Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est l’agent étiologique du SIDA, un rétrovirus complexe encodant les protéines accessoires : Nef, Vif, Vpr et Vpu. La fonction principale de ces protéines est de moduler l’environnement cellulaire afin de promouvoir la réplication virale. Les travaux présentés dans cette thèse portent sur la protéine virale Vpr, une protéine bien connue pour son activité d’arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M dans les cellules en division et pour l’avantage réplicatif qu’elle confère au virus durant l’infection de cellules myéloïdes. Les évènements sous-jacents à ces deux activités restent pour l’heure mal compris. Le but des travaux regroupés dans cet ouvrage est d’identifier de nouveaux facteurs cellulaires pouvant éventuellement expliquer les activités de Vpr précédemment décrites. Pour ce faire, nous avons utilisé une approche d’identification des partenaires de proximité par biotinylation, appelée BioID. L’avantage du BioID est de permettre un marquage in cellulo des protéines à proximité de la protéine d’intérêt. La mise en place et la caractérisation de cette approche font l’objet de la première section de cette thèse. En utilisant cette approche, nous avons défini un réseau de 352 partenaires cellulaires de la protéine Vpr. Parmi ces partenaires de Vpr, plusieurs sont organisés sous forme de complexes ou réseaux protéiques incluant notamment le complexe promoteur de l’anaphase/cyclosome (APC/C) et les centrosomes. Étant donné que le complexe APC/C est l’un des principaux régulateurs du cycle cellulaire, nous avons décidé d’analyser sa relation avec Vpr. Nous avons découvert que Vpr formait un complexe non seulement avec APC1, une sous-unité essentielle du complexe APC/C, mais aussi avec les coactivateurs (CDH1 et CDC20) de ce complexe. Nous avons par la suite démontré que Vpr induisait la dégradation d’APC1 et que celle-ci pouvait être prévenue par une double-mutation N28S-G41N de Vpr. Cette dégradation d’APC1 ne semblerait pas être reliée aux activités précédemment décrites de Vpr. Ces travaux font l’objet de la seconde section de cette thèse. Enfin, dans une troisième section, des travaux effectués en collaboration et analysant la relation entre les centrosomes et Vpr sont présentés. Cette thèse identifie 200 nouveaux partenaires de Vpr, ouvrant la porte à l’exploration de nouvelles cibles et activités de Vpr. Elle décrit également une nouvelle cible de Vpr : le complexe APC/C. Globalement nos résultats contribuent à une meilleure compréhension de la façon dont le VIH-1 manipule l’environnement cellulaire de l’hôte à travers la protéine virale Vpr. / Human immunodeficiency virus (HIV-1) is the AIDS causal agent. This complex retrovirus encodes several accessory proteins; namely Nef, Vif, Vpr and Vpu; whose functions are to manipulate the cellular host environment in order to favor HIV-1 viral replication. This thesis focused on Vpr whose main activities are to induce a cell cycle arrest in the G2/M phase in dividing cells and to provide a replicative advantage to HIV-1 during infection of myeloid cells such as macrophages. The cellular mechanisms underlying these two activities are up to now misunderstood. The main goal of the work presented in this thesis is to identify new cellular factors that could potentially explain the previously described Vpr activities. To do so, we used the proximity labelling approach called BioID. The main strength of BioID is to tag in cellulo partners of the protein of interest. The development as well as optimization of the BioID approach is presented in the thesis first section. Using BioID, we defined a network containing 352 cellular partners in close proximity with the viral protein Vpr. Amongst these cellular partners, several were organized into protein complexes or networks such as the anaphase promoting complex/cyclosome (APC/C) or the centrosome. Given that APC/C is a cell cycle master-regulator, we analyzed the interplay governing Vpr and APC/C interactions. We first demonstrated that Vpr could form a complex containing the scaffolding subunit APC1. APC/C coactivators, namely CDH1 and CDC20, could also be found in association with Vpr. We next showed that Vpr was inducing APC1 degradation and that Vpr residues N28 and G41 were essential to this activity. Surprisingly, the APC1-Vpr interplay does not relate to previously described Vpr activities. This work is presented in the second section of this thesis. Lastly, in the third section, a work done in collaboration analyzed the interplay between Vpr and the centrosomes. In this thesis we identified 200 new potential partners of Vpr, opening the doors to discover novel Vpr targets and activities. This thesis also defined APC/C as new Vpr target. Taken together our results allow a better understanding on how HIV-1 modulates the cellular environment by using the viral accessory protein Vpr.

