Submitted by Socorro Pontes (socorrop@ufersa.edu.br) on 2017-05-17T15:25:54Z No. of bitstreams: 1 GeysaAV_DISSERT.pdf: 1239894 bytes, checksum: 2f3521ddb1ad541e92c2704bcabe6b4e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-17T15:25:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GeysaAV_DISSERT.pdf: 1239894 bytes, checksum: 2f3521ddb1ad541e92c2704bcabe6b4e (MD5) Previous issue date: 2015-04-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Those from bee products have offered important contributions to human civilization and economy, and among the bee products bee venom is perhaps the most intriguing because of its healing properties. It consists of a complex mixture, and among its components the ones that stand out are melittin and phospholipase A2, which together represent about 75% of its dry weight. Melittin has significant therapeutic potential in the treatment of various diseases, in addition to being currently widely used in cosmetics as an aid in the retardation of aging. In this study, the bee venom samples of Apis mellifera bees obtained from the Rio Grande do Norte semiarid, were quantified as the total phenols and their biological activities in vitro were investigated, namely: antioxidant activity by the ability of the free radical scavenger (DPPH); antibacterial activity by diffusion in agar and antitumor activity by colorimetric MTT method. The content of total phenols obtained sample were 3.79 ± 0.3 mg / g and 0.37%, with high antioxidant capacity with a percentage of 92.59 ± 0.48%.. In relation to the antibacterial activity of bee venom Apis mellifera had a positive effect against the three strains tested being more active against Klebisiella pneumoniae bacterium, which was the most sensitive, and Staphylococcus aureus the most resistant. In relation to antitumor potential, bee venom showed significant cytotoxic activity against tumor cell lines HCT-116 (human colorectal carcinoma), HL-60 (human promyelocytic leukemia) and MDAMB435 (Melanoma), having a higher selectivity for the lines HCT-116 and HL-60. Finally, it was concluded that the bee Apis mellifera bee venom obtained in the semi-arid region may be used in non-conventional medicine as an antioxidant, antibacterial and cytotoxic agent. Key-words: bee venom, antioxidant, antibacterial, antitumor / Os produtos oriundos da colmeia têm oferecido importantes contribuições para a civilização humana e para economia, e dentre os produtos apícolas o veneno da abelha, também chamado de apitoxina, talvez seja o mais intrigante devido à suas propriedades curativas. Ele consiste em uma mistura bastante complexa, e dentre os seus componentes os que mais se destacam são a melitina e a fosfolipase A2, que representam juntas cerca de 75% do seu peso seco. A melitina apresenta potencial terapêutico significativo no tratamento de várias doenças, além de atualmente ser muito utilizada em cosméticos como auxiliar no retardo do envelhecimento. Nesse estudo, as amostras de apitoxina da abelha Apis mellifera obtidas no semiárido do Rio Grande do Norte, foram quantificada quanto ao teor de fenóis totais e suas atividades biológicas in vitro foram investigadas, a saber: atividade antioxidante através da capacidade sequestrante do radical livre (DPPH); atividade antibacteriana, através do método de difusão em ágar e atividade antitumoral, através do método colorimétrico MTT. O teor de fenóis totais obtidos da amostra foram de 3,79 ± 0,3 mg/g (0,37± 0,33 %), apresentando alta capacidade antioxidante com percentual de 92,59 ± 0,48 % . Em relação à atividade antibacteriana, a apitoxina da abelha Apis mellifera apresentou efeito positivo contra as três estirpes testadas, sendo mais ativa contra a bactéria Klebisiella pneumoniae que foi a mais sensível, e Staphylococcus aureus a mais resistente. Em relação ao seu potencial antitumoral, a apitoxina apresentou relevante atividade citotóxica contra as células de linhagens tumorais HCT-116 (Carcinoma de coloretal humano), HL-60 (Leucemia promielocítica humana) e MDA-MB435 (Melanoma), possuindo uma maior seletividade para as linhagens de HCT-116 e HL-60. Por fim, foi possível concluir que a apitoxina da abelha Apis mellifera obtida na região do semiárido pode ser utilizada na medicina não convencional como agente antioxidante, antibacteriano e citotóxico / 2017-05-17

