Le virus Epstein-Barr (EBV) est un γ-Herpesvirus infectant plus de 95 % de la population mondiale. Le facteur de transcription viral ZEBRA est responsable de la transition entre phases latentes et lytiques du virus. ZEBRA est une protéine de la famille des protéines bZIP. Elle active les promoteurs des gènes lytiques de l'EBV en se fixant sur des sites ADN spécifiques appelés sites ZREs. ZEBRA fixe préférentiellement certains sites ZREs lorsqu'ils sont méthylés sur leurs motifs CpG et notamment le site cible ZRE2 du promoteur viral du gène précoce BRLF1. Cette capacité particulière est unique à ZEBRA parmi les autres membres de la famille bZIP et s'avère critique pour l'activation du cycle lytique étant donné que le génome de l'EBV est intensivement methylé durant la phase de latence. Nous avons résolu la structure cristallographique du domaine bZIP de ZEBRA en complexe avec le site ZRE2 méthylé. L'analyse structurale corrélée à une étude de mutagenèse et à la détermination des affinités de ZEBRA pour ses sites ADN cibles, nous permet de proposer une hypothèse quant au mécanisme de fixation préférentielle de l'ADN méthylé par le facteur de transcription ZEBRA. En parallèle, nous avons débuté un criblage à haut débit de composés chimiques pouvant inhiber la fixation à l'ADN de ZEBRA et par conséquent, l'induction du cycle lytique. Ce travail améliore considérablement notre compréhension du mécanisme d'induction du cycle lytique par ZEBRA et aidera potentiellement au développement de nouveaux agents thérapeutiques contre les pathologies associées à l'EBV.

La virologie bénéficie de plus en plus du développement de la bioinformatique. Mon projet de thèse recouvre la gestion de séquences de protéines se rapportant aux virus à ARN simple brin, de polarité négative et positive. J'ai mis en place une base de données VaZyMolO, qui gère les informations structurales et fonctionnelles des protéines, en définissant et en classant des modules. Cette approche a permis l'identification d'un domaine méthyltransférase sur la protéine L des Mononegavirales, et la définition de la modularité des protéines N et P des Paramyxoviridae. La cartographie du génome du virus du Syndrome Respiratoire Aigue Sévère réalisée à l'aide de VaZyMolO, a contribué à la résolution structurale de la protéine nsp9 de ce virus. Enfin, je présente une étude incluant évolution et analyse structurale des polymérases des Flaviviridae. Dans cette dernière, je propose un modèle de la polymérase du virus GBV-C et un mécanisme d'initiation de la synthèse d'ARN.

Réovirus, connu sous le nom REOLYSIN®, est présentement à l'étude à titre d'agent oncolytique. Or, la spécificité du virus pour les cellules cancéreuses pourrait être optimisée par une modification au niveau de la protéine d'attachement σ1. La présente étude vise à démontrer qu'une telle amélioration est possible par l'utilisation de la méthode nouvellement décrite de génétique inverse. Par cette technique, il est possible d'ajouter un polypeptide d'une longueur de quarante acides aminés à l'extrémité C-terminale de σ1. Il est aussi possible d'engendrer des virus mutés en leur site d'activité mucinolytique. Les virus nouvellement créés démontrent une efficacité de réplication diminuée, mais demeurent infectieux. Contrairement aux méthodes traditionnellement utilisées avec réovirus, la méthode de génétique inverse permet de conserver les mutations engendrées, par substitution ou addition, au cours des cycles de réplication. Une telle étude démontre qu'il serait possible de modifier le tropisme de réovirus. / Reovirus, also known under the tradename REOLYSIN®, is currently under clinical trial as an oncolytic agent. The specificity of the virus for transformed (cancerous) cells could be improved by modifications of the σ1 attachment protein. This study presents two ways to achieve this improvement by using a newly developed method of reverse genetics for double-stranded RNA viruses. As a proof of concept, we engineered the addition of an exogenous polypeptide of forty amino-acids to the C-terminal end of σ1. Subsequently, we created viruses with compromised mucinolytic activities by introducing amino-acids substitutions in the appropriate genetic sites. A decreased replicative efficacy was observed in all experimentally generated viruses, despite maintaining their infectious capacity. Reverse genetics allows the generation of viruses that retain their mutations throughout successive replicative cycles, which was impossible with traditionnal techniques. This project demonstrates the feasibility of tropism modification by using the reverse genetics method.

