O papel dualístico exercido por Enterococcus na natureza estimula a pesquisa dos fatores que determinam sua virulência. O objetivo desse estudo foi investigar a distribuição de genes envolvidos com fatores de virulência entre isolados de Enterococcus e sua correlação com a capacidade de formação de biofilme e confirmar a identificação de E. casseliflavus e E. gallinarum por PCRRFLP. Foram analisados 66 isolados clínicos e 70 alimentares quanto a presença dos genes gelE, esp, agg, ace e cylA por PCR e atividade de gelatinase e citolisina. Isolados clínicos apresentaram maior incidência de fatores de virulência quando comparados com alimentares, exceto para os genes gelE e ace. Em ambas amostragens houve a ocorrência de isolados positivos para os genes gelE e cylA, porém sem atividade enzimática, indicando a presença de genes silenciosos. A maioria dos isolados apresentou capacidade de formação de biofilme, entretanto não houve uma correlação entre os genes analisados e o fenótipo de formação de biofilme, porém é possível que o gene ace e gelE atuem como potencializadores na formação de biofilmes em Enterococcus. Para testar a técnica de PCR-RFLP, 32 e 20 isolados de E. gallinarum e E. casseliflavus, respectivamente, identifcados bioquimicamente foram avaliados. O fragmento de 661 bp correspondente a uma região conservada do 16S rDNA foi clivado com HinfI e 47% E. gallinarum e 25% E. casseliflavus apresentaram fragmentos de 589bp e 72bp, padrão esperado para o PCR-RFLP. Assim sendo, a PCR-RFLP mostrou ser uma ferramenta molecular útil na confirmação das espécies E. casseliflavus e E. gallinarum. / The dualistic role played by enterococci in the nature, encourages the study of virulence factors. The aim of this study was to investigate the distribution of genes involved in virulence among Enterococcus isolates and to correlate with biofilm formation ability and to confirm the identification of Enterococcus gallinarum and Enterococcus casseliflavus isolated from clinical and food samples by PCR-RFLP. Sixty six clinical and 70 food isolates were analyzed for the presence of gelE, esp, agg, ace and cylA genes by PCR and the gelatinase and cytolysin activities. Clinical isolates showed a higher incidence of virulence factors when compared to food isolates, except for gelE and ace genes. In both samples was observed the occurrence of isolates positive for gelE and cylA genes, but with no enzymatic activities, indicating the presence of silent genes. Most isolates showed ability to form biofilm, although there was no correlation between the presence of the genes and the phenotype of biofilm formation, but it is possible that ace and gelE genes perform as enhancers in biofilm formation in Enterococcus. To test the PCR-RFLP tecnhique, 32 and 20 strains identified by conventional biochemical exams as E. casseliflavus E. gallinarum, respectively, were were submitted to PCR amplification and digested with HinfI.. The DNA fragment of 661 bp corresponding to a conserved region of 16S rDNA was cleaved with HinfI and 47% and 25% of E. gallinarum and E. casseliflavus showed DNA fragments of 589 bp and 72 bp, expected for PCR-RFLP. Thus, PCR-RFLP proved to be a useful molecular tool for confirmation the E. casseliflavus and E. gallinarum species.

Submitted by Pós graduação Farmácia (ppgfar@ufba.br) on 2017-05-15T18:25:08Z No. of bitstreams: 1 dissertacao_-_corine_apos_defesa.pdf: 2446120 bytes, checksum: 2d4f0642ec9fb128a09a0d46117bb6bf (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barroso (pbarroso@ufba.br) on 2017-05-23T21:16:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dissertacao_-_corine_apos_defesa.pdf: 2446120 bytes, checksum: 2d4f0642ec9fb128a09a0d46117bb6bf (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-23T21:16:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_-_corine_apos_defesa.pdf: 2446120 bytes, checksum: 2d4f0642ec9fb128a09a0d46117bb6bf (MD5) / Cryptococcus spp. é uma levedura encapsulada oportunista ubíqua que causa infecções graves, que vão desde a colonização pulmonar assintomática até a meningite. Esse gênero possui duas espécies mais comumente associadas à infecção em humanos, Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, que diferem quanto à epidemiologia, virulência, manifestações clínicas e quanto à susceptibilidade a antifúngicos, este último considerado um patógeno emergente. A avaliação da sensibilidade antifúngica através da técnica de microdiluição em caldo é considerada padrão ouro, porém, apresenta alto custo, o que inviabiliza sua utilização na rotina laboratorial. A técnica de disco difusão pode se tornar uma alternativa a microdiluição em caldo visto sua simplicidade e baixo custo, tendo seu desempenho considerado adequado por diversos autores. Foram caracterizados fenotípica e genotípicamente 62 isolados de Cryptococcus spp. oriundos de casos de meningite na Bahia no período de 2006 a 2010, quanto a quimiotipagem, determinação de fatores de virulência, genotipagem e determinação de sensibilidade a antifúngicos. Também, o desempenho da técnica de disco difusão para determinação de susceptibilidade de Cryptococcus spp. foi avaliado. No total, 79% das leveduras pertenciam a espécie C. neoformans e 21% a espécie C. gattii. A avaliação genotípica mostrou 100% dos isolados de C. gattii pertencentes ao genótipo VGII e 98% dos C. neoformans ao VNI. A determinação do perfil de susceptibilidade mostrou isolados resistentes a fluconazol (4,8%), 5-flucitosina (1,6%) e anfotericina B (3,2%); a estratificação dos resultados de sensibilidade por espécie apontou diferenças significativas frente à azóis. Todos os isolados apresentaram pigmento melaniníco e cresceram a 37°C, porém, um isolado da espécie C. gattii foi urease negativo. Em 63% dos isolados foi encontrada alta atividade fosfolipásica, no entanto, em nenhum foi detectada a atividade proteolítica. A técnica de disco difusão mostrou um desempenho satisfatório com base nos resultados encontrados pelas análises de correlação e concordância entre critérios de interpretação, exceto para 5-flucitosina. Este é o primeiro trabalho a descrever os perfis de susceptibilidade antifúngica e molecular de isolados clínicos de Cryptococcus spp. na Bahia, Brasil. O elevado percentual de isolados de C. gattii pertencente ao genótipo VGII, bem como sua menor susceptibilidade aos antifúngicos torna importante o conhecimento da espécie envolvida na infecção criptocócica no nosso estado. A avaliação preliminar aqui apresentada tanto na avaliação do desempenho da disco difusão, como na distribuição e perfil de susceptibilidade das espécies de Cryptococcus spp. ressalva a importância de uma constante vigilância acerca das tendências da doença no nosso estado, bem como na utilização de testes alternativos confiáveis na determinação da sensibilidade dessas leveduras.