La capacité de détection des agents pathogènes est un enjeu croissant tant les maladies infectieuses représentent un risque pour la santé animale et humaine. La globalisation des échanges commerciaux et des voyages, l’évolution des pratiques agricoles, les changements climatiques ou encore les migrations de masse sont autant de facteurs bouleversant la biologie des micro-organismes et de fait, leurs capacités d’émergence. Ce manuscrit décrit trois approches complémentaires, basées sur trois techniques innovantes de biologie moléculaire pour la détection d’agents pathogènes et appliquées à trois contextes différents : (i) la recherche d’une liste précise de micro-organismes par PCR quantitative en temps réel en format microfluidique, (ii) la détection sans a priori d’agents infectieux dans un milieu complexe par métagénomique et séquençage Illumina (Miseq) et (iii) le génotypage d’un agent infectieux sans amplification préalable des génomes par NGS (Nouvelles Générations de séquençage) de troisième génération, le MinION d’Oxford Nanopore Technologies. Ces trois études ont permis de montrer l’apport de ces techniques, qui présentent toutes des caractéristiques distinctes, adaptées à différentes applications. Au-delà de l’application de ces techniques au domaine du diagnostic microbiologique, leur utilisation dans le cadre du contrôle des médicaments immunologiques vétérinaires est une perspective prioritaire de ce travail. En effet, les préparations vaccinales vétérinaires sont soumises à l’obligation de recherche d’une liste d’agents pathogènes à exclure mais également à la vérification de l’identité génétique des souches vaccinales. L’accessibilité et les performances exponentielles des nouvelles technologies de PCR et de séquençage ouvrent ainsi des perspectives révolutionnaires dans le domaine du diagnostic et du contrôle microbiologique. / Detection of pathogens becomes an increasing challenge, since infectious diseases represent major risks for both human and animal health. Globalization of trade and travels, evolution of farming practices and global climatic changes, as well as mass migrations are impacting the biology of pathogens and their emerging potential. This manuscript describes three approaches, based on three innovative technologies of molecular biology applied to the detection of pathogens in three different settings : (i) detection of a list of pathogens using real-time quantitative PCR on a microfluidic platform, (ii) unbiased detection of pathogens in complex matrix, using metagenomics and Illumina (Miseq) sequencing and (iii) genotyping of pathogens without isolation of PCR-enrichment using a 3rd generation NGS (Next Generation Sequencing) platform MinION from Oxford Nanopore Technologies. The three studies shown the contribution of these techniques, each representing distinctive features, suitable for the respective applications. Beyond application of these techniques to the field of microbial diagnostics, their use for the control of veterinary immunological drugs is a priority of this project. Veterinary vaccines are not only submitted to mandatory detection of listed pathogens to be excluded, but also to validation of the genetic identity of vaccine strains. The exponential availability and performances of new PCR or sequencing technologies open cutting-edge perspectives in the field of microbial diagnostic and control.

Le but de cette thèse est de trouver des modèles de haut niveau dans lesquelles l'auto-modification s'exprime facilement. Une donnée est lisible et modifiable, alors qu'un programme est exécutable. On décrit une machine abstraite où cette dualité est structurellement mise en valeur. D'une part une zone de programmes contient tous les registres exécutables, et d'autre part une zone de données contient les registres lisibles et exécutables. L'auto-modification est permise par le passage d'un registre d'une zone à l'autre. Dans ce cadre, on donne une abstraction de l'exécution de la machine qui extrait seulement les informations d'auto-modification. Logiquement, on essaye de trouver une correspondance de Curry-Howard entre un langage avec auto-modification et un système logique. Dans ce but on construit une extension de lambda-calcul avec termes gelés, c'est à dire des termes qui ne peuvent se réduire. Ces termes sont alors considérés comme des données, et les autres sont les programmes. Notre langage a les propriétés usuelles du lambda-calcul (confluence). D'autre part, on donne un système de types