L’infection par le Virus Respiratoire Syncytial cause des affections pulmonaires aiguës en pédiatrie caractérisée par une réponse inflammatoire excessive médiée par la production de cytokines par les cellules épithéliales des voies aériennes. Les gènes codant pour ces cytokines sont régulés par le facteur de transcription NF-κB (p50/p65) dont l’activation est classiquement induite par la phosphorylation de son inhibiteur IκBα, ce qui permet l’accumulation de l’hétérodimère au noyau. Par contre, nous avons récemment identifié la phosphorylation en sérine 536 de la sous-unité p65 comme une autre étape essentielle à son activation lors de l’infection des AEC par RSV. Le travail présenté dans ce mémoire a permis de démontrer que l’inhibition de l’expression de RIG-I, de Cardif ou de TRAF6, 3 protéines impliquées dans la reconnaissance cellulaire des virus, conduit à l’inhibition de cette phosphorylation en réponse à RSV. Nous avons également établi à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques et d’ARNi que, parmi les diverses kinases connues pour phosphoryler p65 en réponse à divers stimulus, IKKα/β sont essentielles à cette phosphorylation lors d’une stimulation par RSV. Puisque TRAF6 est bien connu dans la littérature pour activer le complexe IKK, nous proposons que TRAF6, après reconnaissance de l’ARN viral de RSV par RIG-I, active le complexe IKK qui induit la phosphorylation de la sousunité p65 de NF-κB, permettant l’expression de gènes cibles. D’autre part, nous avions précédemment démontré que Nox2, un isoforme de NADPH oxydase, contrôle l’activation de NF-κB en régulant les phosphorylations de IκBα et p65. Nous montrons ici que l’inhibition de Nox2 réduit fortement l’activité du complexe kinase IKK. De plus, la présence au niveau basal de Nox2 est critique pour le niveau d’ARN messager de Cardif. Nous proposons donc que la régulation de la phosphorylation de p65 en ser536 par Nox2 soit via son effet sur Cardif en permettant la fonctionnalité de la voie RIG-I. / The infection by the Respiratory Syncytial Virus causes acute respiratory tract affections among children characterized by an excessive inflammatory response mediated by airway epithelial cells production of cytokines. The genes coding for theses cytokines are regulated by the transcription factor NF-κB (p50/p65) which is classically activated by phosphorylation of its inhibitor IκBα, permitting the nuclear accumulation of the heterodimer. The work presented in this master’s thesis allowed demonstrating that the inhibition of either RIG-I, Cardif or TRAF6, 3 proteins implicated in the cellular recognition of virus, leads to the inhibition of this phosphorylation in response to RSV. Moreover, we established with pharmacological inhibitors and siRNA that, among all kinases known to phosphorylate p65 in response to various stimulus, IKKα/β are essential to this phosphorylation in RSV stimulation. Since TRAF6 is a well-known IKK complex activator in the literature, we propose that TRAF6, after the recognition of the RSV viral RNA by RIG-I, activates the IKK complex witch induces the phosphorylation of the NF-κB subunit p65, allowing the expression of targets genes. Furthermore, we had previously demonstrated that Nox2, a NADPH oxydase isoform, controls the activation of NF-κB by regulating the phosphorylation of IκBα and p65. We show here that the inhibition of Nox2 by siRNA reduces strongly the activity of the IKK complex. Moreover, the basal level presence of Nox2 is critic for the messenger RNA level of Cardif. Thus, we propose that the Nox2 regulation of p65 ser536 is done by its effect on Cardif, which allows the integrity of the RIG-I pathway.

