La voie Hippo, découverte chez la Drosophile et conservée chez les mammifères, a été identifiée comme un élément essentiel dans le contrôle de la taille des organes. Cette cascade de kinases régule la phosphorylation de l’effecteur terminal YAP (ou de son paralogue TAZ), un coactivateur transcriptionnel reconnu comme oncogène. Sa fonction est médiée par sa translocation nucléaire et son interaction avec les facteurs de transcription TEAD, pour former le complexe YAP-TEAD qui active l’expression des gènes cibles responsable de la prolifération cellulaire et de la croissance des organes. La surexpression des protéines YAP/TAZ/TEAD dans de nombreux cancers perturbe l’équilibre de la voie Hippo et favorise la formation du complexe protéique causant une hyperprolifération et la propagation des cellules cancéreuses. Inhiber cette interaction protéine-protéine est une cible thérapeutique prometteuse pour concevoir de nouveaux anticancéreux. Dans cette optique, le laboratoire a considéré deux stratégies. La première consiste à cibler la protéine YAP en synthétisant des dipyrrines, représentant des fragments de la Vertéporfine dans le but de définir le motif minimal requis pour conserver l’activité biologique. Une seconde approche implique la synthèse de ligands de TEAD capable de se positionner au sein de l’interface 3. Basée sur des études de modélisation moléculaire, une famille avec un noyau central triazolique a été optimisée pour établir des relations structure-activité. Les molécules synthétisées sont actuellement en cours d’évaluation, grâce à la mise au point des tests biologiques et physicochimiques, et les premiers résultats ont permis d’identifier un composé prometteur. / The Hippo pathway, firstly described in Drosophila and highly conserved in mammals, has been demonstrated to play a crucial role in the organ size control. This kinase cascade regulates the phosphorylation of the downstream effector YAP (or its paralogue TAZ), a transcriptional coactivator with oncogenic activity. Its function is mediated by its nuclear translocation and interaction with the transcriptional factor TEAD, to form YAP-TEAD complex which activates the genes expression in charge of cell proliferation triggering organ growth. Overexpression of YAP/TAZ/TEAD protein in several cancers disrupts the Hippo pathway balance and urges on YAP-TEAD complex formation causing excessive proliferation and cancer development. Inhibiting this protein-protein interaction is thus a promising therapeutic target for the design of new anti-cancer drugs. In this goal, the laboratory has considered two strategies. The first one consists in targeting the YAP protein by synthesizing dipyrrins, representing Verteporfin fragments to define the minimal requirement yielding the expected biological activity. A second approach involves synthesizing TEAD ligands able to fit in specific interface 3. Based on molecular modeling, a triazole scaffold family was optimized to establish structure-activity relationship. Thanks to the biological and binding tests development, synthesized molecules evaluation is still in progress and the present first results have already allowed identifying a promising compound.

La voie Hippo est une voie conservée impliquée dans la croissance des tissus et la suppression de tumeurs. Des études ont démontré son implication dans le développement des cancers chez l'homme. Cette cascade contrôle l'activité du co-activateur transcriptionnel Yorkie (Yki) chez la drosophile et de la protéine YAP (Yes Associated Protein) chez les mammifères. En raison de l'épissage alternatif de leur transcrits, les protéines Yki et YAP existent sous deux isoformes contenant un domaine WW (Yki1/YAP1) ou deux (Yki2/YAP2). Puisque les domaines WW sont essentiels pour l’interaction avec des partenaires spécifiques, l’inclusion alternative de ce domaine dans la protéine Yki/YAP peut remodeler leur réseau d’interaction et donc leur activité. La régulation et les conséquences fonctionnelles de l’épissage alternatif de yki / YAP in vivo sont inconnues.Dans le cadre de ce doctorat, nous avons constaté que la déplétion du facteur d’épissage B52 chez la drosophile réduit l’inclusion de l’exon alternatif dans l’ARNm de yki et favorise l’expression de l’isoforme Yki1 aux dépens de l’isoforme Yki2. La déplétion en B52 dans l'aile réduit la croissance et l'activité de Yki. Nous montrons que l'isoforme Yki1 est une version atténuée de la protéine Yki qui peut entrer en concurrence avec l'isoforme Yki2 dans le noyau. Pour déterminer le rôle de l’épissage alternatif de yki in vivo et l'importance de l'isoforme courte Yki1, nous avons abrogé cet épissage en utilisant la technologie CRISPR/Cas9 et avons créé des mouches capables d'exprimer uniquement l'isoforme Yki2. Ces mouches yki2only sont viables mais présentent un phénotype aléatoire d’ailes asymétriques. Cette augmentation de l'«asymétrie fluctuante», qui traduit une déviation par rapport au développement normal, suggère que l’épissage alternatif de yki est