Apesar da importância ambiental dos morcegos em ambientes urbanos, poucos estudos relatam a presença de enterococos nestes animais. Este estudo teve como objetivos: a) isolar, identificar as espécies e detectar a presença de genes de resistência e fatores de virulência em enterococos isolados de fezes de morcegos Tadarida brasiliensis; e b) avaliar a distribuição das espécies de enterococos por qPCR e dos genes de resistência por PCR nas amostras de fezes de morcegos T. brasiliensis. Quatro pools de fezes de morcegos foram coletados em três municípios do Estado do Rio Grande do Sul e foram analisados por metodologias utilizando técnicas de microbiologia e moleculares. A partir das análises dos enterococos isolados das fezes, foram identificadas 4 espécies, sendo Enterococcus faecalis a mais frequente (83,6%), seguida de E. casseliflavus (13,7%), E. gallinarum (1,35%) e E. mundtii (1,35%). As cepas apresentaram perfil de resistência para rifampicina, eritromicina, norfloxacina, ciprofloxacina e tetraciclina. Dentre as 32 cepas resistentes à eritromicina, 28 apresentaram o gene ermC. Das 13 cepas resistentes à ciprofloxacina e norfloxacina nenhuma foi positiva para o gene gyrA. A única cepa resistente à tetraciclina apresentou o gene tetM. Os genes vanC1 e vanC2-3 foram observados em cepas de E. faecalis Quanto à presença dos genes de virulência, maior incidência foi observada para os genes gelE (97,3%) e ace (91,8%), seguido por agg (49,3%), cylA (5,5%) e esp (2,7%). A análise por qPCR permitiu identificar as espécies E. casseliflavus, E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum e E. hirae nas fezes dos morcegos. Os genes de resistência ermC, gyrA, vanA, vanB, vanC1 e vanC2-3 foram detectados por PCR. Em conclusão, diferentes espécies de enterococos fazem parte da microbiota do trato gastrointestinal de morcegos T.brasiliensis e a presença de elementos de resistência e virulência podem estar relacionadas a fatores antropogênicos ou ter origem no resistoma ambiental. / Despite the environmental importance of bats in urban environments, few studies have reported the presence of enterococci in these animals. This study aimed: a) isolate, to identify the species and to detect the presence of resistance genes and virulence factors in enterococci isolated from feces of Tadarida brasiliensis bats; b) to evaluate the distribution of the enterococci species by qPCR and the resistance genes by PCR in the faecal samples of T. brasiliensis bats. Four pools of bats feces were collected in three places of the Rio Grande do Sul State and analyzed using microbiology and molecular methodologies. From the analysis of enterococci isolated from feces, 4 species were identified, being Enterococcus faecalis the most frequent (83.6%), followed by E. casseliflavus (13.7%), E. gallinarum (1.35%) and E. mundtii (1.35%). The strains showed a resistance profile to rifampicin, erythromycin, norfloxacin, ciprofloxacin and tetracycline. Of the 32 strains resistant to erythromycin, 28 presented the ermC gene. Of the 13 strains resistant to ciprofloxacin and norfloxacin, none were positive for the gyrA gene. The single tetracycline resistant strain showed the tetM gene. The vanC1 and vanC2-3 genes were observed in E. faecalis strains. As regards the presence of virulence genes, higher incidence was observed for to gelE (97.3%) and ace (91.8%) genes, followed by agg (49.3%), cylA (5.5%) and esp (2.7%). The qPCR analysis allowed to identify the E. casseliflavus, E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum and E. hirae species in the bats feces. The ermC, gyrA, vanA, vanB, vanC1 and vanC2-3 resistance genes were detected by PCR. In conclusion, different species of enterococci are part of the gastrointestinal tract microbiota of T. brasiliensis bats and the presence of resistance and virulence elements may be related to anthropogenic factors or originate from the environmental resistome.

