Ctenomys flamarioni é um roedor subterrâneo endêmico do litoral do Estado do Rio Grande do Sul - Brasil. Devido à sua distribuição restrita ao ambiente costeiro, que está em constante mudança, e à fragmentação e destruição do habitat, devido à ação humana, essa espécie está nas listas de fauna ameaçadas de extinção. Estudos anteriores, com marcadores microssatélites e DNA mitocondrial, identificaram a baixa variabilidade genética na espécie, por outro lado, o estudo de loci que se esperam estar sob seleção seria uma ferramenta importante para identificar a relação dos indivíduos com o ambiente e os processos que moldaram a variabilidade genética da espécie ao longo da história. O Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) é composto por um grupo de genes estreitamente ligados que constituem o componente genético mais importante do sistema imunológico dos mamíferos. Dois principais mecanismos têm sido descritos como responsáveis pela manuntenção da diversidade do MHC e estão relacionados com o combate de parasitas e com mecanismos reprodutivos, que evitam o endocruzamento. Nesse estudo investigamos a variabilidade genética dos loci DRB e DQA do MHC e comparamos os índices de diversidades com os valores encontrados em estudos com outros ctenomídeos e com os encontrados para loci neutros da mesma espécie. A diversidade genética para o locus DRB de C. flamarioni foi menor do que a encontrada em estudos para o mesmo locus em outras espécies do gênero e também foi menor do que a encontrada em estudos para a mesma espécie, com marcadores neutros, inclusive para populações que passaram por reduções recentes (gargalos-de-garrafa). Os resultados indicam que a seleção balanceadora não foi suficiente para manter a diversidade genética nas populações estudadas e que as reduções populacionais, identificadas através dos loci neutros, devem ter sido bastante drásticas, por afetarem também a diversidade de um locus conhecidamente bastante variável (DRB de MHC). Não pudemos avaliar a diversidade do locus DQA devido a alta incidência de sequências muito divergentes encontradas, possivelmente pseudogenes. O estado de conservação de Ctenomys flamarioni é considerado crítico, por todos os fatores que afetam a espécie, como a instabilidade do ambiente em que ocorrem, a fragmentação e destruição do habitat pela ação humana e pela sua baixa diversidade genética, especialmente em um locus importante do sistema imunológico. A perda da diversidade no locus de MHC poderia estar relacionada à diminuição do número de indivíduos por população, que aumenta o risco de endogamia, que por sua vez pode levar à perda da aptidão reprodutiva, expressão de alelos recessivos deletérios e perda da flexibilidade adaptativa. Além disso, a perda da diversidade em um locus importante para a defesa do organismo contra parasitas aumenta a suscetibilidade dos indivíduos a doenças, e todos esses fatores elevam o risco de extinções locais, colocando em perigo o futuro da espécie. / Ctenomys flamarioni is a subterranean rodent, endemic to the coastline of the state of Rio Grande do Sul, Brazil. Due to its strict distribution to the coastal environment, which is constantly changing, and to habitat fragmentation and destruction caused by human actions, this species appears in lists of threatened fauna. Previous studies, using microsatellite markers and mitochondrial DNA, identified the low genetic variability in this species. On the other hand, the study of loci that are expected to be under balancing selection would be an important tool to identify the relation between individuals and their environment and processes which have molded the genetic variability of this species throughout history. The Major Histocompatibility Complex (MHC) is comprised by a closely connected group of genes that constitute the most important genetic component of the immune system of mammals. Two main mechanisms have been described as responsible for maintaining MHC diversity and are associated with parasite combat and reproductive mechanisms for inbreeding avoidance. In this study we investigated the genetic variability of the DRB and DQA loci of the MHC and compared these diversity indices with values found in studies about other ctenomyids and with values found for neutral loci in this species. The genetic diversity for the DRB locus in C. flamarioni was lower than what is found for the same locus in other species of the same genus and it was also lower than what was found in studies with this species using neutral markers, especially in populations which have gone through recent size reductions (bottlenecks). The results indicate that the balancing selection was not sufficient to maintain the genetic diversity in the studied populations and that population size reductions, identified through neutral loci, must have been very drastic, since they also affected the diversity of a loci which is known to be highly variable (DRB of the MHC). We could not evaluate the diversity for the DQA loci due to high incidence of very divergent sequences, possibly pseudogenes. The status of conservation of this species is considered critical due to all the factors that affect the species, such as the instability of the environment on which it occurs, habitat fragmentation and destruction caused by human actions, and its low genetic diversity, especially in an important locus of the immune system. The loss of diversity in the MHC locus could be associated to the decrease in number of individuals per population, which increases the risk of endogamy which, in turn, can lead to the loss of reproductive fitness, expression of deleterious recessive alleles and loss of adaptive flexibility. Moreover, the loss of diversity in a locus which is important in the defense of the organism against parasites increases the susceptibility of the individuals to diseases, and all these factors raise the risk of local extinctions, endangering the future of the species.