crucial pour la stabilité développementale. Ces résultats mettent en évidence un nouveau niveau de modulation de la voie Hippo via l’épissage alternatif de yki.L'inclusion alternative du deuxième domaine WW est une caractéristique conservée entre Yki et YAP. Cela conforte l'idée que les isoformes Yki1 et YAP1 ont une fonction importante in vivo et que l'épissage alternatif de yki/YAP est un mécanisme conservé de contrôle de la voie Hippo. Cette étude ouvre de nouvelles perspectives pour la modulation de la voie Hippo dans les cellules cancéreuses en modifiant l’épissage alternatif de YAP. / The Hippo pathway is a conserved pathway involved in tissue growth and tumor suppression. Studies have demonstrated its significance in the development of human cancers. This cascade controls the activity of the transcription co-activator Yorkie (Yki) in flies and Yes-associated protein (YAP) in mammals. Due to Alternative Splicing (AS), both Yki and YAP proteins exist as two isoforms containing one (Yki1/YAP1) or two (Yki2/YAP2) WW domains. Since WW domains are essential for interaction with specific partners, the alternative inclusion of this domain in Yki/YAP protein may remodel their interaction network and therefore their activity. The regulation and functional consequences of AS of yki/YAP in vivo are unknown.In this Ph.D. project, we identified that depletion of splicing factor B52 in Drosophila lowers inclusion of the alternative exon in yki mRNAs and favors the expression of Yki1 isoform at the expense of the Yki2 isoform. B52 depletion in the wing reduces growth and Yki activity. We demonstrate that Yki1 isoform is an attenuated version of Yki protein that can compete with Yki2 isoform in the nucleus. To ascertain the role of yki AS in vivo and the importance of short isoform Yki1, we abrogated this splicing by using CRISPR/Cas9 technology and created flies that can express Yki2 isoform only. yki2only flies are viable but display a random phenotype of asymmetric wing size. This rise in “fluctuating asymmetry” that is the consequence of subtle deviation from normal development, suggests that AS of yki is crucial for the development robustness. Taking together, these results highlight a new layer of modulation of Hippo pathway via AS of yki.Alternative inclusion of the second WW domain is a conserved feature between Yki and YAP. This further supports the idea that Yki1 and YAP1 isoforms have an important function in vivo and that AS of yki/YAP is a conserved mechanism of control of the Hippo pathway. This study opens up new perspectives for modulation of the Hippo pathway in cancer cells by altering YAP AS.

Les cellules épithéliales sont des cellules polarisées qui forment l’un des types cellulaires le plus abondant dans le corps humain. Leur polarité apico-basale (A/B) est établie et maintenue par la ségrégation asymétrique de protéines adaptatrices hautement conservées. Cette polarité est essentielle pour de nombreuses fonctions cellulaires clés comme l’adhésion (jonctions intercellulaires) ou la signalisation et la prolifération par la localisation et la concentration des complexes de signalisation. Durant la cancérogénèse, un grand nombre de ces processus est dérégulé aboutissant à la sur-prolifération, la migration et/ou l’invasion des cellules cancéreuses. Une meilleure compréhension des mécanismes à l’origine de ces processus est indispensable pour trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement du cancer. Dans l’équipe, nous sommes particulièrement intéressés par les protéines adaptatrices à domaines PDZ (domaine de liaison protéine-protéine). De par leur structure modulaire et la diversité de leurs partenaires, ces protéines adaptatrices sont impliquées dans la régulation de très nombreuses fonctions et fournissent des plateformes où différents processus peuvent être intégrés. Durant mon doctorat, j’ai étudié deux protéines adaptatrices dans le système animal modèle Drosophila melanogaster, Bbg et Magi, impliquées dans deux processus cellulaires essentiels : la dynamique des jonctions et la prolifération. Grâce aux molécules d’adhésion, les cellules non seulement restent cohésives dans un tissu, mais c’est aussi à ce niveau qu’elles peuvent obtenir une information concernant la densité cellulaire d'un tissu. Cette information est alors relayée au cytosquelette d’actine via des protéines adaptatrices spécialisées dans le but de réguler la prolifération et la voie Hippo. Cependant, le contrôle de la voie de signalisation Hippo par certaines protéines adaptatrices et par le cytosquelette d’actine n'est que partiellement compris à ce jour. Dans le laboratoire, nous étudions notamment le rôle d'une nouvelle protéine adaptatrice apicale nommée Big Bang (Bbg) dans le disque d’aile de la drosophile. Nous nous sommes intéressés à Bbg car c’est une cible de la voie Notch chez la drosophile et son homologue humain PDZD2 (pour PDZ domain-containing 2 protein) est sur-exprimé dans plusieurs cancers (sein et prostate).Mes résultats montrent que Bbg est un nouveau régulateur du cytosquelette d’actine et de la voie Hippo. Une étude détaillée de la fonction de Bbg et de ses partenaires permet de mieux comprendre les relations existantes entre dynamique de l’actine et prolifération. Bbg induit une accumulation d’actine filamenteuse en augmentant l’activité d’Enabled et la phosphorylation de Myosin Light Chain (MLC). Cette régulation résulte en une augmentation de l’activité de Yorkie, effecteur final de la voie Hippo, pour soutenir la prolifération cellulaire.La régulation des jonctions adhérentes est une étape cruciale lors de l’évolution d'une tumeur solide. Malgré les récentes avancées dans le domaine, de nombreux aspects clés de la dynamique des jonctions restent peu caractérisés.Dans le laboratoire, nous recherchons de nouveaux régulateurs de jonctions et grâce au modèle de remodelage des AJs lors du développement de l’œil de pupe de drosophile. Nous avons identifié Magi en tant que protéine adaptatrice recrutant le complexe formé de RASSF8 et ASPP. Magi régule le recrutement de Bazooka à la membrane, le dépôt d’E-Cadhérine et des Caténines et finalement le remodelage des jonctions pendant la morphogénèse. J’ai identifié Echinoid, une protéine de type immunoglobuline impliquée dans l’adhésion cellulaire et la régulation de la voie Hippo, comme un nouveau partenaire responsable du recrutement de Magi aux futures zones de jonctions. / Epithelial cells are polarised cells that form one of the most abundant cell types in the human body. Their apico-basal (A/B) polarity is established and maintained by the asymmetric segregation of highly conserved scaffold proteins. Proper A/B polarity is critical for many key cellular functions such as intercellular junctions and therefore adhesion, or signalling and proliferation by localising and concentrating signalling complexes. During carcinogenesis, many of these processes are mis-regulated leading to the over-proliferation, migration and/or invasion of cancer cells. A better understanding of the mechanisms underlying these processes is really needed to find new therapeutic targets in cancer treatment.In the team, we are particularly interested in scaffold proteins with PDZ domains (protein-protein interaction domains). Due to their modular structure, the high number of interactions they engage in, and the variety of their binding partners, these scaffold proteins are implicated in the regulation of many key cellular functions and processes. During my PhD, I have studied two scaffold proteins in the Drosophila melanogaster animal model, Bbg and Magi, which are involved in two important cell processes: adherens junctions (AJs) dynamic and cell proliferation.Through adhesion molecules, epithelial cells not only remain cohesive, but can also sense cellular density in a tissue and relay this information through dedicated scaffolds to the actin cytoskeleton to ultimately regulate the Hippo pathway and proliferation. However, many aspects of the control of Hippo signalling by apical scaffolds and the actin cytoskeleton are still poorly understood. In the laboratory, we are interested in the study of a new conserved apical scaffold, Big Bang (Bbg). Bbg is a new and quite unknown protein expressed in a variety of Drosophila epithelia, and appears as a potential Notch target in Drosophila. Its’ human homolog called PDZD2 (PDZ domain-containing 2 protein) has been shown to be over-expressed in several types of cancers (breast and prostate cancers).My results show that Bbg is a new regulator of the actin cytoskeleton and of the Hippo pathway in Drosophila. A detailed study of Bbg function and of its associated partners have helped to better understand the intricate relationships between actin dynamics and proliferation. My results suggest that Bbg promotes accumulation of filamentous actin (F-Actin) through the increase of the activity of Enabled (Ena) and the phosphorylation of the molecular motor Myosin Light Chain (MLC). This regulation leads to the increase of Yorkie activity, the final effector of the Hippo pathway, to promote cell proliferation.The regulation of adhesion, and in particular of Adherens Junctions (AJs), is a critical step during the evolution of solid tumours. A better understanding of how these structures are regulated will provide valuable insights into different phases of the disease. Despite the recent advances, many key aspects of AJ dynamics remain poorly understood. In the laboratory, we are interested in the identification of new AJs regulators. Using the remodelling of AJs during the development of the Drosophila pupal eye as a model, we have identified Magi as a scaffold recruiting a complex formed by RASSF8 and ASPP, regulating Bazooka membrane recruitment, E-Cadherin and catenins deposition, and ultimately AJs remodelling during morphogenesis. I uncovered Echinoid, an immunoglobulin-like protein involved in cell adhesion and in Hippo pathway regulation, as a new binding partner responsible for the recruitment of Magi at future AJ sites.