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-27T18:21:42Z No. of bitstreams: 1 Rodrigo de Almeida Paes.pdf: 4542299 bytes, checksum: fd76ae56b0bcb0f4261dd34bfeb58f26 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-27T18:21:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigo de Almeida Paes.pdf: 4542299 bytes, checksum: fd76ae56b0bcb0f4261dd34bfeb58f26 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A esporotricose é a principal micose subcutânea na América Latina. O estado do Rio de Janeiro constitui uma importante área endêmica de esporotricose zoonótica onde diversas manifestações clínicas incomuns da doença são observadas. Os fatores que podem influenciar no desenvolvimento da esporotricose são o tamanho do inóculo, a profundidade da inoculação traumática, a imunidade do hospedeiro, a virulência e a termotolerância do fungo. Como não há informações disponíveis sobre os fatores de virulência dos isolados de Sporothrix da área endêmica de esporotricose no Rio de Janeiro estudamos 63 isolados obtidos de pacientes desta área endêmica e nove controles de outras localidades, onde a produção de melanina em diferentes condições, termotolerância, produção de protease e urease foram analisadas. Também foi estudada a composição antigênica de oito isolados, sendo sete da área endêmica de esporotricose no Rio de Janeiro e um controle. Os isolados do estudo compreendem as espécies S. brasiliensis (n=59), S. schenckii (n=12) e S. globosa (n=1). A análise de produção de melanina mostrou que, além da já conhecida melanina DHN, as três espécies do complexo Sporothrix estudadas são capazes de produzir outros dois tipos de melanina, utilizando L-DOPA ou L-tirosina como substrato. A produção destes três tipos de melanina foi bastante variado entre os diferentes isolados, sendo influenciada pelo meio de cultivo, temperatura, pH, fonte de carbono e tempo de incubação, sugerindo um controle multifatorial da melanogênese em Sporothrix. A melanina é produzida principalmente nos conídios e nas leveduras, mas quando L-DOPA é adicionado ao meio de cultivo, hifas também podem melanizar. Além disso, a melanina formada a partir de L-tirosina é um composto solúvel que pode recobrir as células fúngicas, sem polimerizar-se na parede celular ao contrário dos outros dois tipos de melanina, conferindo proteção contra luz ultravioleta, fármacos antifúngicos, reativos de oxigênio e de nitrogênio. Também foi verificado que a melanização das diferentes espécies de Sporothrix pode ser influenciada pelo contato com bactérias, principalmente as espécies Pantoea agglomerans e Pseudomonas aeruginosa, vivendo no mesmo ambiente que o fungo. A primeira bactéria inicialmente inibe o crescimento fúngico, porém com sua morte Sporothrix consegue crescer mais e produzir mais melanina do que quando cultivado isoladamente. Já a inibição do crescimento relacionada a P. aeruginosa é maior em S. brasiliensis do que em S. schenckii, o que pode estar relacionado à maior resistência desta espécie a fármacos antifúngicos. A produção de urease também foi diferenciada entre essas duas espécies, podendo a maior produção desta enzima por S. brasiliensis estar relacionada ao elevado número de casos de regressão espontânea desta micose no Rio de Janeiro. Não foi possível correlacionar nenhum fator de virulência, termotolerância ou antígenos de Sporothrix spp. com manifestações clínicas da esporotricose, sugerindo que estas sejam fruto de uma combinação de fatores envolvendo a virulência do fungo e o status imunológico do hospedeiro. / Sporotrichosis is the main subcutaneous mycosis in Latin America. Rio de Janeiro state is an important endemic area of zoonotic sporotrichosis, where several uncommon clinical manifestations of this disease are observed. Factors that may have a role in the development of sporotrichosis are the size of inoculum, the depth of traumatic inoculation, the host immune response status, virulence, and thermotolerance of the fungus. Up to now any information about virulence factors of Sporothrix strains from the endemic sporotrichosis area at Rio de Janeiro is described. We studied 63 strains obtained from patients of this endemic area and nine controls from other places, in which melanin production on different conditions, thermotolerance, protease and urease production wew analyzed. It has been also studied the antigenic composition of eight isolates, seven from the endemic sporotrichosis area at Rio de Janeiro and one control. Strains from this study include the species S. brasiliensis (n=59), S. schenckii (n=12), and S. globosa (n=1). Melanin production analysis showed that, besides the already known DHN melanin, the three studied species from the Sporothrix complex are able to produce other two types of melanin, using L-DOPA or L-tyrosine as substrate. The production of these three types of melanin was quite varied between the different strains, being affected by culture medium, temperature, pH, carbon source and incubation time, suggesting a multifactorial control of Sporothrix melanogenesis. Melanin is mainly produced on conidia and yeast-cells, but when L-DOPA is available on culture medium, hyphae can also melanize. Besides, L-tyrosine derived melanin is a soluble compound that can cover fungal cells, without polymerization on cell wall unlike the other two types of melanin, conferring protection against ultraviolet light, antifungal drugs, oxygen, and nitrogen oxidants. It was also observed that melanization of different Sporothrix species can be influenced by the contact with bacteria living in the same environment than the fungus, especially Pantoea agglomerans and Pseudomonas aeruginosa. Initially, the first bacterium inhibits fungal growth, however, after its death, Sporothrix is able to grow more intensly and to produce more melanin than when cultured alone. The P. aeruginosa-related growth inhibition is higher in S. brasiliensis rather than in S. schenckii, which can be related to the higher resistance of this species to antifungal drugs. Urease production was also differentiated between these two species, and the higher expression of this enzyme by S. brasiliensis might be related to the high number of spontaneous regression cases of this mycosis in Rio de Janeiro. It was not possible to correlate any virulence factor, thermotolerance or antigens of Sporothrix spp. with the clinical manifestations of sporotrichosis, suggesting that they are the result of a combination of factors involving the virulence of the fungus and host immunologic status.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-12T12:15:01Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1816313 bytes, checksum: c4290f186027bed900c1adff1f3a742c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-12T12:15:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1816313 bytes, checksum: c4290f186027bed900c1adff1f3a742c (MD5) Previous issue date: 2001-12-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A identificação morfo-tintorial e bioquímica de 21 isolados de Klebsiella provenientes de amostras de dietas enterais artesanais revelou que 15 deles pertenciam a espécie K. pneumoniae e seis a K. oxytoca. A sorotipagem de K. pneumoniae identificou cinco isolados do sorotipo K5, um do sorotipo K4 e os demais não foram sorotipados pelos antissoros dos grupos K1 a K6. Os resultados das análises por RAPD e da região espaçadora 16S-23S do rDNA mostraram um polimorfismo acentuado entre os isolados de K. pneumoniae e um polimorfismo menor entre os isolados de K. oxytoca. O fragmento de DNA, de 1420 pb, gerado pela amplificação da região 16S do rDNA foi digerido por oito endonucleases de restrição e resultou padrões de RFLP idênticos para todos os isolados. As análises por RAPD e por PCR da região espaçadora do rDNA mostraram-se apropriadas para avaliar a diversidade genética entre estes isolados. A resistência a pelo menos dois antibióticos foi verificada em todos os isolados de Klebsiella e maior prevalência de resistência foi verificada aos antibióticos amoxacilina e ampicilina. Os isolados que apresentaram resistência a um maior número de antibióticos pertenciam a espécie K. pneumoniae provenientes, principalmente, do hospital B. A produção de β-lactamase de espectro ampliado não foi verificada em nenhum dos isolados avaliados. Observou-se que a freqüência de colônias mucóides entre as estirpes foi baixa (23,8%) e que a produção de cápsula foi verificada, microscopicamente, somente nas estirpes, cujas colônias apresentaram aspecto mucóide. K. pneumoniae apresentou maior adesão em células Caco-2 e HEp-2 enquanto K. oxytoca apresentou adesão expressiva apenas em células Caco-2. Porém, a invasão de K. pneumoniae foi constatada nas três linhagens de células eucarióticas, apesar dos