La prolifération, la différenciation ainsi que les fonctions des cellules du système immunitaire sont contrôlées en partie par les cytokines. Lors de l’infection par le VIH-1, les défauts observés dans les fonctions, la maintenance, ainsi que la consistance des cellules du système immunitaire sont en large partie attribués à une production altérée des cytokines et à un manque d’efficacité au niveau de leurs effets biologiques. Durant ces études, nous nous sommes intéréssés à la régulation et aux fonctions de deux cytokines qui sont l’IL-18 et l’IL-21. Nous avons observé une corrélation inversée significative entre les concentrations sériques d’IL-18 et le nombre des cellules NK chez les patients infectés par le VIH-1. Nos expériences in vitro ont démontré que cette cytokine induit l’apoptose des cellules NK primaires et que cette mort peut être inhibée par des anticorps neutralisants spécifiques pour FasL et TNF-α. Cette mort cellulaire est due à l’expression de FasL sur les cellules NK et à la production de TNF-α par ces cellules. L’IL-18 augmente aussi la susceptibilité à la mort des cellules NK par un stimulus pro-apoptotique, en diminuant l’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-XL. Nous démontrons aussi que, contrairement à l’IL-18, les niveaux d’IL-18BP sont plus faibles dans les sérum de patients infectés. Ceci résulte sur une production non coordonnée de ces deux facteurs, aboutissant à des niveaux élevés d’IL-18 libre et biologiquement active chez les patients infectés. L’infection de macrophages in vitro induit la production d’IL-18 et réduit celle d’IL-18BP. De plus, l’IL-10 et le TGF-β, dont les concentrations sont élevées chez les patients infectés, réduisent la production d’IL-18BP par les macrophages in vitro. Finalement, nous démontrons que l’IL-18 augmente la réplication du VIH-1 dans les lymphocytes T CD4+ infectés. Les niveaux élevés d’IL-18 libres et biologiquement actives chez les patients infectés contribuent donc à l’immuno-pathogénèse induite par le VIH-1 en perturbant l’homéostasie des cellules NK ainsi qu’en augmentant la réplication du virus chez les patients. Ces études suggèrent donc la neutralisation des effets néfastes de l’IL-18 en utilisant son inhibiteur naturel soit de l’IL-18BP exogène. Ceci permettrait de moduler l’activité de l’IL-18 in vivo à des niveaux souhaitables. L’IL-21 joue un rôle clef dans le contrôle des infections virales chroniques. Lors de ces études, nous avons déterminé la dynamique de la production d’IL-21 lors de l’infection par le VIH-1 et sa conséquence sur la survie des cellules T CD4+ et la fréquence des cellules T CD8+ spécifiques au VIH-1. Nous avons démontré que sa production est compromise tôt au cours de l’infection et que les concentrations d’IL-21 corrèlent avec le compte de cellules T CD4+ chez les personnes infectées. Nos études ont démontré que le traitement antirétroviral restaure partiellement la production d’IL-21. De plus, l’infection par le VIH-1 de cellules T CD4+ humaines inhibe sa production en réduisant l’expression du facteur de transcription c-Maf. Nous avons aussi démontré que la fréquence des cellules T CD4+ spécifiques au VIH-1 qui produisent de l’IL-21 est réduite chez les patients virémiques. Selon nos résultats, l’IL-21 empêche l’apoptose spontanée des cellules T CD4+ de patients infectés et l’absence d’IL-21 réduit la fréquence des cellules T CD8+ spécifiques au VIH-1 chez ces patients. Nos résultats démontrent que l'IL-21R est exprimé de façon égale sur tous les sous-types de cellules NK chez les donneurs sains et chez les patients infectés. L’IL-21 active les protéines STAT-3, MAPK et Akt afin d'augmenter les fonctions effectrices des cellules NK. L'activation de STAT-3 joue un rôle clef dans ces fonctions avec ou sans un traitement avec de l'IL-21. L'IL-21 augmente l'expression des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Bcl-XL, augmente