSF est déroulée lors du passage d’un ribosome, mais elle peut se reformer ensuite. Nous avons montré que des variations de l’initiation de la traduction affectent l’efficacité de déphasage. Nous avons utilisé, dans des cellules Jurkat-T et HEK 293T, un rapporteur bicistronique où les gènes codant pour les luciférases de la Renilla (Rluc) et de la luciole (Fluc) sont séparés par la région de déphasage du VIH-1. La Rluc est produite par tous les ribosomes traduisant l’ARNm rapporteur alors que la Fluc est produite uniquement par les ribosomes effectuant un déphasage. L’initiation de ce rapporteur est coiffe-dépendante, comme pour la majorité des ARNm cellulaires. Nous avons examiné l’effet de trois inhibiteurs de l’initiation et montré que leur présence augmente l’efficacité de déphasage. Nous avons ensuite étudié l’effet de la tige-boucle TAR, qui est présente à l’extrémité 5’ de tous les ARNm du VIH-1. TAR empêche la liaison de la petite sous-unité du ribosome (40S) à l’ARNm et module aussi l’activité de la protéine kinase dépendante de l’ARN double-brin (PKR). L’activation de PKR inhibe l’initiation en phosphorylant le facteur d’initiation eucaryote 2 (eIF2) alors que l’inhibition de PKR a l’effet inverse. Nous avons étudié l’effet de TAR sur la traduction et le déphasage via son effet sur PKR en utilisant TAR en trans ou en cis, mais à une certaine distance de l’extrémité 5’ afin d’éviter l’interférence avec la liaison de la 40S. Nous avons observé qu’une faible concentration de TAR, qui active PKR, augmente l’efficacité de déphasage alors qu’une concentration élevée de TAR, qui inhibe PKR, diminue cette efficacité. Nous avons proposé un modèle où des variations de l’initiation affectent l’efficacité de déphasage en modifiant la distance entre les ribosomes parcourant l’ARNm et, donc, la probabilité qu’ils rencontrent un SSF structuré. Par la suite, nous avons déterminé l’effet de la région 5’ non traduite (UTR) de l’ARNm pleine-longueur du VIH-1 sur l’efficacité de déphasage. Cette 5’UTR contient plusieurs régions structurées, dont TAR à l’extrémité 5’, qui peut interférer avec l’initiation. Cet ARNm a une coiffe permettant une initiation coiffe-dépendante ainsi qu’un site d’entrée interne des ribosomes (IRES), permettant une initiation IRES-dépendante. Nous avons introduit cette 5’UTR, complète ou en partie, comme 5’UTR de notre ARNm rapporteur bicistronique. Nos résultats démontrent que cette 5’UTR complète inhibe l’initiation coiffe dépendante et augmente l’efficacité de déphasage et que ces effets sont dus à la présence de TAR suivie de la tige-boucle Poly(A). Nous avons aussi construit un rapporteur tricistronique où les ribosomes exprimant les luciférases utilisent obligatoirement l’IRES. Nous avons observé que cette initiation par l’IRES est faible et que l’efficacité de déphasage correspondante est également faible. Nous avons formulé une hypothèse pour expliquer cette situation. Nous avons également observé que lorsque les deux modes d’initiation sont disponibles, l’initiation coiffe dépendante est prédominante. Finalement, nous avons étudié l’effet de la protéine virale Tat sur l’initiation de la traduction et sur l’efficacité de déphasage. Nous avons montré qu’elle augmente l’initiation de la traduction et que son effet est plus prononcé lorsque TAR est située à l’extrémité 5’ des ARNm. Nous proposons un modèle expliquant les effets de Tat sur l’initiation de la traduction par l’inhibition de PKR ainsi que par des changements de l’expression de protéines cellulaires déroulant TAR. Ces résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes régissant le déphasage du VIH-1, ce qui est essentiel pour le développement d’agents anti-déphasage. / The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is responsible for the acquired immune deficiency syndrome (AIDS). HIV-1 develops a resistance towards the inhibitors used to treat infected patients. It is thus important to identify new targets for the development of novel antiretroviral