O êxito na seleção de plantas geneticamente superiores está diretamente relacionado à existência de variabilidade genética apresentada naturalmente ou artificialmente. No entanto, o melhoramento de espécies apomíticas é dificultado pela impossibilidade de ocorrer a união de gametas com plantas deste modo de reprodução. Por outro lado, a utilização de plantas sexuais compatíveis a cruzamentos com plantas apomíticas, podem gerar novas combinações gênicas e indivíduos com alta heterose podem ser selecionados já na primeira geração para lançamento como novas cultivares. A descoberta de plantas diplóides sexuais em populações naturais de Paspalum plicatulum e a posterior duplicação das mesmas possibilitaram um grande universo no desenvolvimento de novos genótipos a partir de cruzamentos entre espécies relacionadas. O objetivo do trabalho foi de: (i) avaliar a produção de forragem de genótipos nativos superiores de espécies do gênero Paspalum; (ii) caracterizar a estabilidade e adaptabilidade de produção destes genótipos; (iii) estimar através de técnicas da genética quantitativa, a herdabilidade e a associação entre caracteres de importância forrageira; (iv) obter variabilidade genética por meio de hibridizações interespecíficas, utilizando genótipos superiores nativos de P. lepton e de P. guenoarum como genitores masculinos (apomíticos) e um genótipo de P. plicatulum como genitor feminino (sexual); (v) analisar as progênies superiores quanto ao modo de reprodução selecionando plantas estáveis reprodutivamente para lançamento como cultivares e as de reprodução sexual para novos cruzamentos. Os genótipos das espécies de P. lepton e P. guenoarum apresentam variabilidade genética em caracteres de interesse forrageiro, bem como desempenho variável de acordo com o local e o ano de cultivo. A produção de matéria seca total e de folhas são os caracteres que mais contribuem para a detecção da variabilidade genética observada, independentemente do ano de avaliação. O ganho genético na produção de folhas se mostra eficiente via seleção indireta pela matéria seca total, caráter de alta herdabilidade e de mais fácil seleção e aferição. Houve ampla variabilidade nos caracteres ligados a produção de forragem e alguns híbridos apresentaram heterose para a maioria dos caracteres analisados. A maioria das progênies selecionadas apresentaram a apomixia como modo de reprodução, o que potencializa o lançamento como cultivar. Já as plantas sexuais superiores serão usadas para recombinação com os melhores híbridos para obtenção de novas constituições genéticas. Os dendrogramas obtidos em nível de campo e de DNA foram capazes de discriminar os genótipos e podem auxiliar na orientação em novas hibridizações com plantas sexuais compatíveis. Houve pouca variabilidade na composição química entre os genótipos. Mais estudos deverão ser realizados para viabilizar o desenvolvimento de cultivares no uso em pastagens naturais, assim como no emprego como pastagens cultivadas. / The successful selection of genetically superior plants is directly related to the existence of natural or artificial genetic variability. However, the breeding of apomictic species is hampered by the inability of the union of gametes with plants of this mode of reproduction. In another hand, the use of sexual plants compatible to crosses with apomictic plants can generate new genetic combinations, and individuals with high heterosis can be selected on the first generation and releasae as new cultivars. The discovery of sexual diploid plants in natural populations of Paspalum plicatulum and their subsequent duplication to do possible the development of new genotypes from crosses between closely related species. Thus, this study aimed to: (i) evaluate the forage yield of superior genotypes of native species of Paspalum, (ii) characterize the stability and adaptability of production of these genotypes; (iii) estimate using techniques of quantitative genetics, the heritability and its association between important forage characters; (iv) get a genetic variability through interspecific hybridization, using superior genotypes of native P. lepton and P. guenoarum as male parents (apomictic) and one genotype of P. plicatulum as female parent (sexual); (v) analyze the superior progenies to reproduction, selecting plants reproductively stable for releasing as cultivars and, of sexual reproduction for new crossings. The genotypes of the species P. lepton and P. guenoarum take a genetic variation in their traits of interest forage; furthermore, their performance depend of location and year of cultivation. The total dry matter production and leaf are the traits that most contribute to the detection of genetic variability, independent of the year of evaluation. The genetic gain in leaf production is efficient to indirect selection for total dry matter; this character present high heritability and, easier selection and estimation. There was wide variability in characters linked to forage production and some hybrids showed heterosis for most traits analyzed. Moreover, most of the selected progenies showed apomixis as reproductive mode, which enhances the release as cultivar. The sexual plants should be used for recombination with the best hybrids to get new genetic constitutions. The dendrograms obtained through field and DNA characteristics were able to discriminate genotypes and could help to get new sexual hybridizations with compatible plants. A little variability in chemical composition between genotypes was observed. Thus, more studies should be conducted to enable the development of cultivars to use on native rangelands, even as the employment as pastures.

Resumo não disponível

O grupo willistoni de Drosophila é o grupo de espécies mais bem representado nas comunidades neotropicais de insetos da família Drosophilidae. Ele é constituído por 6 espécies crípticas e por 19 não crípticas e a este grupo de espécies é atribuída origem no Brasil Central, em associação com habitats de florestas quentes e úmidas. Drosophila willistoni, tida como a remanescente do ancestral comum, chama particularmente a atenção dentro do grupo, por possuir uma grande "versatilidade ecológica" diversas vezes comprovada, o que se expressa pela capacidade de exploração bem sucedida de diversos tipos de ambientes, tais como matas, formações abertas, cidades, bem como de diferentes tipos de substratos alimentares e de criação. Sua distribuição geográfica vai desde o sul dos Estados Unidos (Flórida) e México na América do Norte, até o norte da Argentina na América do Sul. Além desta versatilidade ecológica, e talvez subjacente a ela, D. willistoni apresenta uma grande variabilidade genética expressa através de diferentes marcadores genéticos já estudados, tais como polimorfismo cromossômico para inversões paracêntricas e polimorfismo enzimático. Tendo em vista este panorama, o presente trabalho teve como objetivo amplo fazer uma busca no genoma de D. willistoni, no sentido de encontrar alguma indicação para explicar esta variabilidade genética e versatilidade ecológica em nível de DNA repetitivo. A primeira tentativa que realizamos de isolar e caracterizar este tipo de DNA em D. willistoni está descrita no capítulo 4, onde verificamos que as seqüências que compõe os telômeros desta espécie são muito divergentes do modelo D. melanogaster. Partimos, então, para o passo seguinte da investigação descrito no capítulo 2, que seria isolar seqüências repetitivas do genoma de D. willistoni. Nossos resultados iniciais demonstraram a existência de um padrão sexoespecífico na clivagem do DNA genômico de machos e fêmas com as enzimas de restrição AluI e HaeIII. À medida que foi sendo investigado este padrão, levounos à descrição de um fenômeno biológico tido como inexistente no genoma de D. melanogaster: a metilação. Isolamos e seqüenciamos parcialmente 44 clones que consideramos ser segmentos do genoma de D. willistoni que estão envolvidos neste processo de metilação, sendo que identificamos entre estas o gene ribossomal 18S. No capítulo 3 aprofundamos estas investigações referentes à metilação e concluímos que no genoma de D. willistoni ocorrem compartimentos metilados, tais como ocorre em Molusca, Cnidários e outros animais e um destes compartimentos corresponde à uma parte dos genes ribossomais. A partir destes resultados nosso trabalho propõe uma mudança num conceito estabelecido no Gênero Drosophila sobre metilação. Nós estamos demonstrando que este mecanismo epigenético de controle da expressão gênica existe no genoma de D. willitoni e que, portanto, ela estaria fazendo parte do grupo de organismos que tem o seu DNA fracionalmente metilado. / The Drosophila willistoni species group is the most abundant in Neotropical assemblies. It is native from Central Brazil and is constituted by 6 sibling and 19 non-sibling species, living in association with hot and humid forests. In this group, Drosophila willistoni call special attention because it have a recognized great “ecological versatility”, expressed by the ability to explore several types of environments, as forests, open formations, cities and to breed in several types of substrates. Its geographical distribution comprehends since Florida, in the South of United States of America and Mexico, until the North of Argentina, in South America. Besides this ecological versatility, D. willistoni also presents an ample genetic variability detected by several genetic markers, exemplified by the chromosomal polymorphism for paracentric inversions and the enzymatic polymorphism. Considering this scenario, the present study have the main objective to make a molecular screening in the genome of D. willistoni, trying to found some clue that could explain such genetic and ecological variability at the level of repetitive DNA. The results of our first attempt to isolate and to characterize this type of DNA in D. willistoni are described in Chapter 4, where we verify that the telomeric sequences of this species are very divergent of those occurring in the modelspecies D. melanogaster. The next step of our investigation was to isolate repetitive sequences of the D. willistoni’s genome. This attempt is described in Chapter 2 and our results showed sex-specific patterns of cleavage of genomic DNA of males and females with the restriction enzymes AluI e HaeIII. These results demonstrated by the first time, the existence of a phenomenon not found in D. melanogaster: the metylation in the genome of D. willistoni. Isolating and partially sequencing 44 clones considered by us as segments of the genome of D willistoni involved in the mechanism of methylation, we found the 18S ribosomal gene among them. In Chapter 3, we continued the investigations about methylation in the genome of D. willistoni and concluded that in this species, as occurs in the genomes of other animals, as Mollusca and Cnidaria, exists methylated compartments, and that one of these compartments, correspond to part of the ribosomal genes. Considering all our findings, we propose a change in the previously established concept about lack of methylation in the Genus Drosophila. We demonstrated that this epigenetic mechanism of control of gene expression exists in the genome of D. willistoni, and so, this species needs to be considered as member of the group of organisms which have its DNA fractionally methylated.