Há muito tempo os venenos de abelhas se tornaram objeto de interesse de muitos cientistas, principalmente os venenos daquelas linhagens do gênero Apis, chamadas abelhas europeias e as conhecidas abelhas africanizadas. O foco no desenvolvimento de terapias eficazes que pudessem prevenir ou frear as reações desencadeadas pelas toxinas dos venenos desses insetos foi o principal estimulador do surgimento dessa grande área da pesquisa, uma vez que esses animais causam um grande número de acidentes em animais e seres humanos e os acidentes podem desencadear graves consequências, inclusive óbito. Sendo assim, desenvolvemos o presente trabalho baseado na caracterização da composição proteica dos venenos de abelhas europeias e africanizadas, na análise quantitativa diferencial entre os venenos e, na investigação de fosforilações e a possível relação das mesmas com as funções biológicas. Reunindo todos os elementos que estavam ao nosso alcance para compor o melhor conjunto de etapas para a realização do estudo proteômico de venenos de abelhas, nós atingimos todos os objetivos propostos. Utilizando uma abordagem baseada em espectrometria de massas, consistindo de análise shotgun seguida de LC-MS/MS realizada em um dos mais modernos espectrômetros de massas, nós fomos capazes de obter resultados extremamente confiáveis e interessantes. Comparando-se o efeito da extensão do gradiente de separação na cromatografia líquida, nós fomos capazes de atingir uma maior cobertura da amostra, uma vez que identificamos um maior número de proteínas após a utilização do gradiente mais longo. A identificação de fosforilações foi favorecida pela combinação de fragmentação por \"Colisão Induzida por Dissociação\" e medidas de massa de alta acurácia realizadas no instrumento LTQ-Orbitrap-Velos. Enquanto apenas 29 proteínas foram identificadas após 120 minutos de separação cromatográfica, um total de 51 proteínas foram identificadas aplicando-se gradiente mais longo. Dentre as 51 proteínas totais, 42 são comuns aos venenos das três abelhas. A comparação em pares mostrou que os venenos das abelhas europeias compartilham 44 proteínas e os venenos das abelhas africanizadas compartilham 43 proteínas tanto com o veneno de A. m. carnica quanto com o de A. m. ligustica. Além disso, nós revelamos que existem diferenças quantitativas entre algumas das proteínas dos venenos, sendo muitas dessas proteínas diferenciais toxinas com funções conhecidamente relevantes. A investigação de fosforilação mostrou que duas toxinas apresentam-se na forma fosforilada: melitina e icarapina. Melitina é considerada a principal toxina de venenos de abelhas, sendo bem conhecida por sua ação altamente tóxica e alergenicidade. Este peptídeo foi identificado com fosforilação ocorrendo no sítio Ser18 em todas as amostras de venenos, enquanto somente no veneno da abelha africanizada foi também identificado com sítio de fosforilação no resíduo de Thr10. Icarapina, também já descrita como um alérgeno do veneno, apresentou sítio de fosforilação no resíduo Ser205. Por fim, nós demonstramos o efeito da fosforilação presente em melitina (Ser18) realizando ensaios de atividade biológica do peptídeo fosforilado e nativo, como: hemólise, lise celular e desgranulação de mastócitos e atividade quimiotáctica. Foi observado que a toxicidade do peptídeo fosforilado é reduzida em comparação ao do peptídeo nativo. Sendo assim, nós podemos concluir que a combinação de metodologias eficientes e a utilização de moderna instrumentação nos levou a resultados surpreendentes, os quais se somam a todo o conhecimento já existente acerca de venenos de abelhas / Honeybee venom toxins disturb the activity of critical cellular processes, triggering immunological, physiological, and neurological responses within victims. Studies on venom toxins have provided invaluable knowledge towards elucidating the molecular and functional details of their biological targets, yet there has been no report of a full proteome/phosphoproteome profile of honeybee venom. In this study, we focused on Apis mellifera honeybee venom characterization, including proteins identification, label-free quantitative analysis and phosphorylation identification. Making use of a MS-based proteomic approach, consisting on in-solution digestion followed by LC-MS/MS analysis, we were able to compare the effect of the liquid chromatography gradient length on the sample coverage, consequently, to identify a higher number of proteins using longer separation gradient of the tryptic peptides. Favorable