agents. The aim of our work was to better characterize the programmed -1 ribosomal frameshift which generates the precursor of HIV-1 enzymes. The frameshift occurs at a specific sequence of HIV-1 full-length messenger RNA (mRNA), the slippery sequence, and is performed by a minority of the ribosomes translating this mRNA. The frameshift efficiency is controlled by the frameshift stimulatory signal (FSS), an irregular stem-loop located downstream of the slippery sequence. FSS structure is unfolded by every ribosome translating this region and can refold afterwards. We showed that HIV-1 frameshift efficiency is affected by changes in the rate of translation initiation. We transfected Jurkat-T and HEK 293T cells with a bicistronic reporter that contains the frameshift region of HIV-1 between the Renilla luciferase (Rluc) and the firefly luciferase (Fluc) genes. Rluc is produced by all ribosomes translating this reporter whereas only ribosomes that make a –1 frameshift produce Fluc. The translation of the reporter is initiated via a cap-dependant mode, like the majority of cellular mRNAs. We first determined the effect of three inhibitors of translation initiation. We showed that their presence increases the frameshift efficiency. We next determined the impact of the TAR stem loop, which is located at the 5’end of every HIV-1 mRNA. TAR is known to impair the binding of the small subunit of the ribosome (40S) to the mRNA. TAR also modulates the activity of the double-stranded RNA-dependent protein kinase (PKR). When PKR is activated, it phosphorylates the eukaryotic initiation factor 2 (eIF2), inhibiting translation initiation. The inhibition of PKR has the opposite effect. We studied the effect of TAR on PKR by positioning TAR at a distance of the 5’ end where it cannot interfere with the binding of the 40S. Our results showed that a small amount of TAR, which activates PKR, increases the frameshift efficiency whereas a large amount of TAR, which inhibits PKR, decreases it. A model is presented where the variations of translation initiation modulate HIV-1 frameshift efficiency by altering the distance between the elongating ribosomes. This influences the probability that these ribosomes encounter or not a folded FSS. We next observed the effect of the 5’ untranslated region (UTR) of HIV-1 full length mRNA on its frameshift efficiency. This 5’UTR contains several structured parts, including TAR at the 5’end, which can inhibit translation initiation. This mRNA has a cap and an internal ribosome entry site (IRES) and could then use a cap dependent and an IRES-dependent mode of translation initiation. We replaced the 5’UTR of our bicistronic reporter mRNA by the complete 5’UTR of HIV-1 full-length mRNA or a part of it. Our results showed that the presence of the complete 5’UTR inhibits cap-dependent initiation of translation and increases the frameshift efficiency. Those effects are mostly due to the presence of TAR followed by a Poly(A) stem-loop. We also constructed a tricistronic reporter where the ribosomes translating the luciferases have to use an IRES-dependent initiation mode. The rate of this initiation was low and the frameshift efficiency obtained was also low. We proposed a hypothesis accounting for this situation. We also observed that when both initiation modes are available, the cap-dependent mode seems to be highly favored. Finally, we studied the impact of the Tat viral protein on translation initiation and frameshift efficiency. We showed that the presence of Tat increases translation initiation and decreases the frameshift efficiency. Those effects are more important when TAR is present at the 5’end of mRNA. We propose a model explaining the effects of Tat on translation initiation by the inhibition of PKR and by changes in the expression of cellular proteins that are able to unfold TAR. Our results allow us to better understand the mechanisms controlling HIV-1 frameshift, which will help in the development of drugs targeting the HIV-1 frameshift.

