Darmstadt, Techn. Univ., Diss., 2004. / Dateien im PDF-Format

Proefschrift Universiteit Maastricht. / Met lit. opg. - Met een samenvatting in het Nederlands.

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative causée par la mutation du gène codant la protéine huntingtine (HTT). Cette protéine, exprimée par toutes les cellules de l'organisme, peut adopter une forme mutée qui lui confère un aspect toxique. Dans les cellules, la mHTT va s'agréger et former di érentes structures dont des agrégats, marqueurs distinctifs de la maladie, ou des brilles. Dans le cerveau, la présence de la mHTT va causer une mort neuronale dramatique entraînant, à l'échelle de l'individu, une panoplie de troubles moteurs, cognitifs et psychiatriques. Depuis plusieurs années des études tendent à démontrent que la mHTT peut se propager de cellules à cellules et corrompre la HTT non mutée tel un prion. Pour mon projet de recherche, j'ai ainsi investigué les propriétés prioniques de la mHTT sous sa forme fibrillaire particulièrement toxique. Des fibrilles synthétiques contenant la mutation pathologique ont été utilisées pour infecter des cellules en culture et des souris. De cette manière, nous avons démontré la capacité des fibrilles à se propager et à provoquer des dommages divers dans 3 types de cellules humaines. La présence des fibrilles a également induit l'agrégation de la forme non mutée de la HTT endogène, normalement présente dans les cellules. Chez la souris, ces résultats ont été confirmés suite à l'injection des fibrilles dans le cerveau des animaux. La présence des fibrilles dans le système nerveux central des souris sauvages a provoqué la manifestation de signes caractéristiques de la MH (troubles cognitifs et moteurs). De plus, une apparition de déficits moteurs et cognitifs qui s'apparentent à la maladie a été observée chez des souris R6/2, modèle transgénique de la MH, suite à l'injection des fibrilles. Les résultats de mon projet de recherche renforcent ainsi l'hypothèse prionique de la mHTT et appuient l'hypothèse que ces propriétés pourraient être impliquées dans la physiopathologie de la MH.

Samples of different varieties grapevine from Małopolska and Podkarpacie collected on spring 2016 were tested for Grapevine Pinot gris virus (GPGV) by RT-PCR. 16 out of 65 plants were found positive for GPGV. Two set of primers were used for detection, targeting partial movement protein and coat protein, and RdRp domain, both of those regions were sequenced. Phylogenetic analyses settled the Polish isolates to described before asymptotic group. Also GPGV positive samples were tested by multiplex and simplex RT- PCR for multiple infections, and 18,5% of all samples were GPGV and GFkV positive. This was first survey of GPGV in Poland.

Le contrôle des agents pathogènes viraux en agriculture constitue une préoccupation majeure pour les producteurs, tant pour l’impact économique négatif que les épidémies infligent que pour la santé des travailleurs et des animaux d’élevage. Les mesures de biosécurité renforcée restent à ce jour inefficaces à enrayer la dissémination des virus, ceux-ci pouvant être propagés par l’air. Il est connu que l’air intérieur des bâtiments d’élevage confiné contient une importante concentration de bioaérosols variés ayant le potentiel d’être dispersés aux sites voisins par les systèmes de ventilation. En conséquence, il s’avère urgent de développer des méthodes pour faciliter la détection précoce des virus dans l’air des bâtiments qui soient efficaces, simples, écologiques et sécuritaires pour les animaux. Une collaboration avec un groupe d’ingénieurs agricoles fut établie afin d’élaborer un outil visant l’amélioration des stratégies d’échantillonnage de l’air dans les bâtiments mécaniquement ventilés. Brièvement, il fut suggéré que la co-nébulisation d’une solution fluorescente (NSF/ANSI 60) et d’un bactériophage modèle pourrait démontrer la faisabilité de l’identification d’une zone stratégique dans l’espace intérieur pour l’échantillonnage des agents pathogènes viraux aérosolisés. La détermination d’une telle zone pourrait favoriser leur détection précoce et la prévention de leur propagation au sein du cheptel. Le comportement des aérosols viraux fut également étudié in vitro en présence de poussières standardisées pour tenter de déterminer si le contenu particulaire de l’air influence la taille des particules virales et si une taille préférentielle peut leur être attribuée. Ces informations supplémentaires pourraient éclairer la prise de décisions, faciliter la planification de systèmes de filtration pour les aérosols viraux et influencer le développement de méthodes de capture alternatives. / Dissemination of viral pathogens via airborne particles is a known phenomenon. In agriculture, indoor air of livestock confinement buildings contains a high concentration of bioaerosols that may be dispersed to neighbouring sites through ventilation systems. Control of pathogenic viruses remains to this day a major concern for the health of agricultural workers and animals, as well as for the significant negative economic impact that epidemics inflict on the industries. The development of methods for virus detection in the air of agricultural buildings that are simple, reliable, ecologically sound, and without risk for animal health is urgent. We collaborated with a group of agricultural engineers to tackle this problem. A 55 m3 mechanically ventilated experimental confinement building was used to improve air sampling strategies by assessing the spatial concentration variations of an artificially nebulized virus and a fluorescent marker. We have ascertained that it is feasible to determine the most probable areas where viral particles are more likely to stay in suspension and be detected, simply by nebulizing a fluorescent solution of varying particles sizes. In the near future, molecular diagnostic tests will be available to the agricultural industry. Simply nebulizing a fluorescent solution could lead to the determination of the most suitable areas to use these molecular devices. Viral aerosols behaviour was also studied in vitro in conjunction with standardized dusts to determine if the nature of the particles in the air influenced viral particles size and if a preferential particle size could be observed. This additional information could provide insights to help decision making towards filtration systems and influence the development of alternative methods for viral aerosols capture.