índices terem sido baixos em relação aos de adesão. Somente os isolados da espécie K. pneumoniae apresentaram adesão e invasão nas células HEp-2. De uma forma geral, os índices de adesão e invasão foram maiores entre os isolados do hospital A. Nas condições usadas neste estudo, os isolados de Klebsiella não apresentaram atividade hemolítica, de fosfolipase e produção de enterotoxina termoestável, assim como do sideróforo aerobactina. A inoculação intraperitoneal em camundongos sadios e imunodeprimidos com estirpes selecionadas de Klebsiella para a determinação da DL 50 não promoveu a morte dos animais, até uma concentração de 10 7 células por inoculação. Quando camundongos foram alimentados com dietas enterais ou ração não se observou a presença de colônias típicas de Klebsiella na análise de amostras do fígado, baço, coração, rim e pulmão dos animais. Entretanto, em amostras de fígado e pulmão dos camundongos dos grupos que receberam drogas imunodepressoras e, ou antimicrobiana, alimentados ou não com dieta enteral contaminada com 6 x 10 9 UFC/animal de Klebsiella, a presença de colônias típicas foi constatada. Em animais que receberam somente a dieta contaminada, a translocação de Klebsiella também foi observada. A análise do perfil genético, por RAPD, de isolados recuperados desses órgãos revelou similaridades com os padrões de bandas de DNA das estirpes de Klebsiella administradas aos animais, via oral. A presença de Klebsiella no fígado de camundongos que não receberam fonte exógena de Klebsiella, mas que receberam a combinação de medicamentos, sugere que estirpes da microbiota intestinal autóctone foram capazes de translocar quando houve uma depressão do sistema imunológico e uma descontaminação seletiva, promovidas pelo corticóide e antibiótico, respectivamente. A colonização por Klebsiella, proveniente das dietas enterais, no intestino também foi facilitada quando medicamentos imunodepressores e antimicrobianos foram utilizados. / Biochemical testing and microscopic observations of stained cells were used to identify 21 Klebsiella isolates from hospital enteral formulae. Fifteen of the isolates were identified as K. pneumoniae and six as K. oxytoca. Serotyping of K. pneumoniae identified five isolates belonging to serological group K5 and one to serological group K4 while the rest could not be identified using the antisera in serological groups K1 through K6. Results of RAPD analysis and of the 16S-23S rDNA intergenic spacer revealed accentuated polymorphism among the K. pneumoniae isolates and a lesser polymorphism among the K. oxytoca isolates. The 1420 bp DNA fragment generated by amplification of the 16S rDNA region digested with eight restriction endonucleases resulted in identical RFLP patterns for all isolates. RAPD and PCR analyses of the rDNA intergenic spacer were shown to be appropriate tools for evaluating genetic diversity among the isolates. Resistance to at least two antibiotics was observed in all Klebsiella isolates, with greater prevalence of resistance to amoxacillin and ampicillin. K. pneumoniae isolates presented resistance to the greatest number of antibiotics, xiiespecially those isolated from Hospital B. Broad-spectrum β-lactamase production was not observed in any isolate. Presence of mucous was infrequent (6.7%) and capsule production was only observed among the isolates that presented moderate to intense mucous production. Adhesion and invasion were observed in Caco-2 and HEp-2 cells, but not in VERO cells. Only K. pneumoniae isolates adhered to and invaded HEp-2 cells. No hemolysin activity, phospholipase activity, thermostable enterotoxin production or aerobactin siderophore production were observed under the conditions used in this study. Selected Klebsiella isolates were inoculated intraperitoneally in healthy and immunodepressed mice to determine LD 50 but did not prove lethal, demonstrating the avirulence of the isolates. When mice were given enteral formula or animal feed, no typical Klebsiella colonies were observed in liver, spleen, heart, and kidney or lung samples. However, typical colonies were observed in liver and lung samples from animals that received immunodepressant and/or antimicrobial drugs, regardless of whether or not the animals received enteral formula contaminated with 6 x 10 9 CFU Klebsiella per animal. In animals that only received the contaminated formula, translocation was also observed. Genetic profile analysis of isolates retrieved from these organs by RAPD revealed similarities to the DNA band patterns of the Klebsiella strains administered orally to the animals, confirming pathogen translocation. Presence of Klebsiella in livers of mice that did not receive an external source of Klebsiella but that received a combination of medications suggests that autochthonous intestinal microbial strains are able to translocate when the immunological system is depressed as well as a selective decontamination promoted by corticoids and antibiotics, respectively. Intestinal colonization by Klebsiella isolated from enteral formula was also immunodepressant and antimicrobial medications were used.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-02-21T13:02:13Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2137513 bytes, checksum: 7725910b3e0d21458b72ca20693db1f2 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-21T13:02:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2137513 bytes, checksum: 7725910b3e0d21458b72ca20693db1f2 (MD5) Previous issue date: 2017-08-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Listeria monocytogenes é uma bactéria Gram-positiva comumente encontrada no ambiente de processamento de alimentos, produtos in natura e processados. Esse patógeno é reconhecido como o agente causador da listeriose, uma doença grave que afeta principalmente indivíduos de grupos de risco. O presente estudo teve como objetivo caracterizar isolados de L. monocytogenes recuperados no Brasil a partir de fontes clínicas, ambiente de processamento de produtos cárneos, e de carne bovina. Os perfis de susceptibilidade aos antibióticos, genes de virulência, diversidade de sorotipos, capacidade de invadir, replicar e se disseminar em células hospedeiras, bem como a morte celular e a produção de IFN induzidas por isolados de L. monocytogenes foram caracterizados. Todos os isolados apresentaram sensibilidade aos antimicrobianos utilizados para o tratamento da listeriose, no entanto a maioria apresentou resistência ou resistência intermediária à clindamicina e à oxacilina. A sorotipagem molecular produziu resultados contraditórios para sete isolados do sorotipo 1/2a, que foram positivos para o gene lmo1118 e exibiram o perfil IIc (sorotipos 1/2c ou 3c). Além disso, quinze isolados do sorotipo 4b amplificaram o gene lmo0737, e foram classificados como atipico IVb-v1. O potencial de invadir células Caco-2 foi significativamente afetado pela presença de codons de parada prematuros (PMSCs) no gene inlA do sorotipo 1/2c (p < 0,005). As cepas variaram amplamente em seus tempos de duplicação intracelular em celulas Caco- 2, e não houve relação clara entre sorotipo ou fonte. Foram observadas diferenças significativas entre os sorotipos com relação a disseminação em células Caco-2; isolados do sorotipo 1/2a apresentaram defeito na disseminação celular, enquanto isolados do sorotipo 1/2b apresentaram maior habilidade de disseminação celular (p <0,0001). Além disso, identificamos três isolados de sorotipo 4b que se disseminaram em uma área aproximadamente duas vezes maior que a cepa de referência 10403S. Não foram observadas tendências quanto aos tempos duplicação intracelular em iBMDM, comparando fontes de isolamento e sorotipos. Os resultados indicam que a replicação intracelular é determinada pelas características genotípicas de cada isolado. A morte celular induzida por alguns isolados após a infecção de iBMDM foi dependente da enzima Caspase 1, indicando que eles induzem morte celular por piroptose. Alguns isolados também induziram alta produção de INF pela linhagem celular iBMDM. Usando macrófagos primários, foi revelado que a produção de INF foi sempre STING dependente, em alguns casos totalmente cGAS independente, parcialmente cGAS dependente, ou mesmo cGAS dependente. Este trabalho caracterizou o perfil patogênico de isolados de L. monocytogenes, permitindo uma melhor compreensão dos mecanismos de infectividade desse patógeno, e levando a uma análise mais profunda dos genomas e outras abordagens experimentais para revelar os mecanismos associados aos fenótipos de virulência mais extremos. / Listeria monocytogenes is a Gram-positive bacterium commonly isolated from food processing environment, raw and processed foods. It is recognized as the causative agent of listeriosis, a serious disease that affects mainly individuals from risk groups. The present study aimed to characterize L. monocytogenes isolates recovered in Brazil from clinical sources, meat processing environmental and beef. Antibiotic resistance profiles, virulence genes, serotype diversity, ability to invade, replicate and spread in host cells, as well as cell death and IFN production induced by L. monocytogenes isolates were characterized. All isolates presented sensitivity to antimicrobials used for listeriosis treatment while most of them presented resistance or intermediate resistance to clindamycin and oxacillin. Molecular serogrouping produced contradictory results for seven isolated from serotype 1/2a, which were positive for the gene lmo1118 and exhibited the profile IIc (serotypes 1/2c or 3c). In addition, fifteen isolates from serotype 4b amplified the gene lmo0737, being classified as atypical IVb-v1. The potential to invade Caco-2 cells was significantly affected by the presence of premature stop codons (PMSCs) in inlA gene of isolates from serotype 1/2c (p < 0.005). The isolates varied widely in their intracellular doubling times, and there was no clear relationship between serotype or source. There were significant differences between serotypes for cell-to-cell spread in Caco-2 cells, isolates from serotype 1/2a were generally impaired in their spreading ability while most os isolates from serotype 1/2b exhibited increased spreading ability (p < 0.0001). In addition, we identified three isolates from serotype 4b that spread nearly twice as much as the reference strain 10403S. No trends were observed regarding intracellular doubling times in iBMDM by comparing sources and serotypes; based on these results, intracellular growth seems to be determined by genetic characteristics of each strain. The cell death induced by some isolates after infection of iBMDM was Caspase 1 dependent, indicating that they induce pyroptosis. Some of these isolates also induced high INF production by iBMDM. Using primary macrophages, it was revealed that INF production was always STING dependent, and in some cases it is fully cGAS independent, partially cGAS dependent, or even mostly cGAS dependent. We have characterized L. monocytogenes isolates that could provide novel insight into infectivity of this pathogen that may not be revealed by studying common laboratory strains, demanding further analysis of their genomes and other experimental approaches to reveal the mechanisms associated with the most extreme phenotypes exhibited.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Howard Hughes Medical Institute (HHMI) / World Health Organization (WHO) / O tema deste trabalho é estudar alguns fatores importantes de patogenicidade de fungos do Filo Ascomycota e sua correlação com padrões da dinâmica da expressão gênica na perspectiva da Evolução Molecular. Decidimos concentrar nossos esforços iniciais nas questões de sistemática deste grupo, uma vez que a sistemática do Filo Ascomycota, tal como inferida por métodos atuais, apresenta politomias basais, indicando portanto, controvérsias na reconstrução dos eventos de radiação evolutiva de seus principais taxa. A análise molecular descrita neste trabalho sugere a existência de dois grupos na posição basal entre os ascomicetos filamentosos: os Discomycetes e os Pyrenomycetes. Foram propostos dois cenários para os principais eventos de radiação daquele filo, o primeiro localizando os principais eventos na era Proterozóica e o segundo, na era Paleozóica. Para tanto, geramos um alinhamento de 166 seqüências da subunidade menor do gene ribossômico 18S (SSU rDNA 18S), representativas de todos os filos de Fungi e utilizamos como base para uma análise filogenética Bayesiana. A filogenia sugeriu que os Discomycetes são o grupo basal dentre os ascomicetos filamentosos e provavelmente mantém caracteres ancestrais visto que seus representantes estão espalhados entre outros grupos de fungos filamentosos. Verificamos que a taxa evolutiva de heterogeneidade do filo Ascomycota rejeita a hipótese nula de um relógio molecular global. Para datar os principais eventos da radiação deste filo, foi utilizado o método “penalized likelihood”, e para calibração, foram incluídos um fóssil de Pyrenomycete datado em 400 Ma e considerados dois diferentes cenários encontrados na literatura, um com uma data estimada de 1.576 Ma para a separação entre planta-animal-fungo e outro, com data estimada de 965 Ma para a separação entre animal-fungo. Estimativas baseadas no primeiro cenário são mais antigas do que datas propostas em estudos anteriores baseados em seqüências do rDNA 18S, mas corroboram estimativas baseadas em análises de multiproteínas, sugerindo que a radiação dos principais grupos de Ascomycota ocorreu na era Proterozóica. Durante o processo evolutivo, fatores de patogenicidade surgiram dentro do filo Ascomycota e são encontrados em fungos dos grupos Pezizomycetes, Archiascomycetes e na Ordem Saccharomycetales. Candida albicans, o patógeno humano oportunista mais frequentemente isolado, é um representante desta ordem. Sua capacidade de formar biofilmes confere propriedades importantes para processos infectivos e colonização de diversos substratos, sendo ainda muito efetiva na resistência às drogas antifúngicas. A descrição e dinâmica dos componentes moleculares da matriz do biofilme, associados com as mudanças no metabolismo celular, poderiam explicar, pelo menos em parte, as propriedades em macro escala desta importante estrutura. Utilizando espectrometria de massa identificamos a enolase como um dos principais componentes da matriz do biofilme de Candida. Ainda, a presença de enolase na superfície celular foi confirmada por imunofluorescência. Caracteristicamente, por ser uma enzima citosólica que participa da via glicolítica, a enolase não possui sinal de secreção, no entanto, verificamos que a proteína é possivelmente glicosilada e fosforilada. Análises de degradação e recaptação mostraram que a proteína é degradada a 37o C e não é recaptada pela parede celular, sugerindo que exista uma via de secreção não-clássica por onde a enolase possa ser secretada para o biofilme e para a superfície celular sem ser degradada no meio externo. A expressão da enolase (ENO1) e das enzimas da via glicolítica como a hexoquinase, piruvatoquinase e aldolase (HXK1, HXK2, PYK1 e FBA1) de 14 diferentes linhagens de C. albicans que foram cultivadas em condições de crescimento como biofilme, microaerofilia, hifas e leveduras, não mostraram variação significativa, sugerindo que a condição de crescimento não afeta a expressão desses genes nas diferentes linhagens analisadas. Os genes ALS3 e HWP1 codificadores de adesinas tiveram a expressão diminuída em pelo menos 4 vezes em resposta a diminuição da expressão dos genes TEC1 e BCR1 que controlam a formação biofilme. Este tipo de regulação sugere que mecanismos de “feedforward” possam estar presentes nesta rede regulatória. A principal adesina da parede celular das hifas é Hwp1p, necessária para a formação apropriada de hifas e virulência em candidíase sistêmica. Nós descrevemos um novo alelo de HWP1 (HWP1-2), que não possui três importantes regiões, em comparação com o alelo descrito anteriormente (HWP1-1). As regiões 1 e 2 consistem de 10 aminoácidos repetidos em seqüência, importantes para a conformação funcional de cadeias peptídicas e a adesão das células de C. albicans ao epitélio de mamíferos. A região 3 é composta de 34 aminoácidos que promovem a ligação cruzada com outras proteínas na superfície de C. albicans. As linhagens homozigota para HWP1-2 (L757) e heterozigota (L296) têm níveis significativamente mais baixos na expressão de HWP1 durante a formação de hifas e biofilme, em comparação com a linhagem SC5314 (homozigota para HWP1-1). L757 teve crescimento na forma de hifa reduzido (40,4%) e diminuída a formação de biofilme (90,8%), sugerindo que a Hwp1-2p é menos eficiente para manter a adesão célula-célula e célula-superfície durante a formação do biofilme. Em conjunto nossos resultados mostram que as propriedades patogênicas de fungos não podem ser seriamente estudadas sem uma sólida base em sistemática molecular apoiada, por sua vez, nos métodos explicitamente quantitativos das áreas de Estatística, Teoria de Sistemas Dinâmicos e algoritmos computacionais. / The aim of this work is the study of factors that are important for the pathogenicity of the main fungi within phylum Ascomycota and its correlation with expression patterns on the perspective of Molecular Evolution. We decided to elucidate questions concerning the systematics of this group, since the actual systematics of the Ascomycota phylum is depicted as basal polytomies. The molecular analysis described in this work indicates two groups in the basal position among filamentous ascomycetes: Discomycetes and Pyrenoycetes. Also, two scenarios are proposed for the major radiation events within that phylum, one places the major events in the Proterozoic era and the other, in the Paleozoic era. Accordingly, we generated a dataset of 166 small subunit (18S) rDNA sequences, representative of all groups of Fungi and used as input in a Bayesian phylogenetic analysis. This phylogeny suggests that Discomycetes are a basal group of filamentous ascomycetes and probably maintain ancestor characters since their representatives are intermingled among other filamentous fungi. Also, we show that the evolutionary rate heterogeneity within Ascomycota rejects the null hypothesis of a global molecular clock. To estimates the dates of major radiation events, we used the penalized likelihood method and for calibration we included a 400 My Pyrenomycete fossil. Two distinct scenarios were considered, being, one with an estimated date of 1.576 Myr for the plant–animal–fungus split and the other with an estimated date of 965 Myr for the animal–fungus split. Estimates under the first scenario are older than dates proposed in previous studies based on small subunit rDNA sequences but support estimates based on multiprotein analysis, suggesting that the radiation of the major Ascomycota groups occurred into the Proterozoic era. Pathogenic factors have evolved within Ascomycota and can be found in fungi of Orders Pezizomycetes, Archiascomycetes and Saccharomycetales. Candida albicans, the most frequently isolated human opportunistic pathogen, is representative of this Order. Its ability to form biofilms is a very important factor during the infection process, colonization of several solid substrates and confers significant resistance to antifungal drugs. Components of the biofilm matrix associated with changes in the cellular metabolism could, at least in part, explain its macro-scale properties. We identified that enolase is a major component of the Candida biofilm matrix by using mass espectrometry and confirmed its presence in the cell surface by immunefluorescence. Characteristically of cytosolic enzymes that participate of the glycolytic pathway, enolase does not possess signal for secretion, however, we verified that this protein can be putatively glycosylated and phosphorylated. Degradation and reuptake analyses of enolase demonstrated that it is degraded at 37o C and it is not reuptaked by the cell wall, which suggests that there is a non-classical secretory pathway by where enolase can be sent to the biofilm matrix and the cell surface protected against the external medium degradation. No significant variation in the expression of enolase (ENO1) and glycolytic pathway enzymes hexokinase, pyruvate kinase and aldolase (HXK1, HXK2, PYK1 and FBA1) were observed among 14 different lineages of C. albicans grown in biofilm, microaerophilia, hyphal induced and yeast induced conditions. Adhesin encoding genes ALS3 and HWP1 showed diminished expression levels (at least 4-fold) in response to the down regulation of biofilm control genes TEC1 and BCR1. This suggests that expression levels of ALS3 and HWP1 can be regulated by feedforward mechanisms. The major C. albicans hyphae cell wall adhesin, Hwp1p, is necessary for hyphae formation and virulence in systemic candidiasis. We described a novel HWP1 allele (HWP1-2) lacking three important regions as compared to the previously described allele, HWP1-1. Regions 1 and 2 consist of 10 amino acid repeats important for functional conformation of peptide chains and attachment of C. albicans cells to the mammalian epithelia. Region 3 consists of 34 amino acid that promote the cross-linking with other proteins on C. albicans surface. The HWP1-2 homozygous (L757) and heterozygous (L296) strains have significantly lower levels of HWP1 expression during hyphal growth and biofilm formation compared to the strain SC5314 (HWP1-1). L757 has reduced hyphal growth (40.4%) and impaired biofilm formation (90.8%), suggesting that the HWP1-2p is less efficient to maintain cell-to-cell and cell-to-surface adhesion during biofilm formation. Our results clearly show that any study of fungal pathogenicity factors have to be solidly based on molecular systematics, which in turn, has to be grounded on the explicitly quantitative methods of Statistics, Dynamic Systems Theory and computational algorithms. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:26Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00231.pdf: 1784115 bytes, checksum: 4dcd9596246858abd2e260995c2c0ab4 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introdução: Candida rugosa é um patógeno emergente que merece destaque pela sua maior ocorrência em países da América Latina. Esta levedura tem o potencial de colonizar e causar infecções de corrente sanguínea no homem, bem como de apresentar resistência a diversos antifúngicos, principalmente aos azólicos. Objetivos: comparar caracteres fenotípicos, como atributos de virulência e sensibilidade antifúngica, além de realizar identificação e tipagem molecular de isolados clínicos de C. rugosa obtidos de pacientes que desenvolveram candidemia, com cepas isoladas de pacientes que foram somente colonizados por esta espécie, sem desfecho de candidemia na internação. Também foi de nosso interesse avaliar tais diferenças entre as cepas provenientes de pacientes internados ao longo de dois períodos avaliados: 1995/96 e 2001/02. Material e Métodos: As cepas foram caracterizadas fenotipicamente quanto a fatores de virulência, incluindo a produção de enzimas extracelulares (proteinase, fosfolipase e lipase) e a formação de biofilme. Foram realizados teste de susceptibilidade a cinco antifúngicos pelo método de microdiluição em caldo, sendo eles: anfotericina B, fluconazol, voriconazol, caspofungina e anidulafungina. Para confirmação de espécie e avaliação de variabilidade genotípica, foram utilizadas as técnicas moleculares de RAPD, microssatélite e sequenciamento da região ITS (rRNA). Resultados: Observou-se grande variabilidade nos resultados referentes à produção de enzimas hidrolíticas. A população foi classificada, no geral, como baixa produtora de proteinase, não produtora de fosfolipase e baixa e média produtora de biofilme. A produção de lipase foi o único fator de virulência expresso de maneira considerável pelos isolados clínicos, destacando-se a alta produção desta enzima por cepas isoladas de sangue, sugerindo a importância da mesma no estabelecimento de infecção por C. rugosa. Com relação à sensibilidade aos antifúngicos, os isolados mostraram-se sensíveis a todas as drogas, exceto ao fluconazol. A avaliação dos resultados obtidos por 3 diferentes métodos moleculares demonstrou alto relacionamento filogenético entre os isolados clínicos, exceto pela cepa de referência a qual foi sempre posicionada em diferente cluster. A análise genotípica revelou similaridade de 90,5% entre todos os isolados, e de 87% para a cepa de referência ATCC1051 pela técnica de RAPD, e uma similaridade de 92% entre os isolados clínicos e de 86,5% para a cepa controle pelo método de microssatélite. O seqüenciamento da região ITS identificou todos os isolados como sendo C. rugosa, apresentando uma identidade que variou de 89% a 93% para os isolados clínicos, e 99% para a cepa de referência ATCC10571. Conclusões: Não foi possível estabelecer uma correlação direta entre a expressão de todos os fatores fenotípicos avaliados e o desfecho clínico dos pacientes, embora haja evidências importantes da atividade de lipase influenciando candidemia por C. rugosa. Sugere-se que houve uma disseminação clonal dos isolados de C. rugosa no ambiente hospitalar avaliado ao longo de vários anos. Adicionalmente, as diferenças genéticas encontradas entre os isolados clínicos e a cepa de referência ATCC10571, juntamente com algumas diferenças fenotípicas observadas exclusivamente nesta cepa, tais como alta produção de biofilme, macromorfologia acentuadamente rugosa e baixa atividade de lipase, indicam a possibilidade de heterogeneidade do táxon C. rugosa. / Introduction: Candida rugosa is an emergent pathogen recognized by its higher occurrence in Latin American countries. This yeast has the ability to colonize and cause human bloodstream infections as well as to show resistance to several antifungal drugs, specifically to azoles. Objectives: To compare phenotypic properties such as virulence attributes and antifungal susceptibility, as well as to perform molecular identification and typing of C. rugosa clinical isolates obtained from patients who were either colonized or developed candidemia due to this species during the hospitalization period. We were also interested in evaluating such differences among strains isolated across two different periods: 1995/96 and 2001/02. Material and Methods: The strains were phenotypically characterized according to virulence factors, including the production of extra cellular enzymes (protease, phospholipase and lipase) and biofilm formation. We performed susceptibility testing to 5 antifungal drugs by using broth microdilution: amphotericin B, fluconazole, voriconazole, caspofungin and anidulafungin. To confirm identification to the species level and evaluate genetic variability, we have employed RAPD, microsatelite and rDNA ITS region sequencing. Results: Phenotypic properties varied considerably among the isolates, specifically regarding to hydrolytic enzymes production. Most of the isolates were low proteinase producers. The strains were phospholipase negative and showed a not very expressive biofilm formation in general. Nevertheless, lipase production was the only virulence factor considerably expressed by the clinical isolates, specifically by blood strains, suggesting the importance of this attribute in C. rugosa infection. The strains were sensitive to all the antifungal drugs tested, except fluconazole. The clinical isolates were highly related as determined by 3 different methods. However the control strain ATCC10571 was considered genotipically very different Our isolates were 90.5% similar among them and 87% similar to C. rugosa control strain as determined by RAPD, and 92% similar among them and 86,5% similar to ATCC10571, as determined by microsatelite. All the isolates were identified as C. rugosa by ITS region sequencing. The percentage of similarity ranged from 89% to 93% for the clinical isolates, and 99% to C. rugosa ATCC10571. Conclusions: It was not possible to establish a direct relationship between the expression of all virulence properties and patients clinical outcomes. However there is mounting evidence that lipase activity influences candidemia due to C. rugosa. It is possible that clonal dissemination in the hospital environment have occurred throughout several years. In addition, the genetic differences found between our isolates C. rugosa control strain ATCC10571, together with the phenotypic differences observed, such as higher biofilm formation and rough colony morphology, as well as low lipase activity for this control strain, suggest the genetic heterogeneity among the taxon C. rugosa. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-08-26T17:15:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 60.pdf: 1087420 bytes, checksum: d43c3b6da28a66b2ee5f2ae5c11fc7ae (MD5) Previous issue date: 2010 / Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) são patógenos emergentes associados a surtos de meningite, enterocolite necrosante e septicemia em neonatos em diversos países. A taxa de mortalidade relatada varia de 40 a 80% e os sobreviventes apresentam seqüelas neurológicas severas. O desenvolvimento da infecção está associado ao consumo de fórmulas infantis desidratadas. As metodologias atualmente disponíveis para o isolamento de Cronobacter spp. apresentam discrepâncias e a identificação bioquímica não é esclarecedora. Assim, torna-se necessário que metodologias confiáveis para o isolamento e identificação desses micro-organismos estejam disponíveis. Outro ponto ainda não esclarecido são os mecanismos de virulência utilizados por esses patógenos para o desenvolvimento de infecções em humanos. Os objetivos desse estudo foram o desenvolvimento de um método rápido e eficiente para a identificação de Cronobacter spp., a avaliação do perfil de resistência a antimicrobianos e a avaliação da presença de alguns fatores de virulência. Foram utilizadas inicialmente cepas de referência de Cronobacter spp e 37 isolados previamente identificados como pertencentes ao gênero. O novo protocolo foi considerado 100% sensível e específico quando comparado aos demais métodos utilizados, indicando sua utlidade. O estudo de fatores de virulência revelou que Cronobacter spp. tem desenvolvido resistência aos β-lactâmicos e cefalosporinas, é capaz de formar cápsula, biofilme, e apresentar atividade de protease e atividade hemolítica. Nesse estudo relata-se pela primeira vez a presença de hemaglutininas associadas a pili tipo 3, enquanto algumas cepas apresentaram hemaglutininas associadas a pili tipo 1. Também foi demonstrada a atividade citotóxica em células Vero e a capacidade de invasão dessas células por Cronobacter spp. Os resultados desse estudo sugerem que todas as espécies do gênero Cronobacter apresentam potencial patogênico e que autoridades de saúde pública, produtores de alimentos e pessoas responsáveis pelo cuidado de indivíduos que fazem parte dos grupos de risco devem dedicar especial atenção ao controle de ambientes e à qualidade microbiológica de produtos destinados a esses grupos de modo a minimizar o risco de infecção por esses micro-organismos. / Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) is an emerging foodborne pathogen associated with outbreaks of meningitis, necrotizing enterocolitis and sepsis in neonates in different countries. The reported mortality rate ranges from 40 to 80% and the survivors present severe neurological sequela. Development of the infection is associated with the consumption of powdered infant formula. The available methodologies employed for the isolation of Cronobacter spp. lack the necessary specificity and the biochemical identification remains non-conclusive. For these reasons, it is necessary to develop reliable methodologies for the isolation and identification of these microorganisms. Another issue still to be clarified refers to the virulence mechanisms associated with human infections. The objectives of this study were to develop a rapid and efficient method to identify Cronobacter, to evaluate the antimicrobial resistance of the strains, and to evaluate the presence of some virulence factors. Initially, reference strains of Cronobacter, and 37 isolates that had been previously identified as members of the genus were used. The proposed protocol showed 100% sensitivity and specificity when compared to the other methods used, indicating its usefulness. Studies on virulence factors revealed that Cronobacter spp. has developed resistance to β-lactams and cephalosporins, is able to form capsule, biofilm, and presents protease and hemolytic activities. This study reports, for the first time in literature, the presence of hemagglutinins associated with type 3 pili and it was also shown that some strains presented previously described hemagglutinins associated with type 1 pili. Cytotoxic activity in Vero cells and the invasiveness of these cells by Cronobacter spp were also demonstrated. The results of this study suggest that all species of the genus Cronobacter have pathogenic potential and public health authorities, food producers and caregivers should pay careful attention to issues associated with environment control and with the microbial quality of the products associated with the risk groups in order to minimize the risk of infection with these microorganisms.

Este trabalho recebeu a Menção Honrosa no Prêmio Capes de Teses 2014 / Made available in DSpace on 2014-09-09T12:30:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 16.pdf: 6304996 bytes, checksum: 71c341f48f8e1ace48b22de15c0ccb89 (MD5) Previous issue date: 2013 / Acinetobacter baumannii é um patógeno oportunista com crescente importância em infecções relacionadas a assistência em saúde. No Brasil é particularmente problemático devido à sua alta prevalência e multirresistência, com as carbapenemases tipo OXA representando o principal mecanismo responsável por esta resistência. Esse trabalho teve como objetivo determinar a diversidade genética, caracterizar fenotípica e molecularmente a resistência a antimicrobianos e avaliar fatores de virulência em Acinetobacter baumannii isolados de 10 hospitais públicos e privados no Rio de Janeiro no período de 2005 a 2007. Durante este período foram estudados 141 isolados de A. baumannii coletados de pacientes internados em UTIs ou enfermarias cirúrgicas. A identificação da espécie foi confirmada através da detecção do gene intrínseco blaOXA-51.Os 110 isolados de A. baumannii resistentes ao imipenem apresentaram perfil de multirresistência com taxas superiores a 98,2% para 8 dos 10 antimicrobianos testados e 98(87,3%) produziram a carbapenemase OXA-23. Não houve produto de amplificação para os genes blaOXA-24, blaOXA-58, blaIMP, blaVIM e Int1 pela técnica de PCR. As drogas com atividade in vitro foram a polimixina B e tigeciclina. Observou-se uma diversidade clonal, com a presença de 5 genótipos tipados por PFGE, com prevalência dos genótipos A (71,8%) e B(22,7%), presente em 7 e 5 hospitais, respectivamente. Dentre os 96 isolados produtores de OXA-23, fori selecionada uma cepa representativa de cada genótipo que foram submetidos a métodos de tipagem baseados em sequenciamento... / Acinetobacter baumannii is an opportunistic pathogen with increasing importance in hospital infections. In Brazil, it is particularly problematic because of its high prevalence and multidrug resistance, with the OXA-type carbapenemases representing the main mechanism responsible for such resistance. This study aimed to determine the genetic diversity, as well as phenotypic and molecular characterization of antimicrobial resistance and evaluation of virulence factors in Acinetobacter baumannii isolated from 10 public and private hospitals in Rio de Janeiro from 2005 to 2007. During this period 141 isolates of A. baumannii collected from patients admitted to ICUs or surgical wards have been studied. Species identification has been confirmed by detection of gene intrinsic blaOXA-51. The 110 isolates of A. baumannii resistant to imipenem showed multidrug resistance profile with rates above 98.2% for 8 of the 10 antibiotics tested and 98 (87.3%) produced the carbapenemase OXA-23. There was no amplification product for genes blaOXA-24, blaOXA-58, blaIMP, blaVIM and Int1 by PCR. The drugs with in vitro activity were polymyxin B and tigecycline. There was a clonal diversity, the presence of five genotypes typed by PFGE, with a prevalence of genotypes A (71.8%) and B (22.7%), present in 7 and 5 hospitals, respectively. Among the 96 strains producing OXA-23, one representative for each genotype that were subjected to typing methods based on sequencing was selected. By MLST (related to the database Oxford) four new STs were detected: ST131, ST132, ST133 and ST134 and when using the MLST-IP (developed by Institut Pasteur) the ST79, ST15 and two new allelic profiles were detected. Four SGs (SG1, SG4 and two new profiles) have been identified, allowing the association of 70% of isolates with the European Clone II. Sequencing of the blaOXA-51-like gene revealed the presence of blaOXA-66, blaOXA-95 and blaOXA-132. The blaOXA-23 gene was consistently found associated with the transposon Tn2006 and was chromosomally encoded in all isolates. Of 31 isolates susceptible to imipenem, 5 showed the blaOXA-23 gene and the insertion sequence ISAba1. However, the association of this sequence to the gene blaOXA-23 was detected only in isolates resistant to imipenem used as controls. The ISAba4 insertion sequence was not found in any isolated. These isolates were susceptible to imipenem and meropenem, with MICs ε 4 mg / mL for both antimicrobials. These isolates producing blaOXA-23 have been grouped into four distinct genotypes (B, C, G and I). Most isolates included in this study had plasmid (83.7%), with profiles ranging from 1 to 4. In search of biofilm production by colorimetric assay using crystal violet it was possible to observe the production of biofilm in 96.5% of isolates. Two representative isolates of the prevalent genotypes were evaluated for the degree of association at monolayer of A-549 cells by flow cytometry, and fluorescence optical microscopy. The adhesion was observed in all methodologies, with low rates of association for genotype A (11.9%) and genotype B (9.7%). The search for quorum-sensing carried out with representative isolates of the same prevalent genotypes were negative for the production of AHL inducer using Agrobacterium tumefaciens strain NT1. While the extract of the supernatant of the positive control of P. aeruginosa PAO1 and the reference standard AHL-C8 and AHL -C12 were positive. Data from this study are relevant to public health because they allow the knowledge of the molecular epidemiology of this species, as well as some of the virulence factors, which have been rarely described in Brazil, thus enhancing the monitoring and implementing control measures.

Made available in DSpace on 2016-04-20T12:49:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 amanda_tucci_ioc_mest_2015.pdf: 5122366 bytes, checksum: 8fea49a02fa58dc27c0339860fdb91fd (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A diversidade genética do Trypanosoma cruzi influencia diferentes parâmetros biológicos e tem sido apontada como fator importante para o desfecho clínico da doença de Chagas. A expressão diferencial de genes e proteínas entre as diferentes DTUs do T. cruzi parece determinar a virulência do parasito e sua capacidade de subverter a resposta imune e persistir no hospedeiro mamífero. Dentre o repertório de moléculas de superfície dos parasitos envolvido no reconhecimento celular, destacamos as proteínas de ligação à heparina (PLHs) que atuam no ciclo de vida de diferentes patógenos intracelulares, incluindo o T. cruzi. PLHs desempenham importante papel na citoaderência e entrada do T. cruzi através do reconhecimento de proteoglicanos de heparam sulfato (PGHS) na superfície de células de mamíferos. O mecanismo de invasão disparado pela interação PLHs-PGHS, assim como a presença de PLHs em T. cruzi de diferentes genótipos (TCI e TCII) ainda não foi elucidado. O presente estudo teve como objetivo avaliar a expressão de PLHs e glicoproteínas (GPs), gp35/50, gp82 e gp90, envolvidas na invasão de tripomastigotas derivados de cultivo celular (TCT), tripomastigotas sanguíneos (BT) e metacíclicos (MT) de T. cruzi da cepa Y (TcII) e isolado silvestre SMM36 (isolado de espécimes de Triatoma vitticeps da região de Santa Maria Madalena, RJ; Zimodema 3), bem como sua atuação nos eventos de internalização destes parasitos. A expressão e localização subcelular de PLHs e GPs em T. cruzi foi determinada pela incubação por 1h no gelo de tripomastigotas com 20\03BCg/mL de heparina ou heparam sulfato (HS) conjugados à biotina seguido de processamento para citometria de fluxo e microscopia de fluorescência As análises de citometria de fluxo revelaram que tripomastigotas (TCT, BT e MT) de diferentes genótipos (cepa Y e isolado SMM36) possuem uma expressão diferencial de PLHs e GPs em sua superfície. TCTs e BT (cepa Y) possuem elevada expressão de PLHs comparado aos MTs. Cerca de 90% da população de TCTs apresentam marcação positiva para PLHs enquanto apenas 10-25% dos MTs possuem esta proteína expressa na superfície. Em contraste, MTs apresentam níveis mais elevados de gp35/50, gp82 e gp90 comparados aos TCTs. A localização subcelular de PLHs em domínios de sinalização do T. cruzi é bastante peculiar. Em TCTs e BT (cepa Y), PLHs estão localizadas na membrana flagelar enquanto as GPs estão distribuídas ao longo do corpo do parasito (TCT e MT), exceto gp90 que é negativa nos TCTs. Ainda, a capacidade invasiva dos parasitos e o papel de proteoglicanos sulfatados foi analisada utilizando células de ovário de hamster chinês competentes (CHO-K1) e mutantes deficientes em glicosaminoglicanos (CHO-745) como modelo experimental de invasão. Os dados quantitativos da infecção revelaram que TCTs (cepa Y e isolado SMM36) são mais infectivos que MTs. TCTs alcançaram um perfil de infecção entre 52-85% após 2h de interação com CHO-K1, de acordo com a razão parasito-célula alvo, enquanto MTs atingiram o máximo de 6% de infecção neste tempo de interação Embora o percentual de infecção tenha sido similar entre TCTs dos diferentes genótipos, a análise do índice endocítico revelou maior eficiência do isolado SMM36 na invasão, apresentando valores cerca de 40% maior de parasitos interiorizados. Ainda, CHO-745 infectadas com TCT (Y e SMM36) apresentaram redução de aproximadamente 30% nos níveis de infecção quando comparadas a CHO-K1. Este fenômeno não foi observado em MTs mesmo após 24h de interação, cujo percentual de infecção alcançou 37% na maior relação parasito-célula alvo (60:1). Este conjunto de dados sugere que a interação PLHs-PGHS possa disparar vias de sinalização importantes para entrada de parasitos que expressam elevados níveis de PLHs em sua superfície. O mecanismo de invasão mediado pela interação PLHs-PGHS será alvo de futura investigação / The genetic diversity of Trypanosoma cruzi influences different biological parameters and has been identified as an important factor for the clinical outcome of Chagas’ disease. The differential gene and protein expression between different DTUs of T. cruzi seems to determine the virulence of the parasite and its capacity to subvert the immune response and persist in the mammalian host. Among the surface molecules repertoire of parasites involved in cell recognition, we highlight the heparin binding proteins (PLHs) acting in the life cycle of different intracellular pathogens, including T. cruzi. PLHs play an important role in cytoadherence and entrance of T. cruzi by recognizing heparan sulfate proteoglycan (PGHS) in the mammalian cell surface. The mechanism of invasion triggered by PLHs-PGHS interaction, as well as the presence of PLHs in different genotypes (TCI and TCII) of T. cruzi has not yet been elucidated. This study aimed to evaluate the expression of PLHs and glycoproteins (GPs), GP35/50, gp82 and gp90, involved in the invasion of cell culture derived trypomastigotes (TCT), bloodstream trypomastigotes (BT) and metacyclics (MT) of T. cruzi of Y strain (TCII) and the sylvatic isolate SMM36 (isolated from specimens of Triatoma vitticeps from Santa Maria Madalena region, RJ; Zymodeme 3), as well as their role in the events of internalization of these parasites. Expression and subcellular localization of PLHs and GPs in T. cruzi was determined by incubation for 1 h on ice of trypomastigotes with 20μg/mL of biotin-conjugated heparin or heparan sulfate (HS) followed by processing for flow cytometry and fluorescence microscopy. The flow cytometry analysis showed that trypomastigotes (TCT, BT and MT) of different genotypes (Y strain and SMM36 isolate) have differential expression of PLHs and GPs on their surface. TCTs and BT (Y strain) have high expression of PLHs compared to MTs. About 90% of TCT population has positive labeling to PLHs while only 10-25% of MTs have expressed this protein on the surface. In contrast, MTs have higher levels of GP35/50, gp82 and gp90 when compared to TCTs. The subcellular localization of PLHs in signaling domains of T. cruzi is quite peculiar. In TCTs and BT (Y strain), PLHs are located in the flagellar membrane while GPs are distributed throughout the parasite's body (TCT and MT), except that gp90 is negative in TCTs. Also, the invasive capacity of the parasites, and the role of sulfated proteoglycans were analyzed using wild-type chinese hamster ovary cells (CHO-K1), and its mutant cell line deficient in glycosaminoglycan (CHO-745) as experimental model of invasion. The quantitative data of infection revealed that TCTs (Y strain and SMM36 isolate) are more infective than MTs. TCTs reached a range of infection between 52-85% after 2h of interaction with CHO-K1, according to the parasite- host cell ratio, while MTs reached a maximum of 6% infection at this time of interaction. Although the percentage of infection was similar between TCTs of different genotypes, the analysis of the endocytic index showed higher efficiency of invasion in the SMM36 isolate, showing values about 40% more of internalized parasites. Also, CHO-745 infected with TCT (Y strain and SMM36 isolate) exhibit approximately 30% decrease in infection levels compared to CHO-K1. This phenomenon was not observed in MTs even after 24 hours of interaction, whose percentage of infection reached 37% at the highest parasite-target cell ratio (60: 1). These data suggest that PGHS-PLHs interaction may trigger signaling pathways important for entry of parasites that express high levels of PLHs on its surface. These invasion mechanisms mediated by PLHs PGHS-interaction will be the focus of future research. / 2016-10-29