identification of phosphorylations was achieved by the application of a long separation gradient combined with CID fragmentation and high accuracy mass measurement using an LTQ Orbitrap Velos. Here we report on the comparative shotgun proteomics study of the venoms of two Apis mellifera subspecies, A. m. carnica and A. m. ligustica, and the hybrid known as Africanized honey bee (AHB). We identified 51 proteins in total, with 42 of them being common among the three venoms, including many previously unidentified entries. Performing label-free quantification, we observed that few proteins were found with different relative amounts. Additionally, we revealed the phosphorylation of two proteins in all the samples, with two of them being HBV toxins/allergens: melittin and icarapin. Icarapin was identified as phosphorylated at 205Ser. Melittin was identified as phosphorylated at the 18Ser and 10Thr positions in all venoms, as well. Given these novel findings, we then chose to compare the toxicity of the phosphorylated/unphosphorylated forms of the major venom toxin, melittin, considering the most prominent phosphorylation event, the phosphorylated 18Ser position. We showed that the toxicity is in fact decreased when the peptide is phosphorylated. Based on a combination of efficient methodology and state-of-the-art instrumentation, delineated by our Shotgun-NanoESI-Long Gradient-LTQ Orbitrap Velos analysis, we achieved proteomic coverage far surpassing any previous report. Together, these discoveries pave the way for future phosphovenomic studies

Há muito tempo os venenos de abelhas se tornaram objeto de interesse de muitos cientistas, principalmente os venenos daquelas linhagens do gênero Apis, chamadas abelhas europeias e as conhecidas abelhas africanizadas. O foco no desenvolvimento de terapias eficazes que pudessem prevenir ou frear as reações desencadeadas pelas toxinas dos venenos desses insetos foi o principal estimulador do surgimento dessa grande área da pesquisa, uma vez que esses animais causam um grande número de acidentes em animais e seres humanos e os acidentes podem desencadear graves consequências, inclusive óbito. Sendo assim, desenvolvemos o presente trabalho baseado na caracterização da composição proteica dos venenos de abelhas europeias e africanizadas, na análise quantitativa diferencial entre os venenos e, na investigação de fosforilações e a possível relação das mesmas com as funções biológicas. Reunindo todos os elementos que estavam ao nosso alcance para compor o melhor conjunto de etapas para a realização do estudo proteômico de venenos de abelhas, nós atingimos todos os objetivos propostos. Utilizando uma abordagem baseada em espectrometria de massas, consistindo de análise shotgun seguida de LC-MS/MS realizada em um dos mais modernos espectrômetros de massas, nós fomos capazes de obter resultados extremamente confiáveis e interessantes. Comparando-se o efeito da extensão do gradiente de separação na cromatografia líquida, nós fomos capazes de atingir uma maior cobertura da amostra, uma vez que identificamos um maior número de proteínas após a utilização do gradiente mais longo. A identificação de fosforilações foi favorecida pela combinação de fragmentação por \"Colisão Induzida por Dissociação\" e medidas de massa de alta acurácia realizadas no instrumento LTQ-Orbitrap-Velos. Enquanto apenas 29 proteínas foram identificadas após 120 minutos de separação cromatográfica, um total de 51 proteínas foram identificadas aplicando-se gradiente mais longo. Dentre as 51 proteínas totais, 42 são comuns aos venenos das três abelhas. A comparação em pares mostrou que os venenos das abelhas europeias compartilham 44 proteínas e os venenos das abelhas africanizadas compartilham 43 proteínas tanto com o veneno de A. m. carnica quanto com o de A. m. ligustica. Além disso, nós revelamos que existem diferenças quantitativas entre algumas das proteínas dos venenos, sendo muitas dessas proteínas diferenciais toxinas com funções conhecidamente relevantes. A investigação de fosforilação mostrou que duas toxinas apresentam-se na forma fosforilada: melitina e icarapina. Melitina é considerada a principal toxina de venenos de abelhas, sendo bem conhecida por sua ação altamente tóxica e alergenicidade. Este peptídeo foi identificado com fosforilação ocorrendo no sítio Ser18 em todas as amostras de venenos, enquanto somente no veneno da abelha africanizada foi