A resistência antimicrobiana e fatores de virulência são importantes mecanismos de sobrevivência das bactérias, através deles elas se tornaram capazes de escapar da ação das adversidades do ambiente. O presente trabalho teve como objetivo principal analisar os fatores de virulência e genes de resistência de isolados de Klebsiella sp. e sua participação na manutenção de populações bacterianas resistentes em pontos na Laguna de Tramandaí. As amostragens foram realizadas em agosto de 2014 e janeiro de 2015 em quatro pontos distintos com diferentes graus de impacto ambiental. Foram analisados 272 isolados bacterianos das amostras de água da laguna de Tramandaí. Estes isolados foram submetidos a testes bioquímicos e microbiológicos para identificação e foram encontrados 37 isolados de Klebsiella sp. Estes isolados foram submetidos a testes de susceptibilidade antimicrobiana por disco-difusão, análise fenotípica de fatores de virulência e genes de resistência e pesquisa de genes de resistência (blaCTX-M, blaSHV, blaTEM) através de PCR e similaridade através do ERIC-PCR. Através da análise por MALDI-TOF, os 37 isolados foram identificados como quatro K. oxytoca, seis K. pneumoniae e 27 K. variicola. Todos os isolados foram suscetíveis a imipenem, ertapenem, piperacilina/tazobactam e polimixina B Ampicilina e amoxacilina foram os antimicrobianos com maior índice de resistência, o gene blashv foi o mais encontrado dentre os genes pesquisados. Todos os isolados apresentaram cápsula polissacarídica, 56,7% dos isolados apresentaram fímbrias do tipo 1, 56,7% demonstraram serem capazes de produzir biofilmes, 78,4% foram capazes de inativar os fatores bactericidas do soro e 81,1% sintetizaram sideróforos. A análise por ERIC-PCR e MALDI-TOF geraram dendrogramas de alta heterogeneidade e baixos índices de similaridade, indicando que diferentes populações de Klebsiella estão se mantendo naquele ambiente. Ficou evidenciado neste estudo, através dos isolados encontrados e suas características genéticas e fenotípicas de resistência bacteriana, que eles podem estar contribuindo para a manutenção e disseminação da resistência aos antimicrobianos no ambiente. / Antimicrobial resistance and virulence factors are important mechanisms for the survival of bacteria, through which they have become capable of escaping from the adversities of the environment. The present work had as main objective to analyze the virulence factors and resistance genes of Klebsiella sp. And its participation in the maintenance of resistant bacterial populations in points in Tramandaí Lagoon. Samplings were carried out in August 2014 and January 2015 at four different points with different degrees of environmental impact. A total of 272 bacterial isolates from the Tramandaí lagoon water samples were analyzed. These isolates were submitted to biochemical and microbiological tests for identification and 37 isolates of Klebsiella sp. These isolates were submitted to antimicrobial susceptibility tests by disc-diffusion, phenotypic analysis of virulence factors and and resistance gene (blaCTX-M, blaSHV, blaTEM) search by PCR and similarity through ERIC-PCR. Through the use of MALDI-TOF, the 37 isolates were identified as four of K. oxytoca, six of K. pneumoniae and 27 of K. variicola. All the isolates were suscetible to imipenem, ertapenem, piperacilin/tazobactam e polimixin B Ampicillin and amoxicillin were the most resistant antimicrobials, the blaSHV gene was the most found among the genes studied. All isolates presented a polysaccharide capsule, 56.7% of the isolates had type 1 fimbriae, 56.7% were able to produce biofilms, 78.4% were able to inactivate serum bactericidal factors and 81.1% synthesized siderophores. Analysis by ERIC-PCR and MALDI-TOF generated dendrograms with high diversity and low similarity indexes, indicating that different populations of Klebsiella are remaining in that environment. It was evidenced in this study, through the isolates found and their genetic and phenotypic characteristics of bacterial resistance that they may be contributing to the maintenance and dissemination of antimicrobial resistance.

Os Enterococcus spp. apresentam natureza ubiquitária e são encontrados no trato gastrointestinal de diversos animais. Entretanto, estudos desses microorganismos associados a tartarugas marinhas são escassos. Os objetivos deste estudo foram: isolar enterococos a partir de amostras fecais de tartarugas marinhas encontradas no Litoral Norte do Rio Grande do Sul; determinar a prevalência das espécies; avaliar seu perfil de suscetibilidade antimicrobiana; verificar a presença de genes relacionados à resistência e à virulência e; analisar sua diversidade genética. Um total de 158 enterococos foram identificados como E. faecalis (55,7%), E. faecium (23,4%), E. hirae (15,2%) e E. casseliflavus (5,7%). A maioria dos isolados foi suscetível aos antimicrobianos testados, no entanto, fenótipos de resistência foram encontrados para eritromicina (34,2%), rifampicina (32,9%) e tetraciclina (0,63%). O gene de resistência à eritromicina msrC foi encontrado em todos os E. faecium resistentes, já o gene erm(B), não foi detectado. Somente um isolado foi resistente à tetraciclina, e este não apresentou nenhum dos genes testados. Os genes de virulência, gelE e ace (98,86%), asa (68.18%) e cylA (40,90%) foram detectados somente em E. faecalis. A atividade de gelatinase e citolisina foi verificada em 87 e 19 isolados, respectivamente. A maioria dos enterococos não foi capaz de formar biofilme. A análise dos perfis gerados por PFGE revelou um grande número de clones. Em conclusão, diferentes espécies de enterococos compõem a microbiota do trato gastrointestinal das tartarugas marinhas e a presença de determinantes de resistência e virulência nestes animais pode estar relacionada a fatores antropogênicos ou, ainda, ter origem no resistoma ambiental. / Enterococcus spp. shows an ubiquitous nature and are found in the gastrointestinal tract of several animals. However, studies of enterococus in sea turtles are scarce The aims of this study were: to isolate Enterococcus spp. from fecal samples of sea turtle found on the North coast of Rio Grande do Sul; to determine the prevalence of species; to evaluate their antimicrobial susceptibility profile; to check the presence of resistance and virulence related genes and; to analyse their genetic diversity. A total of 158 enterococci were identified as E. faecalis (55.7%) E. faecium (23.4%), E. hirae (15.2 %) and E. casseliflavus (5.7%). Most of the isolates were susceptible to the tested antimicrobials, however, resistance phenotypes were found for erythromycin (34.2%), rifampicin (32.9%) and tetracycline (0.63%). The erythromycin resistance gene msrC was detected in all E. faecium erythromycin resistant; moreover, the gene erm (B) was not detected. Only one sample was resistant to tetracycline, although it did not show any of the tetracycline resistant genes tested. Virulence genes gelE and ace (98.86%), asa (68.18%) and cylA (40.90%) were detected only in E. faecalis. The cytolysin and gelatinase activity was observed in 19 and 87 strains, respectively. Most enterococci were not able to form biofilm. The profile analysis generated by PFGE revealed a large number of clones. In conclusion, different species of enterococci were found in the microflora of sea turtle gastrointestinal tract and the presence of resistance and virulence determinants in these animals might be related to anthropogenic factors or even to an environmental resistome origin.

A distribuição das espécies de enterococos, bactérias comensais do trato gastrointestinal (TGI), é bastante estudada nos diferentes mamíferos; entretanto, em lobos-marinhos (Arctocephalus spp.) ainda não existem dados. Os objetivos do estudo foram: a) isolar Enterococcus spp. a partir de amostras fecais de lobos-marinhos encontrados no litoral norte do Rio Grande do Sul; b) determinar a prevalência das espécies; c) avaliar o perfil de suscetibilidade antimicrobiana; d) verificar a presença de genes relacionados à resistência e à virulência e; e) analisar o perfil genotípico por RAPD-PCR. No total, 160 enterococos foram isolados e identificados como E. faecalis (50,62%), E. hirae (34,37%), E. casseliflavus (11,87%), E. gallinarum (1,87%), E. mundtii (0,62%) e E. faecium (0,62%). Noventa e três isolados foram sensíveis aos dez antimicrobianos testados. As propriedades de resistência foram encontradas para eritromicina (21,25%), nitrofurantoína (15,62%), tetraciclina (6,25%), norfloxacina (3,12%) e ciprofloxacina (3,12%). Dentre os 10 isolados resistentes à tetracilina, 3 apresentaram o gene tet(M) e nenhum o tet(L). Dos 34 resistentes à eritromicina, 2 apresentaram o gene erm(B). Quanto à presença dos genes de virulência, maior incidência foi observada para os genes ace (66,87%) e gelE (50,62%), seguidos por asa (11,87%) e cylA (2,5%). A atividade de gelatinase e citolisina indicou a presença de genes silenciosos. A análise do RAPD-PCR permitiu reunir os isolados em cinco grupos. Em conclusão, diferentes espécies de enterococos compõem a microbiota do TGI de lobos-marinhos e a presença de elementos de resistência e virulência podem estar relacionados a fatores antropogênicos ou ter origem no resistoma ambiental. / The species distribution of enterococci, commensal bacteria of the gastrointestinal tract (GIT), is well studied in different mammals, however in fur seals (Arctocephalus spp.) data do not exist yet. The objectives of this study were: a) to isolate Enterococcus spp. from fecal samples of fur seals found on the North coast of Rio Grande do Sul; b) to determine the prevalence of species; c) to assess the antimicrobial susceptibility profile; d) to check the presence of resistance and virulence related genes and; e) to evaluate the genotypic profile by RAPD-PCR. A total of 160 enterococci were isolated and identified as E. faecalis (50.62%), E. hirae (34.37%), E. casseliflavus (11.87%), E. gallinarum (1.87%), E. mundtii (0.62%), and E. faecium (0.62%). Ninety-three isolates were susceptible to 10 antimicrobials tested. Resistance properties were found for erythromycin (21.25%), nitrofurantoin (15.62%), tetracycline (6.25%), norfloxacin (3.12%), and ciprofloxacin (3.12%). Among the 10 isolates resistant to tetracycline, 3 harbored the tet(M) gene and none were positive to tet(L) gene. Among the 34 erythromycin-resistant isolates, 2 harbored the erm(B) gene. Regarding the virulence genes, a higher incidence was observed for the ace (66.87%) and gelE (50.62%), followed by asa (11.87%) and cylA (2.5%). Gelatinase and cytolysin activity indicated the presence of silent genes. Analysis of RAPD-PCR allowed to assemble the isolates into five groups. In conclusion, different species of enterococci are part of the fur seals GIT microbiota and the presence of resistance and virulence elements may be related to anthropogenic factors or origin in the environmental resistome.

Submitted by Liliane Ferreira (ljuvencia30@gmail.com) on 2018-07-12T13:37:44Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rayanny Gomes de Andrade - 2018.pdf: 3411156 bytes, checksum: cfec02b05834f880d1758da75f7a6436 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-07-13T10:34:52Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rayanny Gomes de Andrade - 2018.pdf: 3411156 bytes, checksum: cfec02b05834f880d1758da75f7a6436 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-13T10:34:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rayanny Gomes de Andrade - 2018.pdf: 3411156 bytes, checksum: cfec02b05834f880d1758da75f7a6436 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-06-12 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Mycobacterium tuberculosis is the etiological agent of tuberculosis (TB), which is responsible in 2015 for 10.4 million new cases and 1.8 million casualties registered worldwide. To be able to avoid the defense barriers of the host, the bacteria evolved mechanisms to modulate or change the environment it is in, thereby, the secretion of bioactive molecules is an efficient strategy to do so. Among the bioactive molecules produced by M. tuberculosis, proteases have a crucial role to a successful infection, as they are involved in several important biological processes of the bacteria, such as DNA replication, cell proliferation and antigen processing. Thus, proteases are good targets for the development of new anti-TB drugs or as possible vaccine antigens. This work aimed to clone and express the gene Rv2467, a putative protease with aminopeptidase activity from M. tuberculosis. To achieve this goal, oligonucleotides design were made to amplify the gene Rv2467 by Polimerase Chain Reaction (PCR), which was cloned in the pGEM-T easy vector. The clone Rv2467 gene was then transfere to the expression vector pET-28a. The recombinant protein was expressed from the recombinant plasmid pET-28a/Rv2467 in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS through induction with IPTG. The recombinant protein, with the expected size of 94KDa, was expressed and subjected to the purification process by nickel affinity chromatography. The recombinant protein was partially purified only in its denatured form. The low yield of purified recombinant protein raised the possibility of histidine tail loss. To verify that, Western Blotting with anti-histidine antibody was made and it was verified that the antibody did not recognize the target Rv2467 protein, which made it impossible to acquire the pure protein, not allowing further characterization tests. Additionally, a literature review was performed about Mycobacterium tuberculosis proteases that are involved in virulence mechanisms to make a manuscript to be submitted to a scientific journal / Mycobacterium tuberculosis é o agente etiológico da tuberculose (TB), que provocou em 2015, 10,4 milhões de novos casos e 1,8 milhões de mortes registrados mundialmente. Para conseguir evadir as barreiras de defesa do hospedeiro, a bactéria evoluiu criando mecanismos que modulam ou modificam o ambiente no qual ela está inserida, sendo a secreção de moléculas bioativas uma estratégia eficiente para isso. Dentre as moléculas bioativas produzidas por M. tuberculosis, as proteases desempenham papel crucial para o sucesso da infecção, pois estão envolvidas em diversos processos biológicos importantes para a bactéria, tais como replicação do DNA, proliferação celular, processamento de antígeno, entre outros. Deste modo, as proteases se apresentam como alvo para novas drogas anti-TB ou como possíveis antígenos vacinais. Com isso, o foco deste trabalho foi clonar e expressar o produto do gene Rv2467, uma suposta protease com atividade aminopeptidase de M. tuberculosis. Para tanto foi realizado o desenho dos oligonucleotídeos iniciadores para amplificar o gene Rv2467 por Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) que foi clonado no vetor pGEM-T easy. O inserto correspondendo ao gene Rv2467 foi retirado do vetor de clonagem e inserido no vetor de expressão pET-28a. A proteína recombinante foi expressa a partir do plasmídeo recombinante pET-28a/Rv2467 em Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS através de indução com IPTG. A proteína recombinante, apresentando o tamanho esperado de 94 KDa, foi expressa e submetida ao processo de purificação por cromatografia de afinidade ao níquel. A purificação parcial da proteína recombinante somente foi possível de forma desnaturada, sendo que as tentativas de obtê-la de forma nativa para testar atividade resultaram improdutivas. O baixo rendimento de purificação da proteína recombinante levou a suspeitar da possível perda da cauda de histidina e, para tanto, realizou-se um Western Blotting com anticorpo anti-histidina. Ao ver a revelação na membrana verificou-se que o anticorpo não reconheceu a proteína Rv2467 o que impossibilitou obter a proteína pura não podendo seguir para futuros testes de caracterização. Além de testes para obter a proteína em sua forma nativa foi escrito um manuscrito científico de revisão da literatura sobre proteases de Mycobacterium tuberculosis envolvidas no mecanismo de virulência.

Salmonella do grupo paratifóide é responsável por toxi-infecção alimentar no homem, veiculada por alimentos contaminados. Este estudo determinou o perfil genotípico de nove amostras de S. Typhimurium, a sua patogenicidade, assim como sua capacidade de colonização e invasão em aves SPF. Verificou-se pela análise dos genes: agfA, avrA, cdtB, fimA, fliC, invA, iroN, lpfC, mgtC, pefA, sefC, sifA, sipB, sipC, sitC, slyA, sopB, sopE1, sptP ou spvC em amostras de Salmonella Typhimurium que todas foram negativas para os genes sopE1 ou spvC. O gene cdtB estava presente em apenas uma amostra (11,11%) e o gene pefA em duas amostras (22,22%). O gene sefC foi encontrado em três amostras (33,33%). Em oito amostras (88,88%) os genes agfA, fimA, lpfC ou sptP estiveram presentes. Os genes avrA, fliC, invA, iroN, mgtC, sifA, sipB, sipC, sitC ou slyA ou sopB estiveram presentes em 100% das amostras analisadas. Determinou-se quatro perfis genotípicos. No ensaio de patogenicidade observou-se que as amostras inoculadas por via oral, não causaram mortalidade de pintinhos SPF de um dia de idade, com a exceção da amostra SA 633 e SA 006 que apresentaram 30 e 10%, respectivamente. No entanto, observou-se que a infecção por via subcutânea provocou uma maior mortalidade de pintinhos, sendo que as amostras SA 003, SA 004, SA 005 e a amostra vacinal mostraram somente 10% de mortalidade, a amostra SA 002 30%, as amostras SA 632 e SA 634 70% e a amostra SA 633 100%. A amostra SA 006 não provocou nenhuma mortalidade. A amostra mais patogênica pela via subcutânea foi a SA 633. O ensaio de colonização foi realizado em pintinhos SPF, com as amostras SA 002, SA 003, SA 004, SA 005, SA 006, SA 632, SA 633, SA 634 e amostra vacinal. Verificou-se ausência de invasão no fígado e baço 24 horas pós- infecção, exceto para as amostras SA 632 (30%) e amostra vacinal (20%). Após sete dias da infecção houve invasão em dois pintinhos com a amostra SA 002 e um pintinho com as amostras SA 004 e SA 005. Apenas na amostra SA 632 constatou-se colonização em ceco após 24 horas em 10% das amostras e após 7 dias em 70% pós-infecção. Concluiu-se que entre as amostras de Salmonella Typhimurium analisadas existiam diferentes perfis genotípicos baseando-se na presença ou ausência de genes de virulência, e que a amostra vacinal assemelha-se a amostras de S. Typhimurium estudadas quanto a presença dos genes. Os resultados do teste de patogenicidade das amostras de ST indicaram que a via de inoculação modifica a patogenicidade de uma mesma amostra e que a mortalidade após a inoculação pela via subcutânea é sempre superior que pela via oral. / Parathyphoid Salmonella are major food-borne pathogens spread by contaminated food products. This study determined the genotypic profile of nine samples of S. Typhimurium, pathogenicity, colonization and invasion in SPF chicks. It was found by analysis of genes: agfA, avrA, cdtB, fimA, fliC, invA, iroN, lpfC, mgtC, pefA, sefC, sifA, sipB, sipC, sitC, slyA, sopB, sopE1, sptP or spvC samples of S. Typhimurium all were negative to sopE1 or spvC. The cdtB gene was identified in one sample and pefA gene in two samples (22,22%). Sef C gene was detected in three samples (33,33%). In eight samples (88,88%) agfA, fimA, lpf or sptP were detected. AvrA, fliC, invA, iroN, mgtC, sifA, sipB, sipC, sitC, slyA and sopB were detected in all samples evaluated. Four genotypic profiles were established. Pathogenicity tests showed that samplesinoculated by oral gavage did not present mortality in one day old SPF chicks, except samples SA 633 and SA006 with 30 and 10%, respectively. However, it was observed that subcutaneous inoculation showed high mortality in SPF chicks than oral inoculation, and samples SA 003, SA004, SA005 and vaccinal strain showed 10% of mortality, 30% for sample SA002, 70% in the samples SA632 and SA 634 and 100% when the sample SA 633 was inoculated. No mortality was observed in sample SA006. Colonization test was performed in SPF chicks using the samples: SA002, SA 003, SA 004, SA005, SA006, SA 632, SA 633, SA 634 and vaccinal strain. The more pathogenic strain subcutaneously was the SA 633. There was not invasion in liver and spleen 24 hours p.i., except for sample SA 632 (30%) and vaccinal strain (20%). Seven days p.i. invasion was detected in two chicks inoculated with samples identified as SA 004 and SA 005. Sample SA 632 showed 10% of cecal colonization 24 hours p.i. and 70% after one week p.i. It was concluded that Salmonella Typhimurium strains including the vaccinal strain, showed different genotypical profiles, based on the presence or absence of genes of virulence genes. The results of the pathogenicity test indicated that inoculation route modify the pathogenicity of the same strain, and the mortality post-inoculation was always higher in chicks inoculated by subcutaneous route when compared to the oral route.

As proteínas fosfatases desempenham um papel fundamental na modificação pós-traducional reversível de proteínas por fosforilação, ao atuarem na remoção do grupo fosforil estável de resíduos de serina, treonina e tirosina. Embora predominem em eucariotos, as serina/treonina fosfatases (STPs) também existem em bactérias, nas quais atuam controlando diversos aspectos fisiológicos e de virulência. Neste trabalho investigamos o papel das STPs na virulência e fisiologia de Chromobacterium violaceum, uma ?-proteobactéria que atua como um patógeno ocasional de humanos e é amplamente encontrada em água e solos de regiões tropicais e subtropicais. Análises in silico revelaram a presença de quatro STPs no genoma de C. violaceum, sendo que duas possuem apenas o domínio de fosfatase (CV_0881 e CV_3848) e duas possuem um domínio adicional de regulador de resposta (CV_2644 e CV_3505). Mutantes nulos foram construídos para as quatro STPs e todas estas linhagens apresentaram crescimento semelhante ao da linhagem selvagem em meio rico e meio mínimo. As linhagens mutantes ?0881, ?2644 e ?3505 não apresentaram alteração de virulência em camundongos. Os mutantes ?2644 e ?3505 apresentaram menor formação de biofilme, o que sugere papel dessas fosfatases neste processo. Uma caracterização mais aprofundada da linhagem ?3848 por diferentes técnicas de microscopia revelou que este mutante apresenta células de tamanho diminuído, irregularidades no envelope celular e problemas na distribuição do DNA. Estes dados sugerem que CV_3848 tem papel em divisão celular, condensação do material genético e manutenção da parede celular. Nos ensaios de virulência o mutante ?3848 mostrou menor capacidade de causar morte e manter-se no fígado de camundongos, indicando que a STP CV_3848 é importante na patogenicidade de C. violaceum. / Protein phosphatases play a key role in reversible post-translational modification of proteins through phosphorylation since they act removing the stable phosphoryl group of serine, threonine and tyrosine residues. Although dominant in eukaryotes, the serine/threonine phosphatases (STPs) also exist in bacteria, in which they act by controlling various physiological and virulence traits. In this work we investigated the role of STPs on the virulence and physiology of Chromobacterium violaceum, a ?-proteobacterium that occasionally acts as a pathogen of humans and it is widely found in water and soil of tropical and subtropical regions. In silico analyzes revealed the presence of four STPs in the genome of C. violaceum, two of which have only the phosphatase domain (CV_0881 and CV_3848) and two that possess an additional domain of response regulator (CV_2644 and CV_3505). Null mutants were constructed for the four STPs and all of them showed similar growth to the wild type strain on rich and minimal medium. The mutant strains ?0881, ?2644 and ?3505 did not show any change in virulence in mice. The ?2644 and ?3505 mutants had lower biofilm formation, suggesting the role of these phosphatases in this process. Further characterization of ?3848 by different microscopy techniques revealed that this mutant presents cells of diminished size, irregularities in the cellular envelope and problem on the DNA distribution. These data suggest that CV_3848 has role in cell division, condensation of the genetic material and cell wall maintenance. In virulence assays the ?3848 mutant showed a lower ability to cause death and to remain in the liver of mice, indicating that the STP CV_3848 is important for the pathogenicity of C. violaceum.

O papel dualístico exercido por Enterococcus na natureza estimula a pesquisa dos fatores que determinam sua virulência. O objetivo desse estudo foi investigar a distribuição de genes envolvidos com fatores de virulência entre isolados de Enterococcus e sua correlação com a capacidade de formação de biofilme e confirmar a identificação de E. casseliflavus e E. gallinarum por PCRRFLP. Foram analisados 66 isolados clínicos e 70 alimentares quanto a presença dos genes gelE, esp, agg, ace e cylA por PCR e atividade de gelatinase e citolisina. Isolados clínicos apresentaram maior incidência de fatores de virulência quando comparados com alimentares, exceto para os genes gelE e ace. Em ambas amostragens houve a ocorrência de isolados positivos para os genes gelE e cylA, porém sem atividade enzimática, indicando a presença de genes silenciosos. A maioria dos isolados apresentou capacidade de formação de biofilme, entretanto não houve uma correlação entre os genes analisados e o fenótipo de formação de biofilme, porém é possível que o gene ace e gelE atuem como potencializadores na formação de biofilmes em Enterococcus. Para testar a técnica de PCR-RFLP, 32 e 20 isolados de E. gallinarum e E. casseliflavus, respectivamente, identifcados bioquimicamente foram avaliados. O fragmento de 661 bp correspondente a uma região conservada do 16S rDNA foi clivado com HinfI e 47% E. gallinarum e 25% E. casseliflavus apresentaram fragmentos de 589bp e 72bp, padrão esperado para o PCR-RFLP. Assim sendo, a PCR-RFLP mostrou ser uma ferramenta molecular útil na confirmação das espécies E. casseliflavus e E. gallinarum. / The dualistic role played by enterococci in the nature, encourages the study of virulence factors. The aim of this study was to investigate the distribution of genes involved in virulence among Enterococcus isolates and to correlate with biofilm formation ability and to confirm the identification of Enterococcus gallinarum and Enterococcus casseliflavus isolated from clinical and food samples by PCR-RFLP. Sixty six clinical and 70 food isolates were analyzed for the presence of gelE, esp, agg, ace and cylA genes by PCR and the gelatinase and cytolysin activities. Clinical isolates showed a higher incidence of virulence factors when compared to food isolates, except for gelE and ace genes. In both samples was observed the occurrence of isolates positive for gelE and cylA genes, but with no enzymatic activities, indicating the presence of silent genes. Most isolates showed ability to form biofilm, although there was no correlation between the presence of the genes and the phenotype of biofilm formation, but it is possible that ace and gelE genes perform as enhancers in biofilm formation in Enterococcus. To test the PCR-RFLP tecnhique, 32 and 20 strains identified by conventional biochemical exams as E. casseliflavus E. gallinarum, respectively, were were submitted to PCR amplification and digested with HinfI.. The DNA fragment of 661 bp corresponding to a conserved region of 16S rDNA was cleaved with HinfI and 47% and 25% of E. gallinarum and E. casseliflavus showed DNA fragments of 589 bp and 72 bp, expected for PCR-RFLP. Thus, PCR-RFLP proved to be a useful molecular tool for confirmation the E. casseliflavus and E. gallinarum species.

A distribuição das espécies de enterococos, bactérias comensais do trato gastrointestinal (TGI), é bastante estudada nos diferentes mamíferos; entretanto, em lobos-marinhos (Arctocephalus spp.) ainda não existem dados. Os objetivos do estudo foram: a) isolar Enterococcus spp. a partir de amostras fecais de lobos-marinhos encontrados no litoral norte do Rio Grande do Sul; b) determinar a prevalência das espécies; c) avaliar o perfil de suscetibilidade antimicrobiana; d) verificar a presença de genes relacionados à resistência e à virulência e; e) analisar o perfil genotípico por RAPD-PCR. No total, 160 enterococos foram isolados e identificados como E. faecalis (50,62%), E. hirae (34,37%), E. casseliflavus (11,87%), E. gallinarum (1,87%), E. mundtii (0,62%) e E. faecium (0,62%). Noventa e três isolados foram sensíveis aos dez antimicrobianos testados. As propriedades de resistência foram encontradas para eritromicina (21,25%), nitrofurantoína (15,62%), tetraciclina (6,25%), norfloxacina (3,12%) e ciprofloxacina (3,12%). Dentre os 10 isolados resistentes à tetracilina, 3 apresentaram o gene tet(M) e nenhum o tet(L). Dos 34 resistentes à eritromicina, 2 apresentaram o gene erm(B). Quanto à presença dos genes de virulência, maior incidência foi observada para os genes ace (66,87%) e gelE (50,62%), seguidos por asa (11,87%) e cylA (2,5%). A atividade de gelatinase e citolisina indicou a presença de genes silenciosos. A análise do RAPD-PCR permitiu reunir os isolados em cinco grupos. Em conclusão, diferentes espécies de enterococos compõem a microbiota do TGI de lobos-marinhos e a presença de elementos de resistência e virulência podem estar relacionados a fatores antropogênicos ou ter origem no resistoma ambiental. / The species distribution of enterococci, commensal bacteria of the gastrointestinal tract (GIT), is well studied in different mammals, however in fur seals (Arctocephalus spp.) data do not exist yet. The objectives of this study were: a) to isolate Enterococcus spp. from fecal samples of fur seals found on the North coast of Rio Grande do Sul; b) to determine the prevalence of species; c) to assess the antimicrobial susceptibility profile; d) to check the presence of resistance and virulence related genes and; e) to evaluate the genotypic profile by RAPD-PCR. A total of 160 