O capim-limão é uma planta herbácea, perene, que ocorre naturalmente no estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Seu potencial econômico se deve ao fato de apresentar óleo essencial utilizado como aromatizante e flavorizante, além de apresentar atividade bactericida atribuída tanto ao óleo quanto ao conteúdo de compostos fenólicos. Apesar da importância, poucos estudos foram desenvolvidos para esta espécie. Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivo analisar populações nativas de Elionurus sp., estimando a variabilidade existente e contribuindo com novas informações para subsidiar programas de exploração e melhoramento dessa espécie. O trabalho foi realizado com cinco populações de capim-limão coletadas no Rio Grande do Sul, totalizando 50 plantas cultivadas em vasos na Faculdade de Agronomia. Os compostos fenólicos foram quantificados através do método Folin- Ciocaultreau, utilizando-se o ácido gálico como padrão. O óleo foi caracterizado quimicamente por cromatografia gasosa e espectrometria de massas. O marcador molecular utilizado para a análise da variabilidade genética foi o RAPD. As cinco populações de capim-limão apresentaram variabilidade para aos caracteres fenotípicos e para concentração de compostos fenólicos. O óleo essencial apresentou variabilidade de compostos, sendo o Geranial e o Neral os mais importantes. A análise molecular demonstrou uma elevada variabilidade para as populações, permitindo a separação dos indivíduos em cinco grupos, sendo possível, de modo geral, agrupá-los de acordo com a origem geográfica. Observou-se também que a maior variabilidade ocorre dentro de cada população. Os resultados indicaram que a população São Francisco de Paula foi a de pior desempenho para a maioria dos caracteres avaliados. As populações São Borja e Faculdade de Agronomia foram as que apresentaram maior destaque em relação às demais, exibindo elevado conteúdo de Citral e melhor desempenho nos caracteres observados, podendo ser recomendadas para utilização em programa de melhoramento. / Lemon-grass is a herbaceous, perennial plant, that occurs in Rio Grande do Sul (Brazil). It has economic potential due to the presence of essential oils, which are used in perfume and flavor industry. In addition, this species present recognized bactericidal activity attributed to the essential oils and phenolic compounds. Despite of this, few studies have been developed for this species. The present work aimed to analyze native populations of Elionurus sp., contributing with new information to subsidize farm exploration and breeding programs. The analysis was preformed with five populations of lemon grass collected in different location of Rio Grande do Sul, totalizing 50 plants cultivated in pots in the Faculdade de Agronomia/UFRGS. The phenolic compounds were quantified through the Folin-Ciocaultreau method, using Gallic acid as a standard. The essential oils were characterized chemically by gas chromatography and mass spectrometry. RAPD was used as molecular marker for the analysis of genetic variability. The five populations of lemon grass presented variability for the phenotypic traits and phenolic compounds concentration. The essential oils also presented variability, being Geranial and Neral the most important. Molecular analysis demonstrated high variability for the populations, allowing the separation in five groups. It was possible to match molecular grouping with geographic origin. On the other hand, the largest variability was observed within populations. The results indicated that São Francisco de Paula population had the worst performance for the majority of the evaluated traits. The populations São Borja and Faculdade de Agronomia presented high production of Citral and they also showed the best performance for the observed traits. As a consequence, it is possible to recommend both populations as starting germplasm for breeding programs of lemon-grass.

Os híbridos são os principais materiais de milho cultivados no mundo e a oportunidade de introduzir variabilidade genética nesses materiais é muito limitada, devido às altas exigências do mercado em relação à produtividade. Por essa razão, os melhoristas, em geral, utilizam o próprio germoplasma elite como fonte de variabilidade, garantindo, dessa forma, a manutenção do padrão dos seus materiais. Entretanto, muitas vezes a variabilidade desses genótipos é insuficiente, tornando necessária a busca de alelos em materiais de locais distantes, que muitas vezes apresentam problemas de adaptação ambiental. As variedades crioulas, em contrapartida, além de serem ricas em variabilidade genética, são naturalmente adaptadas às regiões de origem. A desvantagem desses materiais é que eles são agronomicamente inferiores, limitando o seu uso direto como variedade comercial ou como fonte de germoplasma. Por essa razão, um dos grandes desafios do melhoramento genético tem sido determinar estratégias que permitam a rápida e eficiente incorporação de variabilidade em materiais elite. Em milho, os principais caracteres agronômicos têm natureza quantitativa. Dessa forma, a identificação de QTLs (Quantitative Trait Loci) e a introgressão de alelos superiores, a partir de gerações avançadas de retrocruzamentos (AB-QTL, Advanced Backcrosses- QTL) entre linhagens elite e variedades crioulas, poderia ser uma estratégia para a incorporação de variabilidade. Sendo assim, os objetivos desse trabalho foram selecionar variedades crioulas com caracteres agronômicos de interesse e linhagens elite, identificar QTLs associados a caracteres agronômicos e verificar o potencial da técnica de AB-QTL para a introgressão de alelos superiores da variedade crioula na linhagem elite. Após o cruzamento entre a linhagem elite LA67 e a variedade crioula Argentino Flint, foram realizados dois retrocruzamentos com a linhagem e dois ciclos de autofecundação. A progênie resultante foi genotipada com microssatélites e fenotipada para 25 caracteres agronômicos. Foram identificados 29 QTLs e pelo menos cinco alelos superiores da variedade crioula foram introgredidos na linhagem elite. Esses resultados indicaram que a técnica de AB-QTL foi eficiente tanto para a identificação de novos QTLs quanto para a introgressão de alelos superiores da variedade crioula na linhagem elite. / Most corn presently cultivated in the world are hybrids. The chances to introduce genetic variability in this material are small due to market requirements in terms of productivity. For this reason corn breeders in general use their own elite germoplasm as source of genetic variability, maintaining therefore the standard characteristics of their germoplasm. However, the variability of these genotypes might be insufficient, requiring the use of germoplasm from different locations that often do not have wide environment adaptation. The landraces, besides being rich in genetic variability, are naturally adapted to their sites of origin. The disadvantage of these materials is that they are agronomically inferior, limiting their direct use as commercial varieties or as germplasm source. For this reason one of the main challenges of genetic breeding has been to create strategies that allow a rapid and efficient incorporation of variability in elite materials. In corn the main agronomic characters are of quantitative nature. Therefore the QTLs (Quantitative Trait Loci) identification and the introgression of superior alleles from advanced generations of backcrosses (AB-QTL, Advanced Backcrosses QTL) between elite lines and landraces, could be a strategy to incorporate variability. The objectives of this work were: to select landraces with agronomic traits and elite lines, to identify QTLs associated with agronomic characters in corn, and to verify the potential of the AB-QTL technique for introgression of superior alleles from the landraces into elite lines. Two backcrosses and two self-fertilization cycles were done after crossing the elite line LA67 with the Argentino Flint landrace. The progeny was genotyped with microssatelites and phenotyped for 25 agronomic traits. Twenty nine QTLs were identified and at least five superior alleles of the landrace were introgressed into the elite line. The results indicated that the AB-QTL technique was efficient for the identification of new QTLs and for the introgression of superior alleles in the elite lines.