L’AICAR (5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide) est un intermédiaire de la voie de biosynthèse des purines. A des concentrations importantes, ce métabolite a un effet cytotoxique sur les cellules cancéreuses aneuploïdes, c’est-à-dire contenant un nombre anormal de chromosome. Or,90% des tumeurs solides sont aneuploïdes. Les mécanismes responsables de cette cytotoxicité doivent donc être mieux étudiés pour une utilisation éventuelle en thérapie anti-cancéreuse.Dans la littérature, l’effet de l’AICAR est expliqué par son rôle mimétique de l’AMP sur l’AMPK.Cependant, certaines données de la littérature et du laboratoire laissent penser que l’inhibition de la croissance par l’AICAR peut impliquer plusieurs types de mécanismes dont certains sont dépendantsde l’AMPK et d’autres indépendants. L’identification des cibles de l’AICAR alternatives à l’AMPK estdonc nécessaire pour une meilleure compréhension de ses effets.Dans ce projet, j’ai pu confirmer la présence d’autres cibles de l’AICAR indépendantes de l’AMPKet responsables de son effet cytotoxique. Grâce à une approche transcriptomique, j’ai montré un effetde l’AICAR sur l’expression et l’activation de LATS1 et LATS2 (large tumor suppressor 1 and 2). Ces protéines kinases fond partie du core enzymatique de la voie HIPPO, dont le rôle en cancérologie est fondamental. Les effecteurs finaux de cette voie sont YAP et TAZ, deux cofacteurs de transcription,aussi régulés par l’AICAR. J’ai pu montrer que la cytotoxicité de l’AICAR est due en partie à l’activation de cette voie. Depuis la découverte récente de la voie HIPPO, de nombreuses études visent à identifier des molécules permettant l’inhibition directe de cette voie. L’AICAR s’avère être une molécule puissante dans le cadre d’une thérapie anticancéreuse ciblant la voie HIPPO. / AICAR (5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide) is an intermediate of the purine biosynthesis pathway. At high concentrations, this metabolite has a cytotoxic effect on aneuploid cancer cells that is cells containing an abnormal chromosome number. However, 90% of solid tumorsare aneuploid. The mechanisms responsible for this cytotoxicity should be better studied for possible use in anti-cancer therapy.In the literature, the effect of AICAR is explained by its AMP mimetic role on the AMPK. However,some literature and laboratory data suggest that AICAR growth inhibition may involve several types of mechanisms, some of which are dependent and other independent of AMPK. Therefore, the identification of AMPK alternative targets is necessary for a better understanding the AICAR effects. In this project, I was able to confirm the presence of other AICAR targets independent of AMPK and responsible for its cytotoxic effect. Using a transcriptomic approach, I showed an effect of AICAR on the expression and activation of LATS1 and LATS2 (large tumor suppressor 1 and 2). These proteinkinases form part of the enzymatic nucleus of the HIPPO pathway, whose role in oncology is fundamental. The effectors of this pathway are YAP and TAZ, two transcription cofactors, also regulated by the AICAR. I have been able to show that the cytotoxicity of AICAR is due to the activation of this pathway. Since the recent discovery of the HIPPO pathway, numerous studies aim to identify molecules allowing direct inhibition of this pathway. AICAR has proven to be a potent molecule in anticancer therapy which goal is targeting the HIPPO pathway.

L'adhérence cellulaire à la matrice extracellulaire joue un rôle clé dans leur prolifération,leur différenciation ou l'apoptose. Par conséquent ce processus est critique pour undéveloppement normal et pour l'homéostasie tissulaire. La dérégulation de ce mécanismecontribue souvent à des situations pathologiques. Ainsi, la dérégulation de nombreux gènesimpliqués dans les adhérences cellule-cellule ou cellule-matrice extracellulaire sont liés à despathologies conduisant à un défaut de développement, la progression tumorale, oul'inflammation.Les intégrines sont des récepteurs transmembranaires hétéro dimériques jouant un rôlemajeur dans les interactions cellule-matrice extracellulaire. Ce rôle n'est pas limité à unesimple interaction mécanique puisqu'elles permettent également la transduction dessignaux de la matrice extracellulaire à la cellule afin de permettre à cette dernière des'adapter à son micro environnement. Dans