enterococci were isolated and identified as E. faecalis (50.62%), E. hirae (34.37%), E. casseliflavus (11.87%), E. gallinarum (1.87%), E. mundtii (0.62%), and E. faecium (0.62%). Ninety-three isolates were susceptible to 10 antimicrobials tested. Resistance properties were found for erythromycin (21.25%), nitrofurantoin (15.62%), tetracycline (6.25%), norfloxacin (3.12%), and ciprofloxacin (3.12%). Among the 10 isolates resistant to tetracycline, 3 harbored the tet(M) gene and none were positive to tet(L) gene. Among the 34 erythromycin-resistant isolates, 2 harbored the erm(B) gene. Regarding the virulence genes, a higher incidence was observed for the ace (66.87%) and gelE (50.62%), followed by asa (11.87%) and cylA (2.5%). Gelatinase and cytolysin activity indicated the presence of silent genes. Analysis of RAPD-PCR allowed to assemble the isolates into five groups. In conclusion, different species of enterococci are part of the fur seals GIT microbiota and the presence of resistance and virulence elements may be related to anthropogenic factors or origin in the environmental resistome.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-08-26T13:10:40Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE_11_04_16_digital_Adriane Borges.pdf: 2262044 bytes, checksum: dbae9d1c06e8de343e9296fef77dafc2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-26T13:10:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE_11_04_16_digital_Adriane Borges.pdf: 2262044 bytes, checksum: dbae9d1c06e8de343e9296fef77dafc2 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / FACEPE / Enterobacter aerogenes e Enterobacter cloacae são importantes patógenos causadores de Infecções relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS), podendo apresentar diferentes genes de virulência e de resistência a antimicrobianos. O objetivo desse estudo foi caracterizar e comparar genomicamente isolados de E. aerogenes e E. cloacae multidrogas resistentes (MDR), provenientes de um Hospital público de Recife-PE entre 2011 e 2013, através da investigação de genes relacionados à resistência a antimicrobianos e à virulência, como também analisar o perfil plasmidial e relação clonal dos isolados. Portanto, este estudo foi dividido em três etapas: (1) caracterizar fenotipicamente e genotipicamente 51 isolados de E. aerogenes e E. cloacae provenientes de infecção ou colonização em pacientes de um hospital público de Recife-PE, Brasil, através de perfil de susceptibilidade a antimicrobianos, análises de genes de β-lactamase por PCR e sequenciamento de DNA, perfil plasmidial e ERIC-PCR; (2) realizar o primeiro sequenciamento genômico de 2 isolados de E. aerogenes, blaKPC-2 positivos, provenientes de colonização (Ea5A) e de infecção (Ea7A) em pacientes internados na Unidade de Terapia Intensiva (UTI) de um mesmo hospital, além de análise comparativa com 2 cepas de E. aerogenes sequenciadas anteriormente e (3) realizar sequenciamento genômico de 2 isolados de E. cloacae, blaCTX-M-15 positivos, provenientes de infecções: Ec2A (secreção ocular) e Ec7A (hemocultura) em pacientes internados na Unidade de Terapia Intensiva neonatal (UTI neo) de um mesmo hospital, além de análise comparativa com cepas de E. cloacae sequenciadas anteriormente. Em ambas as espécies houve detecção de altas taxas para ESBL (41%) e carbapenemases (18% para E. cloacae e 88% para E. aerogenes), com identificação das variantes: blaTEM-1, blaCTX-M-15 e blaKPC-2. Os isolados apresentaram disseminação clonal, com E. cloacae blaCTX-M positivo disseminado na UTI neonatal e E. aerogenes blaKPC positivo na UTI e em outros setores do hospital. Foi visto que apesar dos isolados apresentarem relação clonal pela ERIC-PCR apresentaram diferentes perfis plasmidiais e de resistências, além de, diferentes genes de resistência. O sequenciamento genômico permitiu a detecção de: (1) vasto arsenal de genes de resistência a beta-lactâmicos, assim como, genes de resistência a outras classes de antimicrobianos, (2) diversos genes de virulência relacionados a adesinas fimbriais, sideróforos, cápsula e biofilme e (3) cinco tipos de sistemas de efluxo e quatro tipos de sistemas de secreção, relacionados pricipalmente à resistência e virulência, respectivamente. Em relação à análise comparativa dos genomas, foi visto que apesar de serem clones pela ERIC-PCR e provenientes do mesmo setor hospitalar, ambas as espécies apresentaram diferenças sutis no quantitativo de genes totais, genes de resistência, genes de virulência, sistemas de efluxo e secreção, além de características exclusivas de cada isolado. Também foi possível detectar que dentre os isolados de E. aerogenes, foi visto que o isolado proveniente de colonização (Ea5A), apresentou genes de virulência potenciais para estabelecer a infecção, além de elementos genéticos móveis capazes de transmitir diversos genes para outras bactérias presentes na microbiota entérica do paciente, o que reforça a importância da colonização no contexto de IRAS. Considerando os isolados de E. cloacae sequenciados genomicamente, o isolado proveniente de hemocultura (Ec7A) mostrou maior número de determinantes de resistência (beta-lactamases e sistemas de efluxo) que o isolado proveniente de secreção ocular, o que pode dificultar o tratamento e consequentemente favorecer a evolução para estágios mais severos como sepse e choque séptico. Os resultados aqui apresentados evidenciam o vasto arsenal de genes de resistência e virulência albergados pelos isolados de E. aerogenes e E. cloacae o que pode facilitar o estabelecimento da infecção e dificultar o tratamento.