O milho é uma das principais espécies cultivadas no mundo, e tem importância fundamental na alimentação de animais e humanos. Além disso, é considerado um dos cereais com maior variabilidade genética entre os cultivados, a qual é expressa nas diversas variedades crioulas existentes. Entretanto, para que toda esta variabilidade genética possa ser utilizada pelo melhoramento genético, é imprescindível o conhecimento do potencial genético destas raças. Dessa forma, os objetivos deste trabalho foram caracterizar diversas variedades crioulas de milho provenientes do sul do Brasil a nível fenotípico, molecular e citogenético e, com base nestes resultados, estimar a distância genética existente entre eles. Os marcadores moleculares utilizados neste trabalho foram microssatélites e AFLP. As análises morfológicas e moleculares demonstraram a existência de variação genética entre os genótipos avaliados, possibilitando o agrupamento de acordo com a distância genética existente entre eles. As análises citogenéticas indicaram a presença de poucas anormalidades nos grãos de pólen, as quais não comprometem o potencial reprodutivo dos genótipos. Estas informações podem contribuir significativamente com os programas de melhoramento que se dedicam a lançar genótipos com maior potencial agronômico.

A Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) é uma condição lentamente progressiva de pobre reversibilidade que se caracteriza pela limitação do fluxo aéreo associada a uma resposta inflamatória anormal dos pulmões. Seu desenvolvimento e progressão estão relacionados ao incremento do estresse oxidativo, sendo este um importante componente patogênico da inflamação das vias aéreas nesta doença. Sendo assim, este estudo caso-controle teve por objetivo avaliar e quantificar danos no DNA (pelo do ensaio cometa alcalino simples e modificado com as endonucleases Fpg e Endo III e pelo teste de micronúcleos de esfoliado da mucosa oral) em lipídios (pelo ensaio de TBARS) e proteínas (pelo ensaio com DNPH), bem como avaliar a influência dos polimorfismos de genes envolvidos na Fase I do metabolismo de xenobióticos (CYP1A1 C2453A e CYP2E1 C-1053T), Fase II (GSTM1null, GSTT1null e GSTP1 Ile105Val), e na neutralização de espécies reativas de oxigênio (CAT C-262T e GPx1 Pro198Leu) sobre os biomarcadores. A população estudada compreendeu 51 indivíduos de função pulmonar saudável e 51 pacientes com DPOC da região do Vale do Rio Pardo, RS, Brasil. Os pacientes apresentaram índices de dano superiores no cometa alcalino e modificado com Fpg e Endo III (P<0,001; P=0,023 e P=0,021, respectivamente). Não houve diferença na formação de MN entre os grupos (P=0,651). Os pacientes que não participavam de um programa de reabilitação pulmonar apresentaram índices de peroxidação lipídica superiores aos controles e àqueles que participavam dos exercícios (P<0,001). Adicionalmente, foi encontrada uma tendência a uma maior carbonilação proteica nos pacientes não aderentes ao programa. Todos os polimorfismos investigados apresentaram diferentes efeitos modulatórios nos índices de dano do ensaio cometa, nos controles, pacientes, ou ambos, mas não na formação de micronúcleos. Além de ressaltar os efeitos da inflamação sistêmica típica da DPOC, esse estudo evidencia a influência da variabilidade genética individual sobre o dano não clastogênico no DNA destes pacientes. / Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) is a slowly progressive condition of poor reversibility that is characterized by airflow limitation associated with an abnormal inflammatory response of the lungs. Its development and progression are related to increased oxidative stress, which is an important pathogenic component of airway inflammation in this disease. Thus, this case-control study, aimed to evaluate and quantify DNA (using the alkaline and endonuclease-modified comet assay and micronucleus test in exfoliated oral mucosal ), lipid (TBARS) and protein (DNPH assay) damage, and to evaluate the influence of genetic polymorphisms of genes involved in Phase I metabolism of xenobiotics (CYP1A1 C2453A, CYP2E1 C-1053T), Phase II (GSTM1null, GSTT1null, GSTP1 Ile105Val), and neutralization of ROS (CAT C-262T and GPx1 Pro198Leu) on these biomarkers. The target population comprised 51 individuals with healthy pulmonary function and 51 patients with COPD from the Rio Pardo Valley, RS, Brazil. The patients had higher Damage Index (DI) in the alkaline, Fpg and Endo III-modified comet, (P <0.001, P = 0.023 and P = 0.021, respectively). There was no difference in the formation of MN between the groups (P = 0.651). Patients who had not participated in a pulmonary rehabilitation program showed higher levels of lipid peroxidation than the controls and those who participated in the exercises (P <0.001). Additionally, it was found a trend towards a higher protein carbonylation in these non-adherent patients. All investigated polymorphisms had distinct modulatory effects in the comet assay’s DI in controls, patients, or both, but not in the micronucleus formation. Aside from highlighting the effects of the COPD’s typical systemic inflammation, this study stresses the influence of individual genetic variability on non-clastogenic damage in these patients’ DNA.