le but d’étudier le rôle des intégrines à chaîneβ1 dans le développement osseux, le laboratoire a mis en place un modèle murind'inactivation conditionnelle du gène Itgb1 basée sur l'expression de la recombinase Cre austade pré-ostéoblastique. Les souris mutées présentent un défaut de développementosseux, dû à une faible prolifération des ostéoblastes.Contrairement à ce qui était généralement admis, cette faible prolifération desostéoblastes est indépendante de la voie classique mettant en jeu la voie classique des MAPkinases. En revanche, elle est contrôlée par la voie Hippo: cette signalisation a étérécemment identifiée chez la Drosophile et les Mammifères comme un mécanismeinhibiteur majeur de la prolifération cellulaire. Le cofacteur de transcription YAP, effecteurfinal de cette voie, est une navette nucléo-cytoplasmique. Son expression est amplifiée dansdivers cancers dont l'ostéosarcome où cette surexpression associée à celle de l’Itgb1 est unfacteur de mauvais pronostique.Mes travaux consistent à comprendre comment les intégrines à chaîne β1 contrôlent lavoie Hippo, et donc la prolifération. Nous avons confirmé que la délétion des intégrines β16active la phosphorylation de YAP et sa séquestration dans le cytoplasme. En utilisant destechniques de Biologie Cellulaire et de Biochimie, nous avons montré que suite à la délétionde l’Itgb1, les cellules présentent un défaut de trafic vésiculaire réduisant la translocationmembranaire de Rac1. La séquestration cytoplasmique de Rac1 diminue l’activation de soneffecteur majeur la kinase PAK responsable de la dissociation d'un complexe membranaired'inactivation composé de la protéine adaptatrice NF2, la kinase LATS et de son effecteurprincipal YAP. Les intégrines en provocant la perte de ce complexe induisent ladéphosphorylation de YAP, sa translocation nucléaire et donc stimulent la proliférationcellulaire. / Cell adhesion to the extracellular matrix plays a key role in their proliferation,differentiation or apoptosis. Therefore, this process is critical for normal development andtissue homeostasis. The deregulation of this mechanism often contributes to pathologicalsituations. Thus, the deregulation of many genes involved in cell-cell or cell-extracellularmatrix adhesions are linked to pathologies leading to developmental defects, tumorprogression, or inflammation.Integrins are heterodimeric transmembrane receptors that play a major role in cellextracellularmatrix interactions. This role is not limited to a simple mechanical interactionsince integrins also allow the transduction of the signals from the extracellular matrix to thecell in order to permit the latter to adapt to its microenvironment. In order to study the roleof β1 integrins in bone development, the laboratory has implemented a mouse model withconditional inactivation of the Itgb1 gene based on the expression of recombinase Cre at thepre-osteoblastic stage. The mutated mice show a defect in bone development due to a lowproliferation rate of osteoblasts.Contrary to what was generally accepted, this reduced proliferation is independent of theclassical pathway involving the classical pathway of MAP kinases. On the other hand, it iscontrolled by Hippo: this signaling pathway has recently been identified in Drosophila andMammals as a major inhibitory mechanism of cell proliferation. The transcription cofactorYAP, the end effector of this pathway, is a nucleo-cytoplasmic shuttle. Its expression isamplified in various cancers including osteosarcoma where this overexpression associatedwith that of Itgb1 is a factor of poor prognosis.My work involves understanding how β1 integrins control the Hippo pathway, and thusproliferation. We confirmed that deletion of β1 integrins activates the phosphorylation ofYAP and its sequestration in the cytoplasm. Using Cell Biology and Biochemistry techniques,we showed that following the deletion of Itgb1, the cells exhibit a defect in vesicular trafficthat reduces the membrane translocation of Rac1. The cytoplasmic sequestration of Rac18decreases the activation of its major effector, the PAK kinase. PAK is responsible for thedissociation of an inactivating membrane complex composed of the adaptor protein NF2,the LATS kinase, and its main effector YAP. The integrins by provoking the loss of thiscomplex induce the dephosphorylation of YAP, its nuclear translocation, and thus stimulatecell proliferation.