Abstract Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is a common pathogen with an age-standardized seroprevalence of 52% in Finland. The most common manifestation of HSV-1 infection is labial herpes, but recently HSV-1 has emerged as the most common cause of primary genital herpes in Finnish women. HSV-1 can also lead to severe conditions such as encephalitis. After the primary lytic HSV-1 infection at the epithelia, the progeny viruses infect the innervating sensory neurons. The neuronal infection may lead to a quiescent infection form, called latency. Periodically, the virus may reactivate, which can lead to recurrent infection at the epithelia. During different phases of the viral life cycle the host cells try to restrict the infection. This study set out to investigate the roles of two HSV-1 proteins, γ134.5 and Us3 during different phases of the HSV-1 life cycle. The aim of the first study was to investigate how the deletion of Us3 affected host responses, especially Toll-like Receptor (TLR) signaling, in monocytic U937 cells. TLR3 expression was increased during Us3 deletion virus infections. This also led to increased activation of IRF-3 and increased expression of type I interferons (IFN) and an interferon stimulated protein. This study shows that TLR3 is involved in controlling the HSV-1 infection and that Us3 regulates IRF-3 activation. The second study focused on the role of the γ134.5 protein in HSV-1 latency. Embryonic mouse dorsal root ganglion (DRG) cultures were used as a cell culture model for HSV-1 latency and reactivation. In this model γ134.5 deletion viruses did not reactivate as efficiently as wild-type viruses, even though they replicated well and established latency in the neurons. Stress granules are part of the host response. In the third study, the roles of the innate immunity effectors HSV-1 Us3 and human Z-DNA binding protein 1 (ZBP1) in stress granule formation (SG) were studied. Wild-type HSV-1 efficiently prevented the formation of SGs. The overexpression of ZBP1 resulted in accumulation of smaller but more abundant SGs during oxidative stress. Overexpression of Us3 did not significantly affect the size or number of SGs, but during Us3 deletion virus infection, SG proteins localized to cis-Golgi. This work shows that HSV-1 uses Us3 to evade and modulate host responses and that the γ134.5 protein is required for reactivation in mouse DRG cultures. / Tiivistelmä Herpes simplex virus tyyppi 1 (HSV-1) on yleinen taudinaiheuttaja, jonka ikävakioitu seroprevalenssi Suomessa on 52 %. HSV-1 tunnetaan yleisimmin huuliherpeksen aiheuttajana, mutta myös kasvava osuus genitaaliherpeksistä on HSV-1:n aiheuttamia. HSV-1 voi johtaa myös vakaviin ilmentymiin, kuten aivotulehdukseen. Epiteelisolujen infektion tuottamia viruksia siirtyy aluetta hermottaviin tuntohermosoluihin, mikä voi johtaa piilevään infektiomuotoon eli latenssiin. Latentti virus voi ajoittain reaktivoitua, mistä voi seurata uusintainfektio. Isäntäsolu pyrkii rajoittamaan infektiota sen eri vaiheissa. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää kahden HSV-1:n virulenssiproteiinin, γ134.5:n ja Us3:n, merkitystä HSV-1:n elinkierrossa. Osatyössä I tutkittiin, miten Us3:n poisto vaikuttaa luontaisen immuniteetin vasteisiin, keskittyen etenkin Tollin kaltaisten reseptorien (TLR) signaalivälitykseen U937-monosyyttisoluissa. Us3-poistogeenisillä viruksilla suoritetuissa infektioissa TLR3:n ilmentyminen lisääntyi merkittävästi. Tämä johti myös lisääntyneeseen IRF-3-aktivaatioon sekä tyypin I interferonien ja interferonistimuloituvan proteiinin lisääntyneeseen ilmentymiseen. Tämä osoittaa, että TLR3 osallistuu HSV-1-viruksen tunnistukseen ja että Us3 säätelee IRF-3:n aktivaatiota. Osatyössä II keskityttiin γ134.5-proteiinin merkitykseen HSV-1:n latenssissa. Hiirialkioiden takajuuren hermoganglioita käytettiin soluviljelymallina HSV-1:n latenssin ja reaktivaation tutkimisessa. Tässä mallissa γ134.5-poistogeeniset virukset kasvoivat hyvin ja asettuivat latenteiksi, mutta eivät silti reaktivoituneet kuten luonnonkannan virukset. Stressijyväset ovat osa luontaista immuniteettia. Osatyössä III määritettiin HSV-1:n Us3-proteiinin ja ihmisen Z-DNA:han sitoutuvan proteiini 1:n (ZBP1) merkitystä stressijyvästen muodostumisessa. Luonnonkannan virus kykeni tehokkaasti estämään jyvästen muodostumisen. ZBP1:n yli-ilmentäminen oksidatiivisen stressin aikana johti suureen määrään pienikokoisia stressijyväsiä. Us3:n yli-ilmentäminen ei vaikuttanut stressijyväsiin, kun taas Us3-poistogeenisellä viruksella suoritetuissa infektioissa stressijyväsproteiinit paikantuivat Golgin laitteeseen. Tämä tutkimus osoittaa, että HSV-1 käyttää Us3-proteiinia luontaisten immuunivasteiden muunteluun ja että γ134.5-proteiini on välttämätön reaktivaatiossa hiiren hermoganglioissa.