Bovine Leukemia Virus (BLV) latency is a viral strategy used to escape from the host immune system and contribute to tumor development. However, the recent discovery of a highly expressed miRNA cluster has suggested that BLV latency is partially true. In our PhD thesis, we studied the epigenetic and transcriptional regulations of this RNA polymerase III (RNAPIII)- dependent miRNA cluster and of a newly discovered RNA polymerase II (RNAPII)-dependent promoter (which drives an active antisense transcription). Moreover, our data suggested a putative collision phenomenon between RNAPII and RNAPIII convergent transcriptions. In the second part of our PhD thesis, we therefore provided new insights into this complex transcriptional network. In the third part of this work, we demonstrated the recruitment of CTCF, a multi-functional transcriptional regulator, along the BLV genome and provided data explaining its putative functions in BLV transcriptional and epigenetic regulations but also in viral-host genome long-range interactions. In conclusion, our PhD thesis provides a better understanding of the transcriptional network regulating BLV gene expression and new ideas to study BLV-induced leukemia development. La latence virale, principale caractéristique de l’infection par le virus de la leucémie bovine (BLV), permet au virus d’échapper au système immunitaire de l’hôte et contribue au développement tumoral. Cependant, la récente découverte d’une région codant pour des miRNAs viraux et activement transcrite par l’ARN polymérase III (RNAPIII), suggère que la latence virale n’est que partiellement vraie. Dans cette thèse, nous avons étudié les régulations transcriptionnelle et épigénétique du promoteur RNAPIII-dépendant contrôlant l’expression des miRNAs du BLV, ainsi que celles d’un nouveau promoteur ARN polymérase II (RNAPII)-dépendant, découvert au cours de notre travail de thèse. Suite à nos données, suggérant de l’interférence transcriptionnelle, nous avons ensuite étudié le fonctionnement de ce réseau transcriptionnel complexe composé de trois promoteurs distincts régulant l’expression du BLV. Finalement, nous avons démontré le recrutement de CTCF, un régulateur transcriptionnel multifonctionnel, le long du génome du BLV et nos résultats suggèrent des potentielles fonctions de CTCF dans les régulations transcriptionnelle et épigénétique du BLV, mais également dans des interactions longue-distances entre le virus et le génome de la cellule hôte. En conclusion, notre thèse de doctorat apporte une meilleure compréhension du réseau transcriptionnel régulant l’expression génique du BLV et offre de nouvelles pistes pour l’étude du développement tumoral induit par le BLV. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Here we review viral and cellular requirements for entry and intracellular trafficking of foamy viruses (FVs) resulting in integration of viral sequences into the host cell genome. The virus encoded glycoprotein harbors all essential viral determinants, which are involved in absorption to the host membrane and triggering the uptake of virus particles. However, only recently light was shed on some details of FV’s interaction with its host cell receptor(s). Latest studies indicate glycosaminoglycans of cellular proteoglycans, particularly heparan sulfate, to be of utmost importance. In a species-specific manner FVs encounter endogenous machineries of the target cell, which are in some cases exploited for fusion and further egress into the cytosol. Mostly triggered by pH-dependent endocytosis, viral and cellular membranes fuse and release naked FV capsids into the cytoplasm. Intact FV capsids are then shuttled along microtubules and are found to accumulate nearby the centrosome where they can remain in a latent state for extended time periods. Depending on the host cell cycle status, FV capsids finally disassemble and, by still poorly characterized mechanisms, the preintegration complex gets access to the host cell chromatin. Host cell mitosis finally allows for viral genome integration, ultimately starting a new round of viral replication.