la viabilité des cellules NK, mais ne possède aucun effet sur leur prolifération. Nous démontrons de plus que l'IL-21 augmente l'ADCC, les fonctions sécrétrices et cytotoxiques ainsi que la viabilité des cellules NK provenant de patients chroniquement infectés par le VIH-1. De plus, cette cytokine semble présenter ces effets sans augmenter en contrepartie la réplication du VIH-1. Elle permet donc d'inhiber la réplication virale lors de co-cultures autologues de cellules NK avec des cellules T CD4+ infectées d'une manière dépendante à l'expression de perforine et à l'utilisation de la protéine LFA-1. Les niveaux d’IL-21 pourraient donc servir de marqueurs biologiques pour accompagner les informations sur le taux de cellules T CD4+ circulantes en nous donnant des informations sur l’état de fonctionnalité de ce compartiment cellulaire. De plus, ces résultats suggèrent l’utilisation de cette cytokine en tant qu’agent immunothérapeutique pour restaurer les niveaux normaux d’IL-21 et augmenter la réponse antivirale chez les patients infectés par le VIH-1. / The proliferation, differentiation, function and maintenance of immune cells is controlled in large part by cytokines. HIV-induced dysfunctions of the antiviral immunity is in part related to defects in the cytokine network, as manifested by altered cytokine secretion and responsiveness to these cytokines. In these studies, we investigated the regulation and the functions of two cytokines, IL-18 and IL-21, during HIV-1 infection. In our studies, we observed an inverse correlation between IL-18 concentrations and absolute numbers of various subsets of NK cells in infected persons. IL-18 caused increased death of a human NK cell line, as well as of primary human NK cells in vitro. The IL-18-mediated cell death was dependent upon Fas-FasL interactions and TNF- secretion. IL-18 induced the expression of TNF-, induced the expression of FasL on NK cells, increased the transcription from the human FasL promoter, reduced the expression of Bcl-XL in NK cells, and increased their sensitivity to FasL-mediated cell death. In contrast to IL-18 levels, IL-18BP levels decreased in the serum of HIV-infected patients. This decrease resulted in enhanced levels of free IL-18 in the serum of such patients. The infection increased production of IL-18 but decreased that of IL-18BP in monocyte-derived macrophages (MDM). Furthermore, IL-10 and TGF-β, two cytokines for which concentrations are increased in HIV-infected persons, also decreased production of IL-18BP by human MDM. Finally, recombinant human IL-18 enhanced HIV-1 replication in human CD4+ T cells. The uncoordinated production of these two cytokines represents an imbalance between these two soluble factors in HIV-infected patients. Our study shows that enhanced IL-18 bioactivity in HIV-infected patients may contribute to the pathogenesis of AIDS by disrupting NK cell homoeostasis and increasing viral replication. This uncoordinated production of IL-18 and IL-18BP contribute to IL-18-induced immunopathology and pathogenesis in HIV-infected AIDS patients. Therefore, these studies suggest that the neutralization of IL-18 may represent an appropriate and useful immunotherapeutic strategy in these patients. It may delay AIDS progression and improve the immune status of infected persons. The best way to achieve this goal may be using exogenous interleukin-18 binding protein. IL-21 is a relatively newly discovered immune enhancing cytokine, which plays an essential role in controlling chronic viral infections. Therefore, we sought to determine the dynamics of the cytokine production and its potential consequences on the viability of CD4+ T cells in HIV-infected persons. We show here that the cytokine production is compromised early in the course of the infection. The serum cytokine concentrations correlated with CD4+ T cell counts in the infected