dans lequel un sous ensemble des termes du langage peuvent s'exprimer. Ce système est inspiré de la Logique Linéaire, sans gestion des ressources. On prouve que ce système de types a de bonnes propriétés, comme celle de la réduction du sujet. Finalement, on étend le système avec les continuations et la double négation, dans un style à la Krivine / The goal of my Ph.D. is to finds high level models in which self-modification can be expressed. What is readable and changeable is a data, and a program is executable. We propose an abstract machine where this duality is structurally emphasized. On one hand the program zone beholds registers which can be executed, and on the other hand data zone contains readable and changeable registers. Self-modification is enabled by passing a data register into program zone, or a program register into data zone. In this case, we give an abstraction of executions which only extracts information about self-modifications: execution is cut into paths without self-modification. For the logical part, we tried to find a Curry-Howard correspondence between a language with self-modifications and logical world. For that we built an extension of lambda-calculus with frozen terms, noted <t>, that is, terms which cannot reduce. This terms are considered as data. Other terms are programs. We first prove that this language as expected properties like confluence. On the other hand, we found a type system where a subset of terms of this language can be expressed. Our type system is inspired by Linear Logic, without resources management. We prove that this system has good properties like subject reduction. We finally have extended the system with continuation and double negation. This extension can be expressed in a krivine style, using a machine inspired by krivine machine

La Fièvre Catarrhale Ovine est une arbovirose due à un Orbivirus touchant les ruminants. Récemment, une épizootie majeure, notamment due au sérotype 8 du virus (BTV-8), a touché les ruminants Européens. Ce sérotype a présenté plusieurs particularités telles que le spectre d’hôte original, et la transmission transplacentaire. L’impact de l’infection par le BTV-8 chez le caprin a été étudiée dans ce travail d’un point de vue clinique, virologique, hématologique et sérologique, et notamment pour ce dernier aspect à travers le développement de deux outils sérologiques. L’impact d’une infection maternelle sur le fœtus a également été étudié.Ces travaux ont confirmé que l’impact de l’infection par le BTV-8 chez les caprins est modéré, tant d’un point de vue clinique que d’un point de vue hématologique. Ce travail a également permis de faire ressortir plusieurs connaissances nouvelles: un impact modéré sur les comptages leucocytaires ; une transmission transplacentaire du virus lors d’infection en milieu de gestation ; une détection du virus dans la semence ; une possible transmission « directe », non vectorielle.Ces 3 dernières constatations n’avaient jusqu’alors pas été rapportées dans la littérature chez les caprins, mais avaient été observées chez les ovins et les bovins. Ceci confirme que, même si les caprins sont des animaux sensibles mais que l’impact clinique est limité, la plupart des caractéristiques faisant la spécificité de l’infection par la souche européenne du BTV-8 peuvent également être retrouvées dans cette espèce. Néanmoins, l’absence de description de ces particularités dans des conditions d’infection naturelle ne permet pas de conclure quant à leur impact sur le terrain.Des outils sérologiques ont été également développés afin d’étudier les propriétés antigéniques des protéines virales chez le caprin. La production des protéines recombinantes NS1, NS3, VP7 et VP2 en système baculovirus, et de la protéine NS2 en système E. coli, ont permis l’obtention de protéines recombinantes. Ces 5 protéines recombinantes ont permis le développement de tests sérologiques permettant d’étudier leurs propriétés antigéniques et la cinétique d’apparition des anticorps après vaccination ou/et infection par le BTV-8 chez le caprin.Dans un premier temps, des tests ELISA indirect NS1, NS2, NS3, VP7 et VP2 ont été développés, et la capacité des tests ELISA NS et VP7 à permettre une différenciation entre les animaux infectés et vaccinés a été évaluée. Cependant, des anticorps anti-NS2 et NS3 ont été détectés dans les sérums d’animaux vaccinés et une faible réponse obtenue en ELISA NS1 chez les animaux infectés rend difficile l’utilisation d’un test ELISA DIVA basé sur