L’infection par le VIH-1 est caractérisée par une activation chronique du système immunitaire et par une réduction graduelle du nombre de lymphocytes TCD4+, qui contribuent à une détérioration lente du système immunitaire menant à la phase SIDA. Paradoxalement, ce sont majoritairement des lymphocytes T CD4+ non infectés qui sont détruits et la cause de ce phénomène reste encore inconnue. Certaines protéines virales, dont la protéine accessoire Vpr, sont soupçonnées de jouer un rôle dans ce processus. Synthétisée tardivement, Vpr est incorporée à l’intérieur des virions, en plus d’être relâchée sous forme soluble dans le milieu extracellulaire. La principale fonction biologique de Vpr est l’induction d’un arrêt de cycle en phase G2/M, via le recrutement du complexe d’ubiquitine E3 ligase CUL4A-DDB1VprBP et l’activation de la voie de dommage à l’ADN contrôlée par la kinase ATR. Une étude démontre que l’activation des voies de dommages à l’ADN conduit à l’expression de ligands du récepteur activateur NKG2D, exprimés par les cellules NK, déclenchant leurs fonctions cytolytiques. Chose intéressante, plusieurs études suggèrent que le VIH-1 régule positivement l’expression des ligands de NKG2D à la surface des lymphocytes T CD4+ infectés. Cependant, le facteur viral impliqué dans ce processus reste encore indéfini. Le but de cette thèse était d’évaluer le rôle de Vpr dans la modulation des fonctions cytolytiques des cellules NK et son implication potentielle dans la destruction des lymphocytes T CD4+. Nos travaux ont permis de démontrer que l’expression de Vpr, seule ou dans le contexte de l’infection, est suffisante afin d’augmenter spécifiquement l’expression du ligand de NKG2D, ULBP2, au niveau de lymphocytes T CD4+ primaires. Conséquemment, Vpr augmente ainsi la susceptibilité de ces cellules à une lyse par des cellules NK autologues. Nous démontrons que cette régulation positive d’ULBP2 repose sur la capacité de Vpr de recruter le complexe d’ubiquitine E3 ligase DDB1-CUL4AVprBP et l’activation de la voie de dommage à l’ADN ATR. Plus important encore, nous apportons des preuves que Vpr augmente également l’expression d’ULBP2 au niveau des cellules non infectées lors d’une infection de lymphocytes TCD4+ par le VIH-1. À cet effet, nous montrons que l’acheminement de Vpr au niveau de lymphocytes T CD4+ non infectés via des particules virales défectives est suffisant afin de réguler positivement ULBP2 et d’augmenter leur lyse par des cellules NK autologues. De plus, nous décrivons pour la première fois que Vpr, sous forme soluble, a la capacité d’induire des dommages à l’ADN et de réguler positivement ULBP2 suite à la transduction de différents types cellulaires, incluant des cellules T. Globalement, nos résultats démontrent que Vpr est un facteur viral clé impliqué dans la régulation positive des ligands de NKG2D induite par le VIH-1. Cette régulation positive d’ULBP2 pourrait alors contribuer à la destruction des lymphocytes T CD4+ infectés et non infectés via l’activation des fonctions cytolytiques des cellules NK. Une meilleure compréhension de la contribution de cette activité de Vpr dans la pathogenèse du VIH-1 a le potentiel de permettre le développement de nouvelles cibles ou stratégies thérapeutiques contre le VIH-1. / Chronic immune activation and gradual depletion of CD4+ T cells are hallmarks of HIV-1 infection, which are thought to contribute to the progressive deterioration of the host’s immune response that ultimately leads to AIDS. Paradoxically, the majority of CD4+ T cells that are destroyed are uninfected and causes for this bystander effect of infection on CD4+ T cells remains unclear. Some HIV-1 proteins, including the accessory protein Vpr, are suspected to play a role in this process. Vpr, expressed late during HIV-1 infection, is shown to be incorporated within the budding virions as well as secreted as soluble protein in the extracellular medium from the infected cells. The main biological function of Vpr is the induction of a G2/M cell-cycle arrest through the recruitment of the E3 ubiquitin ligase complex DDB1-CUL4AVprBP and activation of the ATR-mediated DNA damage pathway. One study showed that activation of DNA damage pathways leads to the expression of specific ligands for the activating receptor NKG2D expressed on NK cells, thus triggering NK cell cytolytic function. Interestingly, several evidences suggest that HIV-1 upregulates expression of specific NKG2D ligands on infected CD4+ T cells. However, the viral factor involved in this process remains undefined. The aim of this thesis was to evaluate the role of Vpr in modulating NK cell cytolytic function and its potential involvement in CD4+ T cells depletion. Our work demonstrated that the expression of Vpr, alone or in the context of HIV-1 infection, is sufficient to specifically increase expression of the NKG2D ligand, ULBP2, on primary CD4+ T cells. Consequently, these CD4 T cells become more susceptible to autologuous NK cell-mediated lysis. Our studies have shown that this Vpr-mediated ULBP2 upregulation requires the recruitment of the E3 ubiquitin ligase complex DDB1-CUL4AVprBP and the activation of the ATR-mediated DNA damage pathway. More importantly, we provide evidence that Vpr augments ULBP2 expression on both infected and uninfected bystander cells during HIV-1 infection of primary CD4+ T lymphocytes. In that context, we show that delivery of Vpr into uninfected cells via defective viral particles is sufficient to upregulate ULBP2 and increase their susceptibility to autologuous NK cell-mediated killing. In addition, we describe for the first time that soluble Vpr has the ability to induce DNA damages and upregulate ULBP2 upon transducing target cells, including T cells. Overall, our results show that Vpr is a key HIV-1 factor involved in the upregulation of NKG2D ligands induced by HIV-1. This upregulation of UBP2 might contribute to depletion of infected and uninfected CD4 + T cells through activation of NK cell cytolytic functions. A better understanding of the contribution of this new activity of Vpr in HIV-1 pathogenesis has the potential to enable the development of new therapeutic targets or therapeutic strategies against HIV-1.

Managing a project is multitasking. For making this easier, a project mangaer has a lot of tools. Two of the tools that are often used are a project management model and a virtual project room. These two can be of different types in different compaies and in different culutres. In this thesis, we investigate it there is any neeed for these two tools to be combined. If there is a need, how should the combination be done?

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