Environ 350 millions de personnes dans le monde sont infectées par le virus de l’hépatite B (VHB), dont un million meurent chaque année des conséquences d’une infection VHB chronique. Cette chronicité implique la capacité du VHB de moduler l’apoptose. Dans le cadre du projet présent, l’influence de la capside du VHB sur l’apoptose au niveau du clivage de la Nucléoporine153 (Nup153) par la caspase 3 et l’influence de la protéine core en général sur l’apoptose ont été analysées. Pour répondre à l’effet de la capside sur le clivage de la Nup153 par la caspase 3, des systèmes analytiques in vitro et in vivo ont pu être mis en place. Après avoir purifié la GST-Nup153, l’impact de la capside du VHB sur son clivage a été analysé. Il a été constaté que la capside du VHB n’avait pas d’influence sur le clivage de la Nup153. Ce résultat a été confirmé par le système in vivo qui consistait en des cellules HeLa perméabilisées par la digitonine dans lesquelles la Nup153 a été également clivée en présence ou absence de la capside du VHB. Pour accrocher la capside à la Nup153, des essais de transport ont été réalisés avant le clivage par la caspase 3 recombinante. Dans la deuxième partie, l’influence de la protéine core du VHB sur l’apoptose induite par le récepteur Fas a été étudiée. Des cellules HepG2 ont été transfectées soit avec un vecteur codant pour la construction GFP-core, soit avec le vecteur de contrôle codant pour la GFP sans fusion. Après induction de l’apoptose par le ligand IgFasL, l’apoptose a été mesurée soit par l’analyse de l’activité de la caspase 3, soit par réduction du signal GFP. Les cellules contenant la GFP-core démontraient un taux apoptotique fortement réduit, comparées aux cellules transfectées avec la GFP, indiquant une fonction anti-apoptotique de la protéine core du VHB. / Around 350 million people worlwide are infected with the hepatitis B virus (HBV) and one million of people per year die because of the consequences of a chronic HBV-infection. The capacity of the HBV to become chronic suggests that this virus is capable to modulate the apoptosis. In the context of the present project, the influence of the HBV-capsid on the cleavage of the Nucleoporin153 (Nup153) by the caspase 3 and the influence of the HBV-core protein on the apoptosis in general have been investigated. In order to address the effect of the capsid on the cleavage of the Nup153 by the caspase 3, in vitro and an in vivo analytical systems have been developed. After the purification of the GST-Nup153, the impact of the HBV-capsid on his cleavage has been analyzed. It has been observed, that the HBV-capsid has no effect on the cleavage of the Nup153. This result has been confirmed by the in vivo system which has been represented by digitonin-permeabilized HeLa cells, in which the Nup153 has also been cleaved in presence or absence of the HBV-capsid. In order to attach the capsids on the Nup153, nuclear transport assays have been realized before the cleavage with the recombinant caspase 3. In the second part, the influence of the hepatitis core protein on the Fas induced apoptosis has been investigated. HepG2 cells have been transfected either with a vector coding for the construction GFP-core or with a control vector coding for the GFP-protein without any fusion. After induction of apoptosis by the ligand IgFasL, the apoptosis has been measured by the analysis of the caspase 3 activity and by the decreasing of the GFP signal. Cells containing GFP-core showed a strong decreasing regarding the amount of apoptosis compared to the cells transfected with GFP. This result suggests an anti-apoptotic function of the core protein of the HBV.