também identificado com sítio de fosforilação no resíduo de Thr10. Icarapina, também já descrita como um alérgeno do veneno, apresentou sítio de fosforilação no resíduo Ser205. Por fim, nós demonstramos o efeito da fosforilação presente em melitina (Ser18) realizando ensaios de atividade biológica do peptídeo fosforilado e nativo, como: hemólise, lise celular e desgranulação de mastócitos e atividade quimiotáctica. Foi observado que a toxicidade do peptídeo fosforilado é reduzida em comparação ao do peptídeo nativo. Sendo assim, nós podemos concluir que a combinação de metodologias eficientes e a utilização de moderna instrumentação nos levou a resultados surpreendentes, os quais se somam a todo o conhecimento já existente acerca de venenos de abelhas / Honeybee venom toxins disturb the activity of critical cellular processes, triggering immunological, physiological, and neurological responses within victims. Studies on venom toxins have provided invaluable knowledge towards elucidating the molecular and functional details of their biological targets, yet there has been no report of a full proteome/phosphoproteome profile of honeybee venom. In this study, we focused on Apis mellifera honeybee venom characterization, including proteins identification, label-free quantitative analysis and phosphorylation identification. Making use of a MS-based proteomic approach, consisting on in-solution digestion followed by LC-MS/MS analysis, we were able to compare the effect of the liquid chromatography gradient length on the sample coverage, consequently, to identify a higher number of proteins using longer separation gradient of the tryptic peptides. Favorable identification of phosphorylations was achieved by the application of a long separation gradient combined with CID fragmentation and high accuracy mass measurement using an LTQ Orbitrap Velos. Here we report on the comparative shotgun proteomics study of the venoms of two Apis mellifera subspecies, A. m. carnica and A. m. ligustica, and the hybrid known as Africanized honey bee (AHB). We identified 51 proteins in total, with 42 of them being common among the three venoms, including many previously unidentified entries. Performing label-free quantification, we observed that few proteins were found with different relative amounts. Additionally, we revealed the phosphorylation of two proteins in all the samples, with two of them being HBV toxins/allergens: melittin and icarapin. Icarapin was identified as phosphorylated at 205Ser. Melittin was identified as phosphorylated at the 18Ser and 10Thr positions in all venoms, as well. Given these novel findings, we then chose to compare the toxicity of the phosphorylated/unphosphorylated forms of the major venom toxin, melittin, considering the most prominent phosphorylation event, the phosphorylated 18Ser position. We showed that the toxicity is in fact decreased when the peptide is phosphorylated. Based on a combination of efficient methodology and state-of-the-art instrumentation, delineated by our Shotgun-NanoESI-Long Gradient-LTQ Orbitrap Velos analysis, we achieved proteomic coverage far surpassing any previous report. Together, these discoveries pave the way for future phosphovenomic studies

Submitted by Johnny Rodrigues (johnnyrodrigues@ufcg.edu.br) on 2018-04-25T14:31:12Z No. of bitstreams: 1 ALLYSSON FORTUNATO DE ABRANTES - DISSERTAÇÃO PPGSA 2015..pdf: 1275565 bytes, checksum: 5e0019b5b460441a322e5e237b8eac1c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-25T14:31:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ALLYSSON FORTUNATO DE ABRANTES - DISSERTAÇÃO PPGSA 2015..pdf: 1275565 bytes, checksum: 5e0019b5b460441a322e5e237b8eac1c (MD5) Previous issue date: 2015 / O veneno da abelha, a apitoxina, consiste de uma mistura complexa de compostos nitrogenados, constando de uma maior parte proteica(Melitina) e menor fração por: Apamina, adolapina, fosfolipase A2, hialuronidase e peptídeos MCD. Trata-se de um líquido transparente, com odor característico, amargo e que apresenta pH básico (4,5 a 5,5), usado pelas abelhas como elemento de defesa e que seca facilmente em temperatura ambiente. A Melitina é o componente predominante no veneno apresentando, aproximadamente, 50 % da matéria seca, trata-se de uma proteína de elevado potencial anti-inflamatório, sendo considerada o principal agente da apitoxina na terapia da artrite reumática. Junto com a apamina, a melitina