persons. Among different groups of HIV-infected persons, only Elite Controllers maintain normal production of the cytokine. The HAART partially restores production of this cytokine. Interestingly, HIV-1 infection of human PBMC as well as of purified CD4+ T cells inhibits the production of the cytokine by decreasing the expression of c-Maf, a transcription factor involved in the activation of the cytokine gene, in the virus-infected cells but not in uninfected bystander cells. We also show that the frequencies of IL-21 producing HIV-specific antigen experienced CD4+ T cells are decreased in HIV-infected viremic patients. Furthermore, we show that recombinant human IL-21 acts as pro-survival factor and prevents enhanced spontaneous apoptosis of ex vivo cultured CD4+ T cells from HIV-infected patients and that increased serum levels of the cytokine are associated with higher frequencies as well as with better functions of HIV-specific CTL in HIV-infected individuals. We show that the cytokine receptors are expressed equally on all NK cell subsets. We demonstrate that the cytokine activates STAT-3, MAPK and Akt to enhance NK cell functions. IL-21 increases expression of anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-XL, and enhances viability of NK cells, but has no effect on their proliferation. We further show that the cytokine enhances HIV-specific ADCC, secretory and cytotoxic functions as well as viability of NK cells from HIV-infected persons. Furthermore, it exerts its biological effects on NK cells with minimal enhancement of HIV-1 replication, and the cytokine-activated NK cells inhibit viral replication in co-cultured HIV-infected autologous CD4+ T cells in a perforin- and LFA-1-dependent manner. These studies suggest that serum IL-21 concentrations may serve as useful biomarker to accompany CD4+ T cell counts for monitoring HIV-1 disease progression and the fitness of the antiviral immunity. Furthermore, the cytokine may be considered for immunotherapy in HIV-infected patients in order to restore the physiological levels of the cytokine and promote their antiviral immunity.

L’infection à VIH-1 est associée à une forte déplétion des lymphocytes T CD4+ à polarisation Th17 au niveau des tissus lymphoïdes associés aux muqueuses intestinales (GALT, gut-associated lymphoid tissues). Ceci conduit à la translocation microbienne, qui est une cause d’activation immunitaire chronique et de progression de la maladie. Les cellules épithéliales (CE) jouent un rôle critique dans le maintien de l’intégrité et de l’homéostasie au niveau des muqueuses intestinales via le recrutement des cellules de l’immunité innée (e.g., neutrophiles) et adaptative (e.g., cellules Th17). Les neutrophiles produisent des molécules antivirales (e.g., défensines-) et ont la capacité de limiter la réplication virale au niveau des muqueuses. Les cellules Th17 jouent un double rôle lors de l’infection à VIH. Elles contribuent d’une part à la défense contre différents pathogènes opportunistes en augmentant, via la production d’IL-17, la capacité des CE à attirer les cellules Th17 et les neutrophiles. D’autre part, les cellules Th17 jouent un rôle délétère en tant que cibles de réplication virale et sources de cytokines pro-inflammatoires. La fréquence des cellules Th17 est diminuée dans les GALT mais pas dans les poumons des patients infectés par le VIH, suggérant qu’il existe des mécanismes différents par lesquels les cellules Th17 sont recrutées vers ces sites anatomiques. Nous avons testé l’hypothèse selon laquelle le VIH interfère avec la capacité des CE intestinales et non pas pulmonaires à produire des chimiokines (CK) responsables de l’attraction des cellules Th17 et des neutrophiles. Nous avons démontré que les CE intestinales et pulmonaires produisent des CK spécifiques pour les cellules Th17 (CCL20) et les neutrophiles (CXCL8) en réponse à des stimuli