O Brasil tem uma posição de destaque no setor de negócios avícola mundial. Esta posição é resultado de uma atividade com alto grau de desenvolvimento tecnológico, destacando-se os avanços na área da genética. Características produtivas importantes têm sido o foco dos melhoristas de galinhas. Entretanto, em termos de selecionar aves visando o aumento da resistência a doenças, pouco ou nada tem sido feito. Recentemente, a avicultura nacional voltou-se para o resgate desta característica e uma série de linhagens mais rústicas, as chamadas linhagens caipiras, têm sido desenvolvidas. Este resgate, porém tem se baseado apenas em traços fenotípicos de rusticidade, não se levando em consideração as bases da genética molecular dos mesmos. A grande maioria das doenças que atacam as galinhas é de origem vírica, sendo os genes B-F (classe I- do MHC) os principais responsáveis pelo desencadeamento da resposta imune a estes agentes. Logo, tornam-se necessárias maiores investigações nestes genes para obter-se um melhor conhecimento sobre a imunidade aos vírus, possibilitando medidas que incrementem esta imunidade. Tais investigações ainda não tinham sido realizadas em galinhas caipiras brasileiras. Das técnicas utilizadas para genotipar os genes B-F o seqüenciamento de DNA é a única que apresenta 100% de fidelidade; entretanto, é cara e trabalhosa. Assim, técnicas mais ágeis e baratas e que apresentem resultados significantes para esta finalidade são sempre pertinentes. Recentemente, um microssatélite (LEI0258) foi descrito numa localização muito próxima da região dos genes B-F, o qual tem-se mostrado uma ótima ferramenta para genotipar os haplótipos B-F; mas novamente, não havia estudos a respeito em aves caipiras. Este trabalho teve por finalidade investigar a variabilidade dos genes B-F, através da técnica de seqüenciamento do DNA, e deduzir as seqüências de aminoácidos codificadas pelos alelos destes genes encontrados em galinhas caipiras brasileiras de ovos azuis. Concomitantemente, procurou-se estudar o polimorfismo do microssatélite LEI0258 em duas populações desses animais (caipiras de ovos azuis criadas livremente e a linhagem caipira Paraíso Pedrês), assim como a relação dos alelos LEI0258 com os alelos ou haplótipos B-F na amostra de aves de ovos azuis. Os resultados e conclusões alcançados podem ser resumidos como segue: 1. Vinte e seis diferentes seqüências nucleotídicas B-F de DNA, que correspondem ao fragmento que vai do exon 2 ao 4 destes genes, foram detectadas na amostra de galinhas caipiras brasileiras de ovos azuis. Dez seqüências foram similares as já descritas para aves comerciais mas 16 foram inéditas. Este resultado demonstra uma grande variabilidade, a maioria da qual ainda não detectada, apresentada por estes genes nestas aves. Em alguns animais foram amplificados os dois genes B-F (B-FI e B-FIV) mas em outros, aparentemente, apenas um deles. Conclui-se que em algumas aves o fragmento analisado possa ser idêntico para os dois genes, e portanto a mesma seqüência para ambos esteja sendo detectada. Entretanto, é possível que alterações na seqüência alvo dos iniciadores utilizados possam impedir a amplificação de determinados alelos. 2. Foi observada a diferença de expressão apresentada pelos genes B-F na análise do cDNA de três animais que diferiram quanto ao número de seqüências de DNA amplificadas. (a) animal no. 169 (*CC1/*CC12): dos oito clones analisados, cinco foram *CC1 e três *CC12; (b) no. 125 (*CC7-1/*CC7-2/*CC13): 14 clones, 13 *CC7-1, um *CC13, nenhum *CC7-2; e (c) no. 132 (*CC3-1/*CC3-2/*CC4-1/*CC4-2): seis clones, três *CC3-1, três *CC4-1, nenhum *CC3-2 ou *CC4-2. A ausência de amplificação dos clones *CC3-2, *CC4-2 e *CC7-2 deve ter sido devida aos seus baixos níveis de expressão. O fato de que, dos 14 clones analisados do animal 125, 13 foram *CC7-1 sugere que, além da diferença de expressão entre os lócus B-F, pode haver também diferenças de expressão entre alelos B-F dentro de um mesmo lócus. 3. Trinta e nove diferentes seqüências de aminoácidos dos domínios 1 e 2 foram geradas a partir de 45 seqüências nucleotídicas (23 obtidas no presente trabalho e outras 22 retiradas da literatura). Três outras seqüências caipiras (*CC18, *CC19 e *CC20) determinadas posteriormente a esta análise, não foram incluídas na predição. Das 13 seqüências caipiras ainda inéditas utilizadas, dez condicionam diferenças na composição de aminoácidos quando comparadas com as já descritas. Estas são de particular interesse em futuras investigações de diferenças na resposta a patógenos. 4. Ao todo foram encontrados 15 alelos LEI0258, e o tamanho destes variou de 205 a 457 pb. Nove alelos mostraram-se presentes nas duas populações, e cada população apresentou três alelos específicos. Este grande polimorfismo habilita este microssatélite a ser utilizado como um bom marcador molecular para estudos futuros de variabilidade populacional, de paternidade e de endogamia, entre outros. 