RAS est une GTPase qui transduit les signaux extracellulaires envers des voies de signalisation intracellulaires, en liant ses effecteurs. RAS peut activer la voie Hippo qui inhibe la croissance cellulaire et qui est souvent dérégulée dans le cancer. Les protéines RASSF suppresseurs de tumeurs relient RAS à la voie Hippo. L’expression exogène de KRASG12V avec RASSF1 ou RASSF5 conduit à l'activation de la voie Hippo, bien que KRAS et RASSF1 ne s’associent pas directement. Ce projet de maîtrise vise à identifier les protéines impliquées dans l'activation de la voie Hippo par RAS. Nous avons effectué plusieurs expériences BioID, une technique qui permet d’identifier les interacteurs proximaux d’une protéine d’intérêt, dans des lignées cellulaires U2OS stables et inductibles exprimant les protéines KRASG12V, RASSF1 ou RASSF5 seules ou coexprimées, permettant de comparer les conditions où la voie Hippo inactive ou active. Nous avons élucidé l'interactome d'un mutant de KRAS avec affinité accrue envers RASSF5 et affinité réduite envers RAF, permettant d’étudier les voies activées en aval de RASSF5, avec une activation réduite de la voie MAPK. Nos données montrent que RASSF1 et RASSF5 relâchent les kinases Hippo MST1 et MST2 lorsque la voie Hippo est active, conformément aux données in vitro démontrant un rôle inhibiteur de l'interaction RASSF/MST. De plus, nous avons démontré que KRAS est un interacteur proximal des protéines VAMP3 et SNAP23. Comprendre comment l'oncoprotéine RAS active des effecteurs et des voies de signalisation moins étudiés, en particulier ceux qui ont des fonctions suppressives de tumeurs a des implications importantes pour le développement de nouvelles thérapies ciblées pour les cancers induits par RAS. / RAS is a small GTPase that transduces signals from membrane-bound receptors to intracellular pathways, by signaling to downstream effector proteins. RAS can activate the Hippo pathway, a growth-suppressive pathway that is often dysregulated in cancer. The tumor suppressor RASSF proteins link RAS to Hippo signaling. Co-expression of KRASG12V with either RASSF1 or RASSF5 leads to Hippo pathway activation, despite KRAS and RASSF1 not being direct binding partners. This M.Sc. project aims to identify proteins that are involved in RAS-mediated activation of the Hippo pathway. We performed BioID, a proteomic technique which is used to identify the proximal interactors of a protein of interest, in stable and inducible U2OS osteosarcoma lines expressing KRASG12V, RASSF1, or RASSF5 proteins alone, as well as in lines co-expressing both KRASG12V and the RASSF proteins, allowing for a comparison between inactive and active Hippo pathway interactomes. Furthermore, we mapped the interactome of a double mutant of KRAS that displays increased affinity for RASSF5 and decreased affinity for the effector RAF, allowing us to study KRAS signaling downstream of RASSF5, with decreased activation of the MAPK pathway. Our BioID data shows that RASSF1 and RASSF5 disengage the Hippo kinases MST1 and MST2 when the Hippo pathway is active, in line with the inhibitory role of the RASSF/MST interaction observed in vitro. Furthermore, we show that KRAS is a proximal interactor of the SNARE proteins VAMP3 and SNAP23. Understanding how the oncoprotein RAS signals to less studied effectors and pathways, particularly those with tumor suppressive functions has significant implications for understanding oncogenesis, and for development of new targeted therapies for RAS-driven cancers.

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La polarité cellulaire est un déterminant essentiel dans le maintien de l’architecture tissulaire et la fonction de l’organe. Ainsi, la division cellulaire, la ciliogenèse, la prolifération, et la migration sont des évènements étroitement associés au processus de la polarisation cellulaire. L’altération de la polarité cellulaire contribue à la perte de l’intégrité des épithéliums et favorise le développement des cancers. La signalisation des lipides, telle que des phosphatidylinositols (PtdIns) joue un rôle vital dans la polarité apico-basale. Dans cette étude, nous avons développé des recherches pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les effets de la phosphatase SHIP2 sur la polarité cellulaire. Nous avons pu démontrer que SHIP2 est impliquée dans la formation du site d’initiation de la formation de la lumière (AMIS) en régulant d’une part la contractilité acto-myosine induite par RhoA kinase et d’autre part YAP, un composant de la voie de signalisation Hippo. De plus, nous avons montré que l'inhibition de SHIP2 contribue à un défaut dans la formation de fuseau mitotique et dans le clivage de ce fuseau mitotique. La surexpression de SHIP2 induit une lumière large et des cils allongés attribuables à la diminution de l’expression de YAP, Aurora A et HEF1. Par contre, la diminution de l’expression de SHIP2 inhibe la formation des cils en provoquant la surexpression de YAP, Aurora A et HEF1 et ainsi l’apparition d’un phénotype multilumens. L’ensemble de nos travaux définissent un nouveau rôle de SHIP2 dans le maintien de l’intégrité et de l’homéostasie des cellules épithéliales. Nous avons aussi pu démontrer que l’expression de SHIP2 peut discriminer les différents cancers du foie (HCC, ICC et mixte) et que SHIP2 et Merlin/NF2, une protéine de la voie de signalisation Hippo, ont une forte expression dans le cholangiocarcinome (ICC) qui s’oppose à celle de YAP et de RhoA kinase. / Cell polarity is critical caracteristic for the maintenance of tissue architecture. Cell division, ciliogenesis, cell proliferation and migration are events tightly associated to cell polarization processes. Alteration in cell polarity contributes to loss of epithelium integrity and enhances cancer development. Lipids signaling, such as phosphatidylinositol (PtdIns), play a vital role in apico-basal polarity. In this study, we developed researches to better understand mechanisms implicated the role of the phosphatase SHIP2 in cell polarity. We demonstrated that SHIP2 is implicated in formation of the apical membrane initiation site (AMIS) by regulating YAP, a component of Hippo pathway, and RhoA-dependant acto-myosin contractility. Furthermore, we demonstrated that inhibition of SHIP2 contributes to defect in the formation and cleavage of the mitotic spindle. Overexpression of SHIP2 induced a large lumen with long cilia due to a decrease in YAP, Aurora A and HEF1 luminal localization. On the contrary, down regulation of SHIP2 impaired cilia outgrowth by increasing Aurora A, HEF1 and YAP luminal localization with appearance of a multilumens phenotype. Thus, our results reinforced the role of SHIP2 in maintain of integrity and homeostasis of epithelial cells. In this study, we also demonstrated that expression of SHIP2 distinguished the different types of liver cancer (HCC, ICC and mixte), and that SHIP2 and Merlin/NF2 are overexpressed in ICC which is the opposite of YAP and RhoA expression.