estimula os sistemas adrenal e pituitário a produzirem cortisol e outros esteroides naturais, que tem relevante papel na terapia da artrite, bem como na indústria cosmecêutica. A apitoxina foi coletada no apiário El-Shaday, Assentamento Rosário, Agrovila Canudos do município de Ceará-Mirim/RN, a coleta da amostra se deu utilizando o método de choques elétricos através de eletrodos de aço inox conectados a uma bateria e lâminas de vidro posicionado no alvado da colmeia que retêm a apitoxina após a picada da abelha. O apiário produz dois tipos de apitoxina, classificada como tipo 01, pura, e tipo 02, beneficiada. Foram realizados testes de citotoxicidade, quantificação proteica e eletroforese, em ambas as amostras, a fim de avaliá-las e comparar os dois tipos de apitoxina.Na apitoxina 01 foi realizada a concentração inibitória mínima. As amostras também foram incorporadas em duas bases dermatológicas, Gel carbopol® e Emulsão aniônica para que fossem avaliadas a estabilidade Preliminar e Acelerada das formulações.A apitoxina tipo 01, apresentou 77,83% de proteínas, uma concentração inibitória mínima a partir de 1,0% e toxicidade de 962,60 µg/mL; Os testes na apitoxina 02 apresentaram um teor proteico de 51,87% e uma citotoxicidade 154,82 µg/mL resultados possivelmente afetados pela contaminação ainda presente neste tipo de amostra após o beneficiamento. A eletroforese demonstrou que a apitoxina apresenta o mesmo perfil proteico, independente do processo de extração. Porém, a apitoxina tipo 02, aponta a diferença de uma unidade que não se revelou neste produto. As formulações mantiveram-se estáveis durante todo período de avaliação de sua estabilidade, 90 dias, onde foram avaliados pH, viscosidade, caracteres organolépticos, espalhabilidade, nas três diferentes condições de armazenamento: temperatura ambiente, 5 °C e 40 °C, exceção feita à emulsão aniônica conservada à 40 °C em que perdeu estabilidade a partir do trigésimo dia. / The bee venom, the apitoxin, is a complex mixture of nitrogenous compounds, having largely represented by melittin protein and a smaller fraction consisting of: Apamin, adolapina, phospholipase A2, hyaluronidase and peptides MCD. It is a transparent liquid, with characteristic odour, bitter and that presents basic pH (4.5 to 5.5), used by bees as a defense and that dry easily at room temperature. The Melittin is the predominant component in poison showing approximately 50% of the dry matter, it is a high protein anti-inflammatory potential, being considered the main agent of apitoxin on rheumatic arthritis therapy. Along with the apamin, melittin stimulates the adrenal and pituitary systems to produce cortisol and other steroids, which has important role in arthritis therapy, as well as in the cosmeceutical industry. The apitoxin was collected in the Apiary El-Shaday, Settlement, Agrovila Straws of municipality of Ceara – Mirin/ RN. sample collection occurred using the method of electric shocks through electrodes of stainless steel connected to a battery and glass blades positioned at the hive entrance of the hive that retain the apitoxin after bee sting. The Apiary produces two types of apitoxin, classified as type 01, pure, and type 02 milled. Cytotoxicity tests were performed, and protein quantification in both samples in order to evaluate them and compare the two types of apitoxin, on 01 was still held the apitoxin minimum inhibitory concentration. The samples were also incorporated into two bases, carbopol Gel ® skin and anionic emulsion for primary and Accelerated stability evaluated formulations. The apitoxin type 01, 77.83% protein, introduced a minimum inhibitory concentration from 1% and toxicity of 962.60 µ g/mL; Tests on apitoxin 02 presented a protein content of 51.87% and a cytotoxicity 154.82 µ/mL results possibly affected by the contamination still present in this sample type after the processing. Electrophoresis showed that apitoxin features the same protein profile, regardless of the extraction process. However, the apitoxin 02 type, presents the difference in a unit that didn't report revealed in this product. The wording remained stable throughout assessment period of its stability, 90 days, where they were evaluated pH, viscosity, organoleptic characters, spreadability, in three different storage conditions: room temperature 5° C and 40° C, except the anionic emulsion stored at 40° C that lost stability from the 30th day.