5. Foi observado um desequilíbrio de ligação total entre o lócus do microssatélite e os lócus B-F. Esta associação permite a tipagem parcial dos haplótipos B-F através deste microssatélite. Nos casos em que não se tem alelos deste microssatélite exclusivos para cada um dos haplótipos B-F, pode-se utilizá-los associados à técnica de PCR alelo-específico (PCR-SSP), pois a verificação da ocorrência de um alelo LEI0258 específico restringiria a determinação para dois ou três haplótipos B-F apenas, o que, de qualquer modo, é mais acessível do que o seqüenciamento. Esta associação também capacita os alelos LEI0258 a serem utilizados em programas de melhoramento genético de resistência a patógenos através da seleção assistida por marcadores, já que é mais fácil e rápido analisar uma população pelo método da PCR do que pelo do seqüenciamento. / Brazil has a distinguished position in the world of poultry business. This position is due to an activity involving a high degree of technological development, with emphasis in the advances in the area of genetics. Important production characteristics have been the focus of chicken breeders. However, in the area of disease resistance nothing, or very little, have been done. Recently the Brazilian poultry breeders turned to the investigation of this characteristic, and a series of rustic lines, the so-called “caipira” lines, had been developed. But these studies are based just in phenotypic traits, no consideration being given to their molecular genetic bases. The large majority of the diseases which attack chickens is of viral origin, the B-F (MHC class I-) genes being the main responsible for the development of the immune response to these agents. Therefore, more investigation on these genes is needed, to obtain a better knowledge of this viral immunity, thus making possible measures that would enhace such immunity. Investigations of this type had not been performed to date in Brazilian Caipira chicken. Of the techniques used to genotype the B-F genes, DNA sequencing is the only one that is 100% reliable; however, it is costly and demand much work. Easier and more cheap techniques, which would give significant results for this task, are naturally welcome. Recently a microsatellite (LEI0258) was described which is located in a region that is close to that of the B-F genes, and this microsatellite is being used with good results to genotype the B-F haplotypes; but again, no such studies had been performed in Brazilian Caipira chickens with this purpose. The objective of this work is to investigate the variability of the B-F genes through DNA sequencing, and to deduce the amino acid sequences which are coded by the alleles of these genes which are found in blue-egg Caipira Brazilian chicken. Concomitantly the polymorphism of the LEI0258 microsatellite was investigated in two populations of such animals (blue-egg Caipira chicken raised freely, and the Paraíso Pedrês Caipira line), as well as the relationship between the LEI0258 alleles with B-F alleles or haplotypes in the blue-egg Caipira sample. The results and conclusions found can be summarized as follows: 1. Twenty-six different DNA B-F nucleotide sequences were detected in the Brazilian blue-egg Caipira chickens. They correspond to a fragment located between exons 2 and 4 of these genes. Ten sequences were similar to those already described for commercial fowl, but 16 had not been described to date. This result indicates a large variability, the majority of which was undetected, for these genes in these birds. In some animals the two B-F (B-FI and B-FIV) genes had been amplified, but in others, apparently, just one. The inference is that in some birds the analyzed fragment could be the same for both genes, and that therefore the same sequence for both was being detected. However, it is possible that changes in the primers’ target sequences may prevent the amplification of certain alleles. 2. Expression differences in the B-F genes were observed in the cDNA analysis of these animals, which differed in the number of amplified DNA sequences. (a) Animal no. 169 (*CC1/*CC12): of the eight clones analyzed, five were *CC1 and three CC12; (b) no. 125 (*CC7-1/*CC7-2/*CC13): 14 clones, 13 *CC7-1, one *CC13, none *CC7-2; and (c) no. 132 (*CC3-1/*CC3-2/*CC4-1/*CC4-2): six clones, three *CC3-1, three *CC4-1, none *CC3-2 or *CC4-2. The absence of amplification of the *CC3-2, *CC4-2, and *CC7-2 clones can be due to their low expression levels. The fact that of the 14 clones recovered from animal 125 13 were *CC7-1 suggests that besides the B-F interloci expression differences, B-F intralocus differences may occur as well. 3. Thirty-nine different amino acid sequences from the 1 and 2 domains were generated from 23 nucleotide sequences obtained in the present work and 22 others reported in the literature. Three other Caipira sequences (*CC18, *CC19, and *CC20), determined after this analysis, were not included in it. Of the 13 new Caipira sequences used, ten condition amino acid differences in relation to those already described. They are, therefore, of special interest in future investigations related to responses to pathogens. 4. A total of 15 LEI0258 alleles were found, and their sizes varied from 205 to 457 bp. Nine alleles occurred in both populations while each population presented three specific alleles. This high degree of polymorphism determines that this microsatellite should be useful as a molecular marker in future studies of population variability, paternity, and inbreeding, among others. 5. A total linkage desequilibrium was found between the LEI0258 and B-F loci. This association allows partial typing of the B-F haplotypes through this microsatellite. In cases in which there is no microsatellite allele which is exclusive to a given B-F haplotype, the system can still be used associated to the allele-specific PCR (SSP-PCR) technique, since the establishment of the occurrence of a specific LEI0258 allele would restrict the determination to two or three B-F haplotypes only, simplifying the process in relation to sequencing. This association also allows the LEI0258 to be used in genetic breeding programs of pathogen-resistance based on markers assisted selection, since it would be easier and faster to analyze a population using PCR instead of sequencing methods.