La voie de signalisation Hippo est composée classiquement des kinases mammalian sterile twenty-like 1 et 2 (MST1/2) et des kinases large tumor suppressor 1 et 2 (LATS1/2) qui régulent les effecteurs transcriptionnels Yes-associated protein (YAP) et transcriptional coactivator with PDZ-binding motif (TAZ). Elle est impliquée dans plusieurs mécanismes cellulaires tels que la prolifération, la différenciation et l’apoptose ainsi que dans le maintien de l’homéostasie de différents tissus. Cependant, bien qu’il ait été démontré que YAP/TAZ contribuent au maintien de la glande surrénale, le rôle joué par les principales kinases de la voie Hippo dans ce tissu n’a jamais encore été évalué. L’objectif de ce projet de thèse est donc d’identifier les rôles des différentes kinases de la voie Hippo dans le développement et le maintien du cortex surrénalien par la création de cinq modèles de souris transgéniques. Grâce au modèle d’inactivation des kinases Mst1/2 dans le cortex surrénalien (Mst1flox/flox;Mst2flox/flox;Nr5a1-cre), nous avons démontré que Mst1/2 empêchent l’apparition prématurée de cellules ressemblant aux cellules du primordium adrénogonadique (AGP-like) dans la couche sous-capsulaire. Les analyses du transcriptome de ce modèle ont de plus démontré que les kinases MST1/2 régulent finement l’activité de YAP et des cellules de la zone glomérulée (zG) du cortex surrénalien à l’âge adulte mais pas l’activité des cellules de la zone fasciculée (zF). Ceci suggère que MST1/2 sont surtout impliqués dans la régulation de la fonction et de la différenciation des cellules de la zG. Contrairement à l’inactivation de Mst1/2, l’inactivation des kinases Lats1/2 dans tout le cortex en utilisant la même lignée Cre (Lats1flox/flox;Lats2flox/flox;Nr5a1-cre), a démontré que LATS1/2 empêchent la transdifférenciation des cellules du cortex en cellules ressemblant à des myofibroblastes et à la formation de fibrose durant le développement embryonnaire. De plus, l’inactivation de LATS1/2 spécifiquement dans les cellules de la zG (Lats1flox/flox;Lats2flox/flox;AS-cre) a démontré que LATS1/2 empêchent la transdifférenciation des cellules de la zG en cellules partageant des caractéristiques avec des ostéoblastes et des cellules de Sertoli. Cette inactivation est également responsable de l’induction d’une importante réponse immuno-inflammatoire chez les animaux juvéniles. De plus, l’inactivation de Yap/Taz simultanément à l’inactivation de Lats1/2 dans les cellules de la zG (Yapflox/flox;Tazflox/flox;Lats1flox/flox; Lats2flox/flox;AS-cre) a permis de confirmer que l’augmentation de l’activité transcriptionnelle de YAP et de TAZ était responsable du phénotype observé à la suite de l’inactivation de Lats1/2. Finalement, l’utilisation d’un modèle exprimant une forme constitutivement active de YAP humain dans les cellules de la zG (Rosa26YAP5SA/+;AScre/+) nous a permis de démontrer que l’augmentation de l’activité transcriptionnelle de YAP seule ne pouvait reproduire pleinement le phénotype observé suite à l’inactivation de Lats1/2 mais conduit plutôt à l’hyperplasie de la glande surrénale. Ensemble, nos modèles murins démontrent un rôle important pour la voie Hippo, et particulièrement les kinases LATS1/2 et les effecteurs YAP/TAZ, dans la différenciation des cellules stéroïdogéniques du cortex surrénalien et le maintien de l’homéostasie de la glande surrénale chez la souris. Ces travaux ouvrent non seulement la voie à l’étude plus poussée de cette voie dans des pathologies de la glande surrénale, comme les tumeurs surrénaliennes, mais mettent également en évidence la voie Hippo en tant que cible thérapeutique pour les troubles surrénaliens. / The Hippo pathway canonical signaling is composed of the mammalian kinases sterile twenty-like 1 and 2 (MST1/2) and large tumor suppressor 1 and 2 (LATS1/2) which ultimately regulate the transcriptional co-activators Yes-associated protein (YAP) and the transcriptional coactivator with PDZ-binding motif (TAZ). This pathway plays critical roles in maintaining the homeostasis of various tissues and regulating biological processes such as cellular proliferation, differentiation, and apoptosis in a tissue-specific manner. Although previous studies have shown that the effectors YAP/TAZ are involved in the maintenance of