ces 3 protéines non structurales. Enfin, une réponse en anticorps anti-VP2 est détectée par le test ELISA VP2 après vaccination et après épreuve virulente, suggérant une détection d’anticorps spécifiques de type par ce test.Dans un second temps, un test Luminex multiplex, basé sur l’utilisation des protéines VP7 et VP2 a été développé. Le Luminex VP7 présente une très bonne corrélation avec l’ELISA VP7 lorsque les sérums d’animaux infectés sont testés, avec une aire sous la courbe de 0,987. Les performances de ce test paraissent cependant modérées lorsque des sérums issus d’animaux ayant reçu une unique injection vaccinale sont testés. Le Luminex VP2 présente des performances également excellentes, avec une aire sous la courbe de 0,978. Les VPP et VPN ont été calculées pour des prévalences très faibles (0,5%, correspondant à la prévalence devant être détectée par le screening sérologique d’animaux sentinelles) : la VPP est alors très faible mais la VPN est très élevée (99,99% pour VP7, 99,95% pour VP2). Le test Luminex multiplex développé, caractérisé par une VPN très élevée, permet d’exclure avec confiance la présence du BTV-8 dans une région indemne lors de résultat négatif, correspondant parfaitement aux objectifs assignés. / Bluetongue is an infectious non contagious arbovirosis caused by Bluetongue virus (BTV), belonging to the genus Orbivirus. Recently, a major epizooty, due to BTV-8, was encountered in European ruminants. This serotype presented several original features such as an original host spectrum and transplacental transmission. This work consisted in studying the impact of BTV-8 infection in goats from a clinical, virological, haematological and serological (after development of two new serological tests) point of view, because of the lack of knowledge in this specie. The impact on foetuses of infection during gestation was also studied.The different animal studies realised confirmed that the BTV-8 infection has a moderate impact in goats from a clinical and haematological point of view. These studies led to obtain new information about BTV-8 impact: moderate impact on leucocytes counts; transplacental transmission of the virus when infection occurs in mid-pregnancy; detection of BTV-8 in bucks’ semen; direct, non vectorial transmission. The last 3 results had never been described in goats with BTV-8 before but had been encountered in sheep and cattle: it proves that, even if goats are susceptible to the infection but are less affected by the virus, most of feature of BTV-8 North European strain can also be encountered in this specie. However, these features have not been described in natural conditions, making impossible to conclude on their impact in the field.In a second part of this thesis, serological tool have been developed in order to study antigenic properties of viral proteins in goats. Recombinant proteins NS1, NS3, VP7 and VP2 were produced in baculovirus system, while NS2 was produced in E. coli system. These recombinant proteins were used to develop serological test in order to study antigenic properties and the kinetic of antibodies response against this 5 proteins after vaccination against and infection by BTV-8 in goats.In a first part, indirect ELISA NS1, NS2, NS3, VP7 and VP2 were developed, and the opportunity to develop DIVA ELISA test using NS and VP ELISA was evaluated. However, detection of antibodies against NS2 and NS3 in vaccinated animals, and the difficulties to detect antibodies against NS1 in infected animals led us to conclude that a DIVA ELISA test using non-structural proteins was difficult. Finally, it was possible to detect antibodies against VP2 in infected and vaccinated animals using our VP2 ELISA, suggesting a detection of antibodies specific of serotype by this test.In a second part, a multiplex Luminex test, using VP7 and VP2, was developed. This test has, for VP7 detection, a strong correlation with cELISA VP7, with an area under the curve of 0.987. Luminex VP7 performance is moderate when sera from goats having only one vaccine administration were tested. Concerning Luminex VP2, test performance are also excellent with an area under the curve of 0.978. When a prevalence of 0.5% was applied (prevalence that should be detected by serological screening in Europe), de predictive negative value was very high (99.99% for Luminex VP7; 99.95% for Luminex VP2). The Luminex test developed, with a very high PNV, can exclude with a high level of confidence the presence of BTV-8 in a free-area.