Ctenomys flamarioni é um roedor subterrâneo endêmico do litoral do Estado do Rio Grande do Sul - Brasil. Devido à sua distribuição restrita ao ambiente costeiro, que está em constante mudança, e à fragmentação e destruição do habitat, devido à ação humana, essa espécie está nas listas de fauna ameaçadas de extinção. Estudos anteriores, com marcadores microssatélites e DNA mitocondrial, identificaram a baixa variabilidade genética na espécie, por outro lado, o estudo de loci que se esperam estar sob seleção seria uma ferramenta importante para identificar a relação dos indivíduos com o ambiente e os processos que moldaram a variabilidade genética da espécie ao longo da história. O Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) é composto por um grupo de genes estreitamente ligados que constituem o componente genético mais importante do sistema imunológico dos mamíferos. Dois principais mecanismos têm sido descritos como responsáveis pela manuntenção da diversidade do MHC e estão relacionados com o combate de parasitas e com mecanismos reprodutivos, que evitam o endocruzamento. Nesse estudo investigamos a variabilidade genética dos loci DRB e DQA do MHC e comparamos os índices de diversidades com os valores encontrados em estudos com outros ctenomídeos e com os encontrados para loci neutros da mesma espécie. A diversidade genética para o locus DRB de C. flamarioni foi menor do que a encontrada em estudos para o mesmo locus em outras espécies do gênero e também foi menor do que a encontrada em estudos para a mesma espécie, com marcadores neutros, inclusive para populações que passaram por reduções recentes (gargalos-de-garrafa). Os resultados indicam que a seleção balanceadora não foi suficiente para manter a diversidade genética nas populações estudadas e que as reduções populacionais, identificadas através dos loci neutros, devem ter sido bastante drásticas, por afetarem também a diversidade de um locus conhecidamente bastante variável (DRB de MHC). Não pudemos avaliar a diversidade do locus DQA devido a alta incidência de sequências muito divergentes encontradas, possivelmente pseudogenes. O estado de conservação de Ctenomys flamarioni é considerado crítico, por todos os fatores que afetam a espécie, como a instabilidade do ambiente em que ocorrem, a fragmentação e destruição do habitat pela ação humana e pela sua baixa diversidade genética, especialmente em um locus importante do sistema imunológico. A perda da diversidade no locus de MHC poderia estar relacionada à diminuição do número de indivíduos por população, que aumenta o risco de endogamia, que por sua vez pode levar à perda da aptidão reprodutiva, expressão de alelos recessivos deletérios e perda da flexibilidade adaptativa. Além disso, a perda da diversidade em um locus importante para a defesa do organismo contra parasitas aumenta a suscetibilidade dos indivíduos a doenças, e todos esses fatores elevam o risco de extinções locais, colocando em perigo o futuro da espécie. / Ctenomys flamarioni is a subterranean rodent, endemic to the coastline of the state of Rio Grande do Sul, Brazil. Due to its strict distribution to the coastal environment, which is constantly changing, and to habitat fragmentation and destruction caused by human actions, this species appears in lists of threatened fauna. Previous studies, using microsatellite markers and mitochondrial DNA, identified the low genetic variability in this species. On the other hand, the study of loci that are expected to be under balancing selection would be an important tool to identify the relation between individuals and their environment and processes which have molded the genetic variability of this species throughout history. The Major Histocompatibility Complex (MHC) is comprised by a closely connected group of genes that constitute the most important genetic component of the immune system of mammals. Two main mechanisms have been described as responsible for maintaining MHC diversity and are associated with parasite combat and reproductive mechanisms for inbreeding avoidance. In this study we investigated the genetic variability of the DRB and DQA loci of the MHC and compared these diversity indices with values found in studies about other ctenomyids and with values found for neutral loci in this species. The genetic diversity for the DRB locus in C. flamarioni was lower than what is found for the same locus in other species of the same genus and it was also lower than what was found in studies with this species using neutral markers, especially in populations which have gone through recent size reductions (bottlenecks). The results indicate that the balancing selection was not sufficient to maintain the genetic diversity in the studied populations and that population size reductions, identified through neutral loci, must have been very drastic, since they also affected the diversity of a loci which is known to be highly variable (DRB of the MHC). We could not evaluate the diversity for the DQA loci due to high incidence of very divergent sequences, possibly pseudogenes. The status of conservation of this species is considered critical due to all the factors that affect the species, such as the instability of the environment on which it occurs, habitat fragmentation and destruction caused by human actions, and its low genetic diversity, especially in an important locus of the immune system. The loss of diversity in the MHC locus could be associated to the decrease in number of individuals per population, which increases the risk of endogamy which, in turn, can lead to the loss of reproductive fitness, expression of deleterious recessive alleles and loss of adaptive flexibility. Moreover, the loss of diversity in a locus which is important in the defense of the organism against parasites increases the susceptibility of the individuals to diseases, and all these factors raise the risk of local extinctions, endangering the future of the species.