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Nach dem Eintritt in den Wirtsorganismus und initialer Replikation infizieren Alphaherpesviren Neuronen zur weiteren Ausbreitung im Nervensystem und zur Etablierung einer Latenz. Dazu werden die Viruspartikel innerhalb der Axone retrograd von der Peripherie zum neuronalen Zellkörper transportiert. Die umgekehrte Richtung beschreibt den Weg des anterograden Transports vom Zellkörper zur Synapse für weitere Infektionen von Neuronen höherer Ordnung oder zurück zur Peripherie. Der retrograde intraaxonale Transport ist gut untersucht. Dagegen wird über den anterograden Transport kontrovers diskutiert. Zwei verschiedene Transportmodelle werden vermutet. Das „Married Model“ postuliert, dass umhüllte Virionen innerhalb von Vesikeln entlang des Axons transportiert werden. Die Freisetzung der Partikel erfolgt an der jeweiligen Synapse durch Endocytose. Das „Subassembly Model“ geht dagegen davon aus, dass einzelne Virusstrukurkomponenten (Nukleokapsid, Hülle) entlang des Axons transportiert werden. Der Zusammenbau und die Freisetzung erfolgt am Axonterminus bzw. an der Synapse (in vivo) oder am Wachstumskegel (in vitro) oder an speziellen Auftreibungen des Axons, den sogenannten Varicosities. Nach Infektion eines neuronalen Explantatsystems mit dem Pseudorabiesvirus (PrV) konnten ultrastrukturell umhüllte Virionen in Vesikeln detektiert werden und so der Nachweis der Gültigkeit des „Married Model“ als vorherrschendes Transportmodell geführt werden. Dagegen ist die Situation beim prototypischen Alphaherpesvirus, dem Herpes Simplex Virus Typ 1 (HSV-1), weiterhin ungeklärt. Aufgrund der zahlreichen unterschiedlichen Analysemethoden und -systeme war ein direkter Vergleich der beiden Viren bislang nicht möglich. Daher sollte in dieser Arbeit ein standardisiertes neuronales Kultursystem genutzt werden, um vier verschiedene HSV-1 Stämme im Vergleich zu PrV zu untersuchen. Für die Infektionen wurden sowohl Neuronen aus dem oberen Cervikalganglion als auch aus Spinalganglien genutzt. So konnte gezeigt werden, dass in Neuronen, welche mit den HSV-1 Stämmen HFEM, 17+ und SC16 infiziert waren ca. 75% als umhüllte Virionen in Vesikeln und ca. 25% als nackte Kapside vorlagen. Ingesamt war die Anzahl der Viruspartikel in HSV-1 infizierten Neuronen signifikant geringer als in PrV infizierten Kulturen. Überraschenderweise zeigten mit HSV-1 KOS infizierte Neuronen ein reverses Bild. Hier lagen nur 25% der Viruspartikel als umhüllte Virionen in Vesikeln vor, während 75% als nackte Kapside detektiert wurden. Dieser unerwartete Phänotyp sollte auf molekularbiologischer Ebene genauer untersucht werden. Dabei wurde auf die Genregion von US9 fokussiert. Das von US9 codierte Membranprotein spielt eine wichtige Rolle während des Zusammenbaus der Virionen und bei anschließenden axonalen anterograden Transportvorgängen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das HSV-1 KOS Genom durch verschiedene Basenaustausche an der vorhergesagten TATA-Box von US9 eine Mutation aufweist. Zusätzlich trägt das offene Leseraster durch eine weitere Mutation ein vorzeitiges Stopcodon auf und wird dadurch auf 58 Kodons reduziert, im Gegensatz zu anderen HSV-1 Stämmen, wo es 91 Kodons umfasst. Die Mutation an der TATA-Box verändert auch das ursprüngliche Stopcodon vom US8a Gen, was zur einer Verlängerung von ursprünglich 161 zu 191 Kodons führt. In Northern Blot Analysen konnte eine reduzierte Transkription von US9 in HSV-1 KOS infizierten Zellen detektiert werden. In HSV-1 KOS infizierten Zellen konnten mittels eines spezifischen Antiserums gegen US9 im Western Blot kein Genprodukt nachgewiesen werden. Auch Immunfluoreszenzanalysen zeigten, dass das abgeleitete verkürzte Protein offenbar nicht stabil exprimiert wird. Dagegen konnten Western Blot Analysen die Vergrößerung des pUS8a bestätigen. Der beobachtete auffällige intraaxonale Phänotyp könnte somit durch die Mutation des US9 Protein erklärt werden. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass auch bei HSV-1 vorwiegend das „Married Model“ für den anterograden intraaxonalen Transportweg bevorzugt wird und somit beide Alphaherpesviren, HSV-1 und PrV, denselben Transportweg nutzen.