Cette thèse est consacrée à la problématique de l'évaluation des produits antivirus. L'utilisateur final d'un produit antivirus ne sait pas toujours quelle confiance il peut placer dans son produit antivirus pour parer convenablement la menace virale. Pour répondre à cette question, il est nécessaire de formuler la problématique de sécurité à laquelle doit répondre un tel produit et de disposer d'outils et de critères méthodologiques, techniques et théoriques permettant d'évaluer la robustesse des fonctions de sécurité et la pertinence des choix de conception au regard d'une menace virale identifiée. Je concentre mon analyse de la menace virale sur quelques mécanismes (mécanismes cryptographiques, transformations de programme) adaptés au contexte boîte blanche, i.e. permettant à un virus de protéger ses données critiques en confidentialité et de masquer son fonctionnement dans un environnement complètement maîtrisé par l'attaquant. Une première étape incontournable avant toute organisation d'une ligne de défense consiste à analyser les virus, afin d'en comprendre le fonctionnement et les effets sur le système. Les méthodes et techniques de la rétro-ingénierie logicielle occupent ici - au côté des techniques de cryptanalyse - une place centrale. J'ai pris le parti de focaliser sur les méthodes dynamiques d'extraction d'information fondées sur une émulation du matériel supportant le système d'exploitation. L'évaluation d'un moteur de détection selon des critères objectifs requiert un effort de modélisation. J'étudie quelques modèles utilisés actuellement (grammaires formelles, interprétation abstraite, statistique). Chacun de ces modèles permet de formaliser certains aspects du problème de la détection virale. Je m'attache à l'étude des critères qu'il est possible de définir dans chacun de ces cadres formels et à leur utilisation pour partie des travaux d'évaluation d'un moteur de détection. Mes travaux m'ont conduit à la mise en oeuvre d'une approche méthodologique et d'une plate-forme de tests pour l'analyse de robustesse des fonctions et mécanismes d'un produit anti-virus. J'ai développé un outil d'analyse de code viral, appelé VxStripper, dont les fonctionnalités sont utiles à la réalisation de plusieurs des tests. Les outils formels sont utilisés pour qualifier en boîte blanche - ou sur la base des documents de conception détaillée - la conformité et l'efficacité d'un moteur de détection.

L'analyse comportementale traditionnelle opère en général au niveau de l'implantation du comportement malveillant. Pourtant, elle s'intéresse surtout à l'identification d'un comportement donné, indépendamment de sa mise en œuvre technique, et elle se situe donc plus naturellement à un niveau fonctionnel. Dans cette thèse, nous définissons une forme d'analyse comportementale de programmes qui opère non pas sur les interactions élémentaires d'un programme avec le système mais sur la fonction que le programme réalise. Cette fonction est extraite des traces d'un programme, un procédé que nous appelons abstraction. Nous définissons de façon simple, intuitive et formelle les fonctionnalités de base à abstraire et les comportements à détecter, puis nous proposons un mécanisme d'abstraction applicable à un cadre d'analyse statique ou dynamique, avec des algorithmes pratiques à complexité raisonnable, enfin nous décrivons une technique d'analyse comportementale intégrant ce mécanisme d'abstraction. Notre méthode est particulièrement adaptée à l'analyse des programmes dans des langages de haut niveau ou dont le code source est connu, pour lesquels l'analyse statique est facilitée : les programmes conçus pour des machines virtuelles comme Java ou .NET, les scripts Web, les extensions de navigateurs, les composants off-the-shelf. Le formalisme d'analyse comportementale par abstraction que nous proposons repose sur la théorie de la réécriture de mots et de termes, les langages réguliers de mots et de termes et le model checking. Il permet d'identifier efficacement des fonctionnalités dans des traces et ainsi d'obtenir une représentation des traces à un niveau fonctionnel ; il définit les fonctionnalités et les comportements de façon naturelle, à l'aide de formules de logique temporelle, ce qui garantit leur simplicité et leur flexibilité et permet l'utilisation de techniques de model checking pour la détection de ces comportements ; il opère sur un ensemble quelconque de traces d'exécution ; il prend en compte le flux de données dans les traces d'exécution ; et il permet, sans perte d'efficacité, de tenir compte de l'incertitude dans l'identification des fonctionnalités. Nous validons nos résultats par un ensemble d'expériences, menées sur des codes malicieux existants, dont les traces sont obtenues soit par instrumentation binaire dynamique, soit par analyse statique.