pro-inflammatoires tels que l’IL-1 et le TNF-. Le TNF- agit en synergie avec l’IL-17, un « signal de danger » récemment identifié, et augmente la capacité des CE intestinales mais pas pulmonaires à produire la chimiokine CCL20. Cette synergie s’explique par l’augmentation préférentielle de l’expression du récepteur à l’IL-17 à la surface des CE intestinales suite à la stimulation par le TNF-. L’exposition au VIH n’affecte pas la production de CCL20 et de CXCL8 par les CE intestinales, mais altère la capacité des CE alvéolaires à produire ces chimiokines en accord avec la permissivité sélective de ces dernières à l’infection par le VIH. En conclusion, nos résultats démontrent que (i) le VIH n’interfère pas directement avec la capacité des CE intestinales à recruter des cellules Th17 et des neutrophils et que (ii) la production de CCL20 par ces cellules est dépendantes de la synergie entre le TNF- et l’IL-17. Ainsi, la déplétion des cellules Th17 et la pénurie en IL-17 dans les GALT des sujets infectés pourrait causer de façon préférentielle des altérations fonctionnelles au niveau des CE intestinales, se traduisant par l’altération du recrutement des cellules Th17 en réponse au CCL20. / The HIV-1 infection is associated with a severe loss of CD4+ T-cells with Th17 polarization from the gut-associated lymphoid tissues (GALT). These alterations lead to microbial translocation, which is a cause of chronic immune activation and disease progression in HIV-infected subjects. Epithelial cells (EC) play a critical role in maintaining mucosal integrity and homeostasis in the GALT by mechanisms including recruitment of innate (e.g., neutrophils) and adaptive immunity cells (e.g., Th17 cells). Neutrophils produce antiviral molecules (e.g., -defensins) that may limit HIV replication at mucosal sites. Th17 cells play a dual role in HIV pathogenesis. Th17 cells contribute to the defence against different opportunistic pathogens by increasing the ability of epithelial cells to attract neutrophils in an IL-17-dependent manner. On the other hand, Th17 cells play a deleterious role in HIV pathogenesis as they are sites of productive viral replication and a source of pro-inflammatory cytokines. The frequency of Th17 cells is decreased in the GALT but not in the lungs of HIV-infected individuals, suggesting distinct mechanisms of Th17 recruitment in these anatomic sites in the context of HIV pathogenesis. In this manuscript we tested the hypothesis that HIV differentially interfere with the ability of intestinal but not pulmonary EC to produce chemokines that attract Th17 cells and neutrophils. We demonstrated that both intestinal and pulmonary EC produce chemokines that specifically attract Th17 cells (CCL20) and neutrophils (CXCL8) upon stimulation with the pro-inflammatory cytokines IL-1 and TNF- . TNF-α acted in synergy with IL-17, a recently identified « danger signal », and increases the capacity of intestinal but not pulmonary EC to produce CCL20. This synergistic effect can be explained by the preferential upregulation of IL-17 receptor expression on intestinal EC upon TNF- stimulation. The exposure of intestinal EC to HIV did not affect their ability to produce CCL20 and CXCL8; however, exposure to HIV altered the production of these chemokines by alveolar EC, consistent with their selective permissiveness to infection. In conclusion, our results demonstrate that (i) HIV does not interfere directly with the ability of intestinal EC to attract Th17 cells and neutrophils and that (ii) the ability of intestinal EC to recruit the Th17 cells via CCL20 production is selectively dependent on the synergy between TNF- and IL-17. Thus, the depletion of Th17 cells and the shortage in IL-17 in the GALT of HIV-infected subjects may preferentially lead to functional alterations of the intestinal barrier resulting by the alteration of Th17 recruitment in response to CCL20.