Background: Herpes Simplex Virus Type 2 (HSV 2) is one of the most common sexually transmitted infections (STIs) worldwide. HSV 2 infection is a risk factor for the acquisition and transmission of other STIs. Aim: The aim of this study is to determine prevalence and predictors of HSV 2 infection in Durban, South Africa by using available data that has not been previously analysed for the purpose of adding scientific evidence to the existing body of knowledge relating to HSV 2. Method: The study involves secondary analyses of data collected as a prospective study which enrolled women who participated in a clinical trial. A total of 3472 sexually active women were screened in the primary study from two clinics in Durban. All consenting participants were tested for HIV, HSV 2, Trichomonas vaginalis (TV), Neisseria gonorrhoea (NG) and Chlamydia trachomatis (CT) infection. Results: There were 2532 women who had HSV 2 giving a prevalence of 73%. Of these, 53% also tested positive for HIV infection. In univariate analysis, co-infection with HIV was strongly associated with HSV2 (Odds Ratio (OR): 7.4, 95% Confidence Interval (CI): 6.0, 9.1, p<0.001). There was also an association between other STIs, such as CT, NG and syphilis and HSV 2, although only NG was significantly associated with prevalent of HSV 2 (OR: 2.3, 95% CI: 1.3, 4.1, p=0.005). Women older than 25 years of age more likely to have HSV 2 (OR: 2.4, 95% CI: 2.0,2.8, p<0.001). A risk of being infected with HSV 2 increased with the number of reported lifetime sexual partners Those with two and three or more were 2,5 and 4.6 times more likely to have HSV2 respectively (OR: 2.5, 95% CI: 2.1,3.1, p<0.001 and OR: 4.6, 95% CI: 3.8, 5.6, p<0.001 respectively). Women who had less than high school education were also found to have higher risk for HSV 2. Conclusion: The secondary analysis showed a high prevalence of HSV 2 infection and a strong association of HSV 2 and HIV. A significant association of HSV 2 was noted in women having more than two sex partners and lower high school education. Therefore, it is recommended that screening for HSV 2 among high risk populations be incorporated into the STI screening and treatment packages. / Prevalence and risk factors associated with HSV 2 / Herpes Simplex Virus Type 2 / HSV 2 / Department of Health Studies / M. (Public health)

Background: Herpes Simplex Virus Type 2 (HSV 2) is one of the most common sexually transmitted infections (STIs) worldwide. HSV 2 infection is a risk factor for the acquisition and transmission of other STIs. Aim: The aim of this study is to determine prevalence and predictors of HSV 2 infection in Durban, South Africa by using available data that has not been previously analysed for the purpose of adding scientific evidence to the existing body of knowledge relating to HSV 2. Method: The study involves secondary analyses of data collected as a prospective study which enrolled women who participated in a clinical trial. A total of 3472 sexually active women were screened in the primary study from two clinics in Durban. All consenting participants were tested for HIV, HSV 2, Trichomonas vaginalis (TV), Neisseria gonorrhoea (NG) and Chlamydia trachomatis (CT) infection. Results: There were 2532 women who had HSV 2 giving a prevalence of 73%. Of these, 53% also tested positive for HIV infection. In univariate analysis, co-infection with HIV was strongly associated with HSV2 (Odds Ratio (OR): 7.4, 95% Confidence Interval (CI): 6.0, 9.1, p<0.001). There was also an association between other STIs, such as CT, NG and syphilis and HSV 2, although only NG was significantly associated with prevalent of HSV 2 (OR: 2.3, 95% CI: 1.3, 4.1, p=0.005). Women older than 25 years of age more likely to have HSV 2 (OR: 2.4, 95% CI: 2.0,2.8, p<0.001). A risk of being infected with HSV 2 increased with the number of reported lifetime sexual partners Those with two and three or more were 2,5 and 4.6 times more likely to have HSV2 respectively (OR: 2.5, 95% CI: 2.1,3.1, p<0.001 and OR: 4.6, 95% CI: 3.8, 5.6, p<0.001 respectively). Women who had less than high school education were also found to have higher risk for HSV 2. Conclusion: The secondary analysis showed a high prevalence of HSV 2 infection and a strong association of HSV 2 and HIV. A significant association of HSV 2 was noted in women having more than two sex partners and lower high school education. Therefore, it is recommended that screening for HSV 2 among high risk populations be incorporated into the STI screening and treatment packages. / Prevalence and risk factors associated with HSV 2 / Herpes Simplex Virus Type 2 / HSV 2 / Department of Health Studies / M. (Public health)