Le viroïde de la mosaïque latente du pêcher (PLMVd) est un pathogène mondialement répandu et responsable de pertes (directes et indirectes) relativement importantes au niveau de la culture des pêchers. Cependant, peu de données sont actuellement disponibles en ce qui concerne dune part le(s) déterminant(s) de pathogénicité de ce viroïde et dautre part les éventuels mécanismes de résistance des plantes vis-à-vis des viroïdes. Lapproche originale de ce travail a été de jeter les bases de cette double caractérisation. Dans un premier temps, le rôle du pseudo-nud P8, commun à tous les variants du PLMVd actuellement séquencés, a été étudié par mutagenèse dirigée. Dans un second temps, la réponse moléculaire de plants de pêchers infectés par des variants de pathogénicités différentes a été caractérisée par le biais de la cDNA-AFLP. Lobjectif principal de cette thèse était didentifier une voie métabolique éventuellement impliquée dans la résistance des plants de pêcher contre ce viroïde. Au terme de ce travail, il est apparu que le pseudo-nud P8 était impliqué soit dans la stabilité du viroïde au sein des cellules infectées soit dans la réplication du viroïde. En effet, le variant inoculé présentant un pseudo-nud déstabilisé a montré une réplication réduite au cours des douze mois de létude. De plus, bien que le viroïde muté soit présent dans les plantes inoculées, aucun symptôme na été observé. Il est cependant trop tôt pour déterminer si cette latence apparente est due à une quantité trop faible du viroïde ou bien à une implication du pseudo-nud dans la pathogénicité du viroïde. La caractérisation de lexpression des gènes de plants de pêchers infectés par des variants de pathogénicité différente a permis de montrer que le PLMVd réprimait des gènes impliqués dans la photosynthèse et en particulier dans la protection des deux photosystèmes. Cette expression particulière des gènes des plantes infectées peut être mise en relation avec les symptômes de chlorose et de mosaïque sexprimant au cours dune infection par le PLMVd. Cependant, nous ne pouvons encore affirmer avec certitude si elle est une cause ou une conséquence de ces symptômes. De même, la cDNA-AFLP a permis de mettre en évidence la répression de protéines de choc thermique (HSPs) dans les feuilles symptomatiques. Ces protéines jouent généralement un rôle dans le repliement des protéines ainsi que dans leur assemblage, leur déplacement, leur stabilisation et leur dégradation. La régulation de leur expression peut donc avoir une grande influence dans les plantes infectées et, peut-être, jouer un rôle dans lexpression des symptômes. De même, le gène codant pour une novel cap-binding protein (nCBP) est apparu sous-exprimé dans les feuilles symptomatiques. Le rôle de ces protéines est encore mal connu mais elles pourraient intervenir dans la régulation de la traduction des ARNm. Leur répression peut donc également avoir un impact important et déstabiliser diverses voies métaboliques. Enfin deux gènes codant clairement pour des protéines de défense des plantes ont été identifiés. Il sagit dun gène codant pour un intermédiaire de la thiamine (impliquée dans le déclenchement de la SAR, surexprimé dans les feuilles asymptomatiques) et dun autre gène codant pour une protéine inhibitrice des polygalacturonases (sur-exprimé dans les feuilles symptomatiques). Le rôle exact de ces protéines dans la protection des plantes vis-à-vis du viroïde nest cependant pas encore clair. Ce travail constitue une première étude des relations hôte-pathogène établies durant une infection de plants de pêcher par le PLMVd. Cest également le premier, à notre connaissance à avoir analysé lexpression des gènes de plantes infectées en fonction des symptômes observés./ The Peach latent mosaic viroid (PLMVd) infects peach trees in all production areas. This pathogen is responsible of direct and indirect crop losses. However only a few data are available as regards on one hand the determinant of pathogenicity of this viroid and on the other hand the resistance mechanisms of plants against this pathogen. The original approach of this work was to give the foundation of this double characterization. Firstly, the role of the P8 pseudoknot, present in every sequenced PLMVd, was studied by directed mutagenesis. Secondly, the molecular response of different peach trees infected by different variants was evaluated by the use of the cDNA-AFLP. The main objective of this thesis was to identify a metabolic pathway implicated in the plant defence against the PLMVd. In the term of this work, it seemed that the P8 pseudoknot was implicated either in the stability or in the replication of the viroid into the infected cells. Indeed, the inoculated variant (with a destabilized pseudoknot) has shown a reduced replication during the cultural season. In spite of the presence of the mutated variant in the plants, no symptom was observed on the peach tree leaves. However, we cannot conclude if this absence of symptom is due to the low viroid quantity either to an implication of the pseudo-knot in the pathogenicity of the PLMVd. The characterization of the gene expression in the infected peach trees has allowed to highlight that the PLMVd represses genes implicated in the photosynthesis and more specifically genes involved in the protection of the two photosystems. This particular gene expression in the infected leaves was linked to the chlorosis and mosaic induced by the PLMVd. However, we cannot conclude with certitude if these symptoms are a cause or a consequence of this particular genes expression. The cDNA-AFLP has also allowed to identify the repression of genes coding for heat shock proteins (HSPs) in symptomatic leaves. These proteins generally have a role in the protein folding, assembly, translocation, stabilization and degradation. The regulation of their expression may have a great influence in the infected plants and, maybe, play a role in the symptoms expression. The gene coding for the novel cap-binding protein (nCBP) was also identified has repressed in the symptomatic leaves. The biological role of these proteins is unclear but it seems that these proteins act in the regulation of the mRNA translation. The repression of nCBP may thus have an important impact and to destabilize various biological pathways. Finally, two genes implicated in the plant defence were identified. One coding for a polygalacturonase inhibitor (over-expressed in symptomatic leaves) and the other one coding for a thiamine intermediate (involved in the SAR and over-expressed in the non-symptomatic leaves). The role of these proteins in the plant defence against the PLMVd is however unclear. To our knowledge, this is the first work where the host-pathogen relationship established during a PLMVd infection are studied. This is also the first time were the gene expression is linked to the viroid-induced symptoms.