La diarrhée épidémique porcine (DEP) est apparue en Europe à la fin des années 1970 et est causée par un alpha-coronavirus appelé virus de la diarrhée épidémique porcine (PEDV). Des épizooties sévères ont été rapportées en Asie à partir de 2010 et en Amérique à partir de 2013. Deux génotypes de souches de PEDV, se différenciant par des insertions/délétions dans le gène S, ont été isolés et circulent toujours actuellement dans ces régions. Ils regroupent d’une part les souches « S-InDel » présentes sur tous les continents, notamment en Europe y compris la France, et d’autre part les souches « S-non-InDel » hautement virulentes qui circulent en Asie et sur le continent américain uniquement. Les porcs infectés par le PEDV sont sujets à d’importantes diarrhées aqueuses ainsi qu’à des vomissements parfois accompagnés de signes de déshydratation. Les conséquences de la maladie sont d’autant plus importantes en cas d’infection par une souche « S-non-InDel » avec une mortalité pouvant atteindrLa pathogénicité comparée de deux souches de PEDV a été étudiée dans le cadre de cette thèse : une souche « S-non-InDel » isolée aux Etats-Unis en 2014 et une souche « S-InDel » isolée en France la même année. L’étude de la pathogénicité comparée a consisté à étudier les caractéristiques de transmission horizontale et les conséquences cliniques de l’infection en conditions expérimentales. En outre, l’excrétion dans la semence de ces deux souches a également été explorée. La dernière partie du projet de thèse était consacrée à l’étude des interactions du virus avec l’intestin ainsi que l’immu / Porcine epidemic diarrhea (PED) appeared in Europe at the end of 1970s and is caused by an alpha-coronavirus named porcine epidemic diarrhea virus (PEDV). Severe PED epizootic cases have been reported in Asia from 2010 and in America from 2013. Two genotypes of PEDV strains, differing by insertions/deletions in the S gene, have been described and circulating to date. The first genotype is represented by « S-InDel » strains group present on all continents among which Europe, including France. The second one is represented by the so-called highly virulent « S-non-InDel » strains which circulate in Asia and America only. The pigs infected by PEDV are affected by important aqueous diarrheas and sometimes vomiting accompanied by signs of dehydration. The consequences of the disease are more important in case of infection by an « S-non-InDel » strain with a mortality rate that could reach 100 % in suckling piglets.Uncertainties remained on pathogenicity differences according to the strains of PEDV and on impacts of a potential introduction of « S-non-InDel » PEDV strain in France. This thesis aimed at studying and comparing the pathogenicity of two strains of PEDV, an « S-non-InDel » PEDV strain isolated in the United-States in 2014 and an « S-InDel » PEDV strain isolated in France the same year. To compare pathogenicity between strains, the horizontal transmission and the clinical consequences of the infection in experimental conditions have been studied. Moreover the virus shedding in semen was also explored for the two strains. The last part of the project of the thesis was

HIV-1 infections can be treated but not cured by the current antiretroviral therapy regimens. One of the major barriers to HIV-1 eradication is the persistence of the virus in treated HIV+ individuals under the form of reservoirs. A continuum of molecular mechanisms, at the epigenetic, transcriptional and post-transcriptional levels maintains HIV-1 gene expression silent in its reservoirs. A better understanding of HIV-1 molecular mechanisms of persistence thus allows to devise novel therapeutic approaches to eradicate the virus. In this context, our thesis aimed at characterizing the molecular mechanisms of HIV-1 persistence in its T-lymphoid and myeloid reservoirs. More specifically, we have studied the epigenetic and transcriptional mechanisms of HIV-1 persistence at three different levels. First, we have investigated the DNA methylation-mediated mechanisms underlying the heterogeneity of the DNA methylation inhibitor 5-aza-2’-deoxycytidine potency in the reactivation of HIV-1 gene expression from latently-infected CD4+ T cells. Second, we have studied the contribution of the intragenic binding sites for the cellular PU.1 transcription factor in the specific regulation of HIV-1 gene expression in myeloid lineages. Finally, in a third study, we have designed a new tool to study the transcriptional landscape of HIV-1 in LTRs-suppressed proviruses. Collectively, our work has offered individual insights into the molecular mechanisms underlying the heterogeneity of HIV-1 T-lymphoid and myeloid reservoirs, with the ultimate goal of developing new HIV-1 curative strategies and improving the quality of life of HIV+ individuals. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished