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Estudo genotípico de isolados do HTLV-1 e caracterização do envelope viral, correlacionando com o desenvolvimento de protótipos vacinais

Miranda, Aline Cristina Andrade Mota January 2008 (has links)
Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-06-01T19:12:10Z No. of bitstreams: 1 Aline Miranda. Estudo genotipico de novos isolados do HTLV1 e caracterizacao do envelope viral....pdf: 1383531 bytes, checksum: 512f94af438412f8fd0032deab12a173 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-01T19:12:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aline Miranda. Estudo genotipico de novos isolados do HTLV1 e caracterizacao do envelope viral....pdf: 1383531 bytes, checksum: 512f94af438412f8fd0032deab12a173 (MD5) Previous issue date: 2008 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / Em 1980, a partir de um paciente com linfoma cutâneo de células T, foi isolado o vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1, o HTLV-1, que é conhecido, principalmente, por ser o agente etiológico de uma síndrome neurológica denominada TSP/HAM. No Brasil, estima-se que 2,5 milhões de indivíduos estejam infectados pelo HTL V -1, sendo a maior prevalência encontrada na população geral na cidade de Salvador, Bahia. Este estudo foi dividido em duas etapas: a primeira etapa refere-se a um estudo de caracterização do envelope viral utilizando ferramentas de bioinformática; enquanto que a segunda etapa caracteriza-se por ser um estudo de soroprevalência e análise dos novos isolados virais. O estudo de caracterização do envelope viral foi realizado para todas as seqüências nucleotídicas do gene env (n=15), já publicadas no Banco Mundial de seqüências, dando suporte ao programa brasileiro de DST -AIDS. Este estudo de caracterização se baseou na identificação de possíveis epítopos lineares, na caracterização físico-química, na identificação de mutações selecionadas positivamente, e por fim na procura por assinaturas correspondentes às modificações pós-traducionais. Inicialmente, realizamos a triagem de peptídeos previamente identificados no envelope viral, e em seguida a predição de epítopos nestas seqüências peptídicas. Em 12 peptídeos previamente publicados, foram encontrados 12 possíveis epítopos, cuja variação total na composição de aminoácido foi de 9 por cento e 17 por cento para os alelos de HLA classes I e 11, respectivamente. Em 5 dos 12 epítopos a análise físico-química revelou que as mutações presentes foram capazes de aumentar o perfil de antigenicidade da região protéica que continha a mutação. A análise de domínios potenciais mostrou a perda de um sítio de fosforilação (PKC) no epítopo que contém a mutação D197N, e a perda de um sítio de N-glicosilação causada pelas mutações S246Y e V247I em outro epítopo. Além disso, a análise de pressão seletiva revelou 8 sítios selecionados positivamente (ώ = 9,59), usando modelos de máxima verossimilhança. Este estudo ressalta a importância do envelope viral para o sucesso da infecção e para o desenvolvimento de protótipos vacinais, principalmente, porque foi possível identificar sítios selecionados positivamente, e epítopos com características conservativas e potenciais ligantes para um grande número de alelos de HLA. A segunda etapa do trabalho consistiu na caracterização genotípica de novos isolados do HTLV-1 na cidade de Rio Branco-Acre. Para contribuir com dados de soroprevalência do HTL V-I no Brasil, e para discutir sobre a epidemiologia molecular do vírus, 219 doadores de sangue foram triados para a presença de anticorpos específicos contra o vírus. Um único caso de infecção (soroprevalência de 0,46 por cento) foi detectado entre os doadores de sangue atendidos, durante o mês de julho de 2004, na Fundação Hemocentro de Rio Branco-Acre. Seqüenciamos, então, a região L TR total referente a esse isolado viral (ACI81), e submetemos à subtipagem, juntamente com outras 4 seqüências L TR (AC042, AC174, AC069, AC129), também geradas neste trabalho, provenientes, entretanto, de casos de infecção identificados por um trabalho anterior de soroprevalência nesta mesma população. Para os fragmentos totais da região LTR (AC181 e AC042), análises filogenéticas foram realizadas utilizando o programa PAUP, enquanto que os fragmentos parciais (ACI74, AC069, AC129) foram genotipados através de uma ferramenta online de subtipagem. Três seqüências referentes ao gene env (ENV AC57, ENV AC69 e ENV AC204), também foram geradas, neste estudo, utilizando amostras HTLV-1 positivas provenientes de um estudo prévio de caracterização sorológica. Estas foram analisadas para a presença de modificações pós-traducionais. Análises filo genéticas demonstraram que tanto os isolados L TR total, como os parciais foram classificados como pertencentes ao subgrupo Transcontinental do subtipo Cosmopolita, dentro do grupo monofilético A da América Latina para os isolados AC181 e AC042. Comparando a diversidade genética das seqüências de HTLV-1, geradas neste trabalho, com outras seqüências virais em infecções em Salvador, Fortaleza e Peru, foi possível encontrar uma menor distância genética entre as cepas de Rio Branco, quando comparadas com as cepas de Fortaleza e do Peru, e uma maior distância genética, quando comparadas com cepas de Salvador. A análise de domínios potenciais mostrou a presença de sítios de fosforilação para PKC nas posições 31O-312aa e 342¬344aa; um sítio de fosforilação para CK2 na posição 194-197aa; sítios de N-glicosilação nas posições 222-225aa, 244-247aa e 272-275aa; e por fim, um sítio de miristilação na posição 327¬338aa. Os achados moleculares nos permitem sugerir uma possível origem Pré-Colombiana do vírus nesta população, sem, no entanto, descartar completamente a possibilidade de introdução Pós-Colombiana. / The Human T cell lymphotropic virus type 1, HTLV-1, was isolated, in 1980, from a pacient affected by a T cell cutaneous lymphoma, and it is mainly associated to the development of a neurological disorder called TSP/HAM. About 2.5 million of individuals are HTLV-1 infected, in Brazil, and the grater prevalence into general population is registered in Salvador city, Bahia state. This study was performed in two stages: the first one refers to an study of viral envelope caracterization, using bioinformatics tools; while the second one, is a seroprevalence investigation and viral isolates caracterization. The env gene characterization study was carried out to evaluate the molecular pattern of all available Brazilian human T-cell lymphotropic virus type 1 Env (n = 15) nucleotide sequences via epitope prediction, physico-chemical analysis, and protein potential sites identification, giving support to the Brazilian AIDS vaccine program. In 12 previously described peptides of the Env sequences, 12 possible epitopes were found. The total variation on the amino acid composition was 9% and 17% for human leukocyte antigen (HLA) class I and class II Env epitopes, respectively. In 5 of the 12 Env epitopes the physico-chemical analysis demonstrated that the mutations magnified the antigenicity profile into the mutation region. The potential protein domain analysis of Env sequences showed the loss of a CK-2 phosphorylation site caused by D197N mutation in one epitope, and the loss of a N-glycosylation site caused by S246Y and V247I mutations in another epitope. Besides, the analysis of selective pressure have found 8 positive selected sites ( = 9.59) using the codon-based substitution models and maximum-likelihood methods. These studies underscore the importance of this Env region for the virus fitness, for the host immune response and, therefore, for the development of vaccine candidates. To contribute further with the HTLV-1 seroprevalence in Brazil, and to discuss the virus molecular epidemiology in this Amazon population (Rio Branco-Acre), 219 blood donors were screened for HTLV-1- specific antibodies. It was only detected a single case of infection (0.46% seroprevalence) among blood donors, screened during July 2004, at FUNDACRE. We have submitted this unique HTLV-1 positive sample (AC181) and four others positive samples (AC042, AC174, AC069, AC129) originated in a previous serological study, in the same population, to the sequencing of the complete LTR region, and submitted to genotyping, To assess molecular epidemiology, Neighbor-joining and Maximum Likelihood phylogenetic analyses of complete LTR region sequences (AC181 and AC042) were performed with PAUP* software, while the partial LTR fragments (AC129, AC174 and AC069) were genotyped using the online subtyping tool. Three envelope sequences (ENV57, ENV69, ENV204) were also generated, in this study, from HTLV-1 positive samples from a previous serological study, and analyzed using the Prosite tool to determinate potential protein sites. Phylogenetic analysis demonstrated that the total and partial LTR strains belong to the Transcontinental subgroup of the Cosmopolitan subtype, inside the Latin American cluster A, for the isolates AC181 and AC042. Calculating the genetic diversity among the HTLV-1 sequences, generated in this report, and sequences described in infection cases in Salvador, Fortaleza e Peru, it was possible to find a close relationship between Rio Branco and Fortaleza or Peru sequences. The potential protein site analysis showed, that all env sequences encoded two PKC phosphorylation sites at amino acid (aa) positions 310-312 and 342-344, one CK2 phosphorylation site at 194-197aa, three N-glycosylation sites at 222-225aa, 244-247aa and 272-275aa, and a single N-myristylation site at 327-338aa.These findings allow to infer about a possible virus introduction in this population through a Pre-Columbian human migration, although we can not exclude a possible Post- Columbian introduction
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Investigação da prevalência da infecção por vírus linfotrópico das células T humanas (HTLV) em gestantes de alto risco

Medeiros, Ana Cristina Matheus January 2017 (has links)
Orientadora : Profa Dra. Meri Bordignon Nogueira / Coorientadora: Dra. Luine Rosele Renaud Vidal / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Tocoginecologia. Defesa : Curitiba, 22/02/2017 / Inclui referências : f. 77-96 / Resumo: O Vírus Linfotrópico das Células T Humanas (HTLV) é um retrovírus, relacionado com o Leucemia das Células T do Adulto (LTA) e a Mielopatia Associada ao HTLV/Paraparesia Espástica Tropical (MAH/PET). A transmissão do HTLV ocorre por meio de relações sexuais, transfusão de hemocomponentes e de mãe para filho, predominantemente por meio da amamentação. O objetivo do presente estudo foi avaliar a prevalência da infecção pelo HTLV e o perfil epidemiológico das gestantes atendidas no ambulatório de pré-natal do Serviço de Tocoginecologia do Complexo Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná (CHC-UFPR), no período de agosto de 2015 a agosto de 2016. Este estudo é descritivo de corte transversal, que incluiu gestantes de alto risco. Realizou-se teste laboratorial, para a detecção de anticorpos para HTLV-1/2, de acordo com o fluxograma de diagnóstico preconizado pelo Ministério da Saúde. O teste confirmatório para o HTLV-1/2 foi realizado pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), direcionados aos genes alvos tax e pol. Analisou-se um total de 643 amostras pelo método de imunoensaio de micropartículas por quimioluminescência (QMIA); destas, quatro (0,63%) apresentaram-se reagentes para HTLV, das quais duas foram confirmadas pelo método de PCR (0,31%) sendo uma HTLV-1 e outra HTLV-2. Nenhuma das pacientes apresentou manifestações clínicas neurológicas ou hematológicas devido à infecção pelo HTLV. Foram analisados dados demográficos e epidemiológicos do total de amostras por meio de questionários e análise de prontuários. A faixa de idade variou entre 14 e 47 anos, com predomínio de gestantes com idade entre 20 e 34 anos (420/65%), e prevaleceu a raça branca (541/84,14%); 183 gestantes (28,46%) possuíam ensino médio completo; 60 (9,33%) eram usuárias de drogas; 191 (29,70%) apresentavam piercing e 177 (27,53%) tatuagem; 271 (42,15%) iniciaram a atividade sexual entre 12 e 16 anos; 311 (48,36%) tiveram de um a cinco parceiros e 35 (5,44%) receberam transfusão sanguínea. Além do HTLV, foram analisados outros dados sorológicos, sendo encontrados os seguintes resultados: HBsAg: 549 (85,38%) não reagentes e sete (1,09%) reagentes; anti-HCV: 530 (82,43%) não reagentes e quatro (0,62%) reagentes; HIV-I/II: 548 (85,22%) não reagentes e 41 (6,38%) reagentes; toxoplasmose IgG: 312 (48,52%) não reagentes e 236 (36,70%) reagentes; toxoplasmose IgM: 544 (84,60%) não reagentes e oito (1,24%) reagentes; sífilis: 580 (90,20%) não reagentes e 25 (3,89%) reagentes. O fluxo de diagnóstico laboratorial proposto neste estudo foi válido para estabelecer a prevalência do HTLV-1/2 em gestantes de alto risco e corrobora a necessidade da confirmação da infecção pelo HTLV-1/2 por meio de métodos moleculares. Palavras-Chave: HTLV. Gestantes de alto risco. Diagnóstico Molecular. PCR. Pré-natal. / Abstract: The human T cell lymphotropic virus (HTLV) is a retrovirus, related to Adult T-Cell Lymphoma (ATL) and HTLV Associated Myelopathy/Tropical Spastic Paraparesis (HAM/TSP). The transmission of HTLV occurs through sexual intercourse, transfusion of blood components and mother to child, predominantly through breastfeeding. The aim of this study was to evaluate the prevalence of HTLV infection and the demographic and epidemiological profile of the high risk pregnant women attending the prenatal clinic of the Department of Tocoginecology of the Clinicas Hospital Complex of the Federal University of Paraná (CHC-UFPR) from August 2015 to August of 2016. The study is a cross-sectional descriptive study, which included high-risk pregnancies women. It was performed laboratory tests to detected HTLV-1/2 antibodies, according to the Ministry of Health flowchart. Confirmatory test for HTLV-1/2 was performed by Polymerase Chain Reaction (PCR) directed for the target genes tax and pol. A total of 643 samples were analyzed by the method of microparticles immunoassay by chemiluminescence (CMIA); from this, four (0.63%) were reagent for HTLV and two (0.31%) were confirmed by PCR. None of them presented clinical neurological or hematological manifestations due to HTLV infection. It was analyzed demographic and epidemiological data from the total samples using questionnaries and medical records. The age range varied between 14 and 47 years, with predominance of pregnant women aged between 20 and 34 years (420/65%). The white race prevailed (541/84.14%) and 183 (28.46%) patients had completed high school. The total of drug users were 60 (9.33%), 191 (29.70%) presented piercing and 177 (27.53%) tattoo. Of the total number of patients, 271 (42.15%) started sexual activity between 12 and 16 years old. Regarding the number of partners, 311 (48.36%) had one to five partners and 35 (5.44%) received blood transfusion. In addition to HTLV, other serological data were analyzed, being founded the following results: HBsAg: 549 (85.38%) non-reactive and 7 (1.09%) reagents; Anti-HCV: 530 (82.43%) non-reactive and 4 (0.62%) reagents; HIV-I/II: 548 (85.22%) non-reative and 41 (6.38%) reagents; toxoplasmosis IgG: 312 (48.52%) non-reactive and 236 (36.70%) reagents; toxoplasmosis IgM: 544 (84.60%) non-reactive and 8 (1.24%) reagents; syphilis: 580 (90.20%) non-reactive and 25 (3.89%) reagents. The flowchart for the laboratory diagnostic proposed in this study were valid to establish the prevalence of HTLV in high risk pregnant women and corroborate the necessity to confirm the HTLV-1/2 by the use of molecular methods. Key words: HTLV. High Risk Pregnant Women. Molecular Diagnostic. PCR. Prenatal.

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