L’entrée virale du VIH-1 dans ses cellules cibles constitue une cible thérapeutique de choix. À l’heure actuelle, un inhibiteur de fusion et un inhibiteur ciblant le corécepteur CCR5 sont utilisés en thérapie. Dans notre étude, notre objectif était d’évaluer le profil antiviral et fonctionnel de plusieurs types moléculaires envisagés comme inhibiteurs d’entrée du corécepteur CXCR4, soient : 1) de dérivés peptidiques mimant des portions du récepteur 2) de dérivés peptidiques issus du ligand naturel de CXCR4, le SDF-1 et 3) de dérivés du puissant inhibiteur de faible poids moléculaire, le T140. Notre recherche se concentrait sur la mise au point de molécules capables d’inhiber l’entrée du VIH en ciblant sélectivement le corécepteur CXCR4 tout en conservant les fonctions naturelles de ce dernier. Parmi les molécules testées, certaines possèdent un grand potentiel dans le développement de nouveaux médicaments antirétroviraux. / HIV entry into target cell is one of the main therapeutic goals in AIDS research. One fusion inhibitor is actually used as therapeutics and one more entry inhibitor targeting the CCR5 coreceptor was approved recently. The discovery of inhibitors targeting the second HIV coreceptor CXCR4 with high antiviral power versus low interference with natural functions of CXCR4 represents a crucial issue in AIDS research. In our study, antiviral properties and functional effect of different kinds of molecules were tested: 1) peptides derivative mimicking CXCR4 domains 2) SDF-1 derivative peptides and 3) T140 (a low molecular weight inhibitor) derivative molecules. These molecules were investigated in HIV infection and cellular migration. The main goal of our study was to determine molecules having great antiviral properties versus low interference on chemotactic response induced by the natural ligand of CXCR4 (SDF-1). Within the panel of molecules tested, some have great potential to become lead compounds for inhibition of viral entry through CXCR4.

L’adénovirus a été étudié dans l’optique de développer de nouveaux traitements pour différentes maladies. Les vecteurs adénoviraux (AdV) sont des outils intéressants du fait qu’ils peuvent être produits en grandes quantités (1X1012 particules par millilitre) et de par leur capacité à infecter des cellules quiescentes ou en division rapide. Les AdVs ont subi bon nombre de modifications pour leur permettre de traiter des cellules tumorales ou pour transporter des séquences génétiques exogènes essentielles pour le traitement de maladies monogéniques. Toutefois, les faibles niveaux d’expression du récepteur primaire de l’adénovirus, le CAR (récepteur à l’adénovirus et au virus coxsackie), réduit grandement l’efficacité de transduction dans plusieurs tumeurs. De plus, certains tissus normaux comme les muscles n’expriment que très peu de CAR, rendant l’utilisation des AdVs moins significative. Pour pallier à cette limitation, plusieurs modifications ont été générées sur les capsides virales. L’objectif de ces modifications était d’augmenter l’affinité des AdVs pour des récepteurs cellulaires spécifiques surexprimés dans les tumeurs et qui seraient exempts dans les tissus sains avoisinant. On peut mentionner dans les approches étudiées: l’utilisation de ligands bispécifiques, l’incorporation de peptides dans différentes régions de la fibre ou la substitution par une fibre de sérotypes différents. Notre hypothèse était que les domaines d’interaction complémentaire (K-Coil et ECoil) permettraient aux ligands de s’associer aux particules virales et d’altérer le tropisme de l’AdV. Pour ce faire, nous avons inclus un domaine d’interaction synthétique, le K-Coil,dans différentes régions de la fibre virale en plus de générer des mutations spécifiques pour abolir le tropisme naturel. Pour permettre la liaison avec les récepteurs d’intérêt dont l’EGF-R, l’IGF-IR et le CEA6, nous avons fusionné le domaine d’interaction complémentaire, le E-Coil, soit dans les ligands des récepteurs ciblés dont l’EGF et l’IGF-I, soit sur un anticorps à un seul domaine reconnaissant la protéine membranaire CEA6, l’AFAI. Suite à la construction des différents ligands de même que des différentes fibres virales modifiées, nous avons determiné tout d’abord que les différents ligands