L’histoire naturelle et la progression des infections au VPH (virus du papillome humain) sont bien décrites. Cependant, la dynamique de transmission reste faiblement documentée. Une meilleure compréhension de la dynamique de transmission ainsi que de ses facteurs de risque permettrait d’optimiser les stratégies de prévention afin de réduire la prévalence de ces infections dans la population par la vaccination et les méthodes contraceptives. Notre étude vise à déterminer si la charge virale des infections au VPH influence leur transmission entre les partenaires sexuels. Pour ce faire, l’association entre la charge virale au niveau des organes génitaux et la concordance spécifique de type des infections prévalentes au VPH a été évaluée pour 250 couples hétérosexuels récemment formés. Les charges virales de VPH16 (r = 0.30), de VPH18 (r = 0.50) et de VPH51 (r = 0.19) étaient significativement corrélées (p < 0.05) entre les deux partenaires sexuels, contrairement à celles de VPH31 (r = 0.08) et de VPH42 (r = -0.1). Lorsqu’ajusté en fonction de l’âge des participants, une charge virale élevée augmentait significativement le taux de détection du même type chez le partenaire pour les types 16, 31 et 51. Ainsi, dans les couples hétérosexuels récemment formés, des charges virales élevées sont associées à une détection accrue du même type chez le partenaire sexuel. / The natural history and progression of genital HPV infection are well understood. However, less is known about transmission dynamics of HPV between sexual partners. A better knowledge of risk factors and dynamics of HPV transmission is needed to optimize prevention strategies through vaccination and contraceptive measures. Our study aims to determine if the viral load of HPV infection affects transmission between sexual partners. The association between human papillomavirus (HPV) loads in genital swabs and type-specific concordance of prevalent HPV infection was assessed in 250 heterosexual recently-formed couples to further characterize HPV transmission. Viral loads of HPV16 (r=0.30), HPV18 (r=0.50) and HPV51 (r=0.19) were significantly correlated (p<0.05) between partners in opposite to HPV31 (r=0.08) and HPV42 (r=-0.10). A higher HPV load increased significantly the rate of detection of HPV16, 31 and 51 in sexual partners (age-adjusted odds ratios from 1.64 to 7.71). In recently-formed heterosexual couples, higher HPV16, 31 or 51 load was associated with increased detection of the same HPV type in sexual partners.

Le virus respiratoire syncytial (RSV) est un virus à ARN de polarité négative. Les études démontrent que toute la population sera infectée par ce virus au moins deux fois avant l’âge de 3 ans. Le RSV peut provoquer plusieurs pathologies respiratoires telles que la bronchiolite aiguë et la pneumonie. Les infections sévères corrèlent avec le développement de l’asthme. Lors d’une infection virale, les particules du RSV sont détectées par le senseur RIG-I qui induit l’activation des facteurs de transcription NF-κB et IRF-3. Respectivement, les facteurs de transcription activeront les réponses inflammatoire et antivirale. Au coeur des pathologies induites par le RSV se trouve une réponse immunitaire mal adaptée. Plus précisément, par l’entremise de NF-κB, le RSV provoque une production exagérée de cytokines et chimiokines qui induisent une réponse inflammatoire démesurée provoquant du dommage tissulaire. Paradoxalement, le RSV est capable d’échapper à la réponse antivirale. Ces deux phénomènes sont contrôlés par l’entremise des protéines non structurales NS1 et NS2. Le mécanisme délimitant le mode d’action de NS1 et NS2 sur la réponse antivirale reste à être déterminé. Avec pour objectif d’élucider comment NS1 et NS2 inhibent la réponse antivirale, nous avons investigué le mécanisme de reconnaissance de l’hôte vis-à-vis de RSV. Nous démontrerons, pour la première fois, que le senseur cytosolique MDA5 est impliqué dans la réponse antivirale contre le RSV. Nous présenterons des résultats préliminaires qui suggèrent que le rôle de MDA5 est non redondant à RIG-I. À l’aide d’ARN interférant dirigé contre RIG-I et de transfection de MDA5, nous démontrerons que MDA5 ne contribue pas à la phosphorylation d’IRF-3, mais plutôt qu’elle régit la stabilité du facteur de transcription. Nous démontrerons aussi que, contrairement à l’hypothèse actuelle sur le fonctionnement de NS1 et NS2, l’inhibition de ces