de même que les virus modifiés pouvaient être produits et que les différentes composantes pouvaient interagir ensemble. Les productions virales ont été optimisées par l’utilisation d’un nouveau protocole utilisant l’iodixanol. Ensuite, nous avons démontré que l’association des ligands avec le virus arborant une fibre modifiée pouvait entraîner une augmentation de transduction de 2 à 21 fois dans différentes lignées cellulaires. À cause de la difficulté des adénovirus à infecter les fibres musculaires occasionnée par l’absence du CAR, nous avons cherché à savoir si le changement de tropisme pourrait accroître l’infectivité des AdVs. Nous avons démontré que l’association avec le ligand bispécifique IGF-E5 permettait d’accroître la transduction autant dans les myoblastes que dans les myotubes de souris. Nous avons finalement réussi à démontrer que notre système pouvait induire une augmentation de 1,6 fois de la transduction suite à l’infection des muscles de souriceaux MDX. Ces résultats nous amènent à la conclusion que le système est fonctionnel et qu’il pourrait être évalué dans des AdVs encodant pour différents gènes thérapeutiques. / Adenoviruses have been studied as a way to develop new treatments for different diseases. Adenoviral vectors (AdV) are considered interesting tools for this propose, because they can be produced at high titers (1X1012 particles per millilitre) in laboratory and they have the capacity to infect non-dividing and dividing cells. AdV have been often modified in order to obtain the ability to kill tumour cells or to deliver exogenous genetic sequences essential to treat monogenic disease. However, weak expression of the primary adenovirus receptor, the CAR (Coxsackie and adenovirus receptor) reduces greatly the transduction efficiency of AdV for the tumour cells. Moreover, some normal tissues express low amount of CAR, like the skeletal muscle, reducing the appeal of using AdV as a gene delivery vehicle for this tissue. To address this problematic, many modifications were done on the adenoviral capsid. The goal of these modifications were to generate an AdV able to target specific cellular receptors that were expressed in tumour cells but not in normal cells. Several approaches were done to modify the tropism of AdV, such as incubation with a bispecific ligands, incorporation of peptides within the adenoviral fiber structure or substitution of the viral fiber with a different serotype fiber. The hypothesis of my project was to determine if an interaction domain fused within a ligand could bind the complementary domain incorporated on a virus and change the tropism of the AdV. The first step was to include a synthetic interaction domain, the K-Coil, within specific region of the adenoviral fiber, as well as inserting two point mutations to abolish the natural tropism. To target the EGF-R, IGF-IR and the CEA6, we fused the complementary interaction domain, the E-Coil, to the respective ligand known as the EGF and the IGF-I or to a single domain antibody (known as AFAI) that bind specifically to CEA6. The specific interaction between the E-Coil and K-Coil was used to associate the ligand with the fiber in order to retarget the AdV toward the selected receptor. We showed that the different ligands as well as the modified fibers could be produced and that both E-Coil and K-Coil expressing partners could interact together. We optimized the viral production by using an iodixanol purification protocol. More importantly, we clearly demonstrated that the ligand association with the fiber could increase the transduction efficiency between 2 to 21 fold against various tumour cells. The difficulty of adenovirus to infect muscle cells because of the lack of CAR expression brought us to evaluate the potential of our retargeted AdV to increase the transduction for the tissue. We showed that the use of IGF-E5 could increase the transduction efficiency in myoblasts as wells as in myotubes. We finally demonstrated that our retargeting system could increase the transduction efficiency for skeletal muscle by 1,6 fold in new born MDX mice. In conclusion, our results show that the retargeting system is indeed functional. This system could be assessed using vectors that express therapeutic genes.