derniers ne provoque pas une augmentation de la cytokine antivirale IFN−β. Cependant, l’expression ectopique de NS1 et NS2 réduit l’activité du promoteur de l’IFN-β et de la protéine cytoplasmic antivirale ISG56 lorsqu’elle est mesurée par essai luciférase. / Respiratory Syncytial Virus (RSV) is a RNA virus with negative polarity. RSV infections are the most common cause of hospitalization among infants. Among populations at risk, infection of RSV can be quite severe. RSV infections can cause bronchiolitis, pneumonia, while severe infections are linked to the development of asthma. Early in the infectious cycle of RSV, the cytosolic sensor RIG-I captures viral particles, and activates the immune response by engaging the transcription factors IRF-3 and NF-κB. At the heart of RSV mediated pathologies is a skewed immune response. More precisely, RSV over stimulates the release of proinflammatory chemokines and cytokines. Intriguingly, while RSV is able to stimulate the production of proinflammatory cytokines and chemokines, RSV under stimulates the antiviral response. The ability of RSV to evade the antiviral response is thought to be mediated by its non-structural proteins: NS1 and NS2. However, the mechanism by which NS1 and NS2 enable RSV to evade the antiviral response remains to be determined. In this memoir we investigated, how RSV is recognized by the innate immune response in airway epithelial cells. With this information we hope to improve our understanding of how NS1 and NS2 allow RSV to circumvent the antiviral response. We show for the first time that cytosolic sensor MDA5 plays a role in the recognition of RSV particles. Using a combination of interfering RNA directed against RIG-I, and transfection of MDA5, we show that MDA5 does not contribute to the phosphorylation of IRF-3. According to the data presented, we suggest that MDA5’s role in the immune response is to prevent the degradation of IRF-3. Contrary to previous research, we show that the inhibition of the nonstructural protein does not increase the production of the antiviral cytokine IFN-β. However, the ectopic expression of NS1 and NS2 does lead to a reduction of the promoter activity of IFN-β and the antiviral protein ISG56 when measured by luciferase assay. This research highlights the importance of MDA5 as a potential therapeutic target in the development of a cure for RSV.

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Avec plus de 20% de morts annuels dus aux maladies infectieuses, celles-ci restent un sujet majeur de santé publique. Des maladies d’origine virale (ré)émergent suite aux changements environnementaux, climatiques et sociétaux : le virus Ebola, la Dengue ou, plus récemment, le virus Zika. Dans ce contexte, il est donc aujourd’hui crucial de développer des vaccins efficaces et sûrs contre les infections virales émergentes. Ce projet de thèse vise à mettre en place une nouvelle stratégie de production de vaccins vivants atténués ciblant les virus à ARN en travaillant sur le virus de la fièvre jaune (genre Flavivirus). Après une analyse génomique qui a permis d’approfondir une technique de modification des virus appelée « ré-encodage », des mutants de la fièvre jaune ont été produits puis caractérisés in vitro et in vivo. En parallèle, un modèle rongeur de la fièvre jaune a été développé et a permis de tester in vivo à la fois l’innocuité et l’efficacité vaccinale des virus ré-encodés. / Despite recent considerable improvements, infectious diseases remain a major issue for public health, with an estimated 20% of annual deaths caused by infections. Among them, viral diseases (re)emerge following environmental, climatic and societal changes: Ebola, Dengue and Zika viruses have recently been the object of special attention. The development of safe and efficient vaccines against emerging viruses is a major challenge for global public health. This thesis work is in line with this issue. Using the yellow fever virus (YFV, genus Flavivirus) as a model, we tried to define new strategies for the design of live-attenuated vaccines for viral infections prevention. After a genomic analysis that allowed to go further into a procedure for virus modification named “re-encoding”, we generated and characterised both in vitro and in vivo mutant strains of YFV. In parallel, a rodent model was set up to test in vivo both the safety and the protective efficiency of the re-encoded viruses.