L’hépatite C est une maladie affectant aujourd’hui 170 millions d’individus dans le monde. Cette maladie est causée par le virus de l'hépatite C (VHC). Les nouveaux traitements récemment mis sur le marché, visant à soigner l’hépatite C, sont très onéreux et donc inaccessibles pour les pays du Sud. De plus, l’utilisation de ces nouvelles molécules engendre l’apparition de mutation de résistance virale responsable de l’échec des traitements pour 5 à 10% des patients. La découverte de nouveaux antiviraux est donc toujours indispensable. Les plantes utilisées en médecine traditionnelle depuis des siècles sont une source de composés bio-actifs très intéressante. L’utilisation de ces plantes ou de composés naturels en complément des molécules utilisées en thérapie classique, permettrait de réduire significativement le coût de ces traitements et de les rendre accessibles à davantage de patients.L’epigallocatéchine-3-gallate (EGCG) et la delphinidine sont des molécules naturelles issues respectivement du thé vert et des fruits rouges. Ces deux molécules inhibent l’étape d’entrée du VHC dans les cellules hépatocytaires. Nous avons montré que l'EGCG et la delphinidine inhibent cette étape virale dans les hépatocytes en déformant les particules et bloquant ainsi leur attachement à la surface cellulaire. Nous nous sommes ensuite intéressés au processus engendrant cette déformation qui est probablement lié à l’agrégation des glycoprotéines d’enveloppe virale.Nous avons procédé au criblage d’extraits bruts de plantes extrêmophiles tunisiennes et mis en évidence que l’extrait brut de rhizome de Juncus maritimus inhibait l’étape de réplication du VHC. Le J. maritimus est une plante fortement présente dans les sols arides en Tunisie mais également sur les côtes françaises. En collaboration avec le laboratoire de Pharmacognosie de Lille et grâce à un fractionnement bioguidé, le principe actif a pu être isolé. Il s’agit du déhydrojuncusol qui inhibe la réplication virale avec une concentration effective médiane de 1,31 µM. De plus, nous avons montré que le déhydrojuncusol pouvait inhiber la réplication de virus présentant des mutations de résistance aux traitements actuels ciblant la protéine virale NS5A. Nous avons cherché à identifier la cible virale du déhydrojuncusol et il semblerait que ce soit également la protéine NS5A.Les résultats obtenus dans cette thèse confortent l’hypothèse que des molécules naturelles pourraient être utilisées dans le traitement de l’hépatite C. / Hepatitis C is a liver disease affecting 170 million people worldwide. This disease is caused by hepatitis C virus (HCV). New treatments, recently marketed, against HCV are very expensive and not really accessible for most-infected patients especially in low-income countries. Moreover, the use of these new molecules generates the emergence of HCV resistant variants responsible for treatment failure for 5 to 10% of the patients. Therefore, the discovery of new antiviral molecules is always needed. Since centuries, plants are used in traditional medicine. They are a very attractive source of bio-active compounds. Plant extracts or natural molecules used in combination with actual therapy, could significantly reduce the cost of these new treatments and render them accessible to more patients.Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) and delphinidin are natural molecules derived respectively from green tea and red berries. These two molecules inhibit HCV entry into hepatocyte cells. We have shown that this inhibition is due to a deformation of viral particles by the molecules inducing a blockade of virus attachment to the cell surface. We further investigated the process leading to this deformation, and conclude that it might be related to aggregation of viral envelope glycoproteins.We screened extracts of extremophile plants from Tunisia and showed that the crude extract of Juncus maritimus rhizome inhibited HCV replication step. J. maritimus is a plant present in arid soils in Tunisia but also in French coasts. In collaboration with the Pharmacognosy laboratory of Lille and thanks to a bioguided fractionation, the active compound present in this plant could be isolated. It was identified as dehydrojuncusol, which inhibits viral replication with a half maximal effective concentration of 1.31 &#956;M. We have also shown that dehydrojuncusol is able to inhibit replication of viruses with resistance mutations to current treatments targeting the viral protein NS5A. We have also tried to identify the viral target of dehydrojuncusol, and it seems that the target might also be the NS5A protein.The results obtained in this thesis confirm the hypothesis that natural molecules could be used in the treatment of hepatitis C.

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