the adrenal gland, the roles played by their main upstream kinases in this tissue have not yet been evaluated. The objective of this thesis project is therefore to identify the importance of these distinct Hippo pathway kinases in the development and maintenance of the adrenal cortex by generating five different conditional transgenic mouse models. Using a Mst1/2 inactivation model (Mst1flox/flox;Mst2flox/flox;Nr5a1-cre), we first demonstrated that loss of Mst1/2 in the entire cortex leads to premature appearance of spindle-shaped cells resembling adrenogonadal primordium “AGP-like” cells in the sub-capsular region of the adrenal cortex. Further transcriptomic analyses performed on this model showed that MST1/2 can regulate the activity of YAP and of cells forming the zona glomerulosa (zG) in adult mice but not the activity of cells of the zona fasciculata (zF). This finding suggested that kinases MST1/2 are mainly involved in the regulation of zG cell function or differentiation. The inactivation of Lats1/2 using the same Cre line (Lats1flox/flox;Lats2flox/flox;Nr5a1-cre) demonstrated that LATS1/2 prevent the transdifferentiation of cortical cells into myofibroblast-like cells and the onset of fibrosis during embryonic development. Moreover, the inactivation of Lats1/2 specifically in the zG cells (Lats1flox/flox;Lats2flox/flox;AS-cre) demonstrated that LATS1/2 prevent the transdifferentiation of zG cells into cells sharing characteristics with osteoblast and Sertoli cells. This inactivation is also responsible for the induction of an immune-inflammatory response in juvenile mice. Most importantly, the concomitant inactivation of Yap/Taz with Lats1/2 in zG cells (Yapflox/flox;Tazflox/flox;Lats1flox/flox;Lats2flox/flox;AS-cre) demonstrated that the increase in the transcriptional activity of YAP/TAZ was responsible for the phenotype observed following the loss of Lats1/2. To complete our studies, we employed a mouse model expressing a constitutively active human form of YAP in zG cells (Rosa26YAP5SA/+;AScre/+) which demonstrated that increased transcriptional activity of YAP alone is not sufficient to recapitulate the phenotype observed following the loss of Lats1/2 but induces adrenal gland hyperplasia. Together, these findings indicate an important role for the Hippo signaling pathway, particularly LATS1/2 kinases and YAP/TAZ effectors, in the differentiation of steroidogenic cells of the adrenal cortex and the maintenance of adrenal gland homeostasis in mice. These findings not only pave the way for further studies of this pathway in important adrenal gland pathologies, such as adrenal tumors, but also highlight the Hippo pathway as a potential target for therapeutic treatments of adrenal disorders.

L'utérus est un organe hautement dynamique, qui subit des changements morphologiques durant le cycle œstral sous l'influence des hormones sexuelles. Ces adaptations sont essentielles à l’homéostasie utérine et résultent d’une régulation minutieuse de la prolifération, de la différenciation et de la survie cellulaire par de nombreuses voies de signalisation. Nous avons émis l'hypothèse que la voie Hippo est impliquée dans l'homéostasie utérine chez l’espèce bovine, et nous avons tenté de déterminer les variations de ses constituants. Des biopsies de l'endomètre et des échantillons de sang ont été obtenus aux jours 0, 3 et 10 du cycle chez 14 vaches. Les concentrations sanguines de progestérone et d’œstrogène ont confirmé la progression du cycle œstral chez cinq vaches. Des analyses immunohistochimiques, Western Blot et RT-PCR ont été réalisées sur les biopsies afin d’évaluer la variation des composantes de la voie Hippo et de ses gènes cibles. Nous avons démontré la présence de YAP et de TAZ dans l'endomètre bovin à tous les moments du cycle œstral. Elles présentaient une expression cytoplasmique dans l'épithélium glandulaire, et présentaient une expression nucléaire dans le stroma à J0 et J10 et dans l'épithélium luminal à J3. Nous avons également noté une tendance à l'augmentation des concentrations de la forme phosphorylée de YAP au jour 3 du cycle œstral par rapport aux jours 0 et 10. Cette augmentation a été corrélée à une diminution de l'expression du gène CTGF au jour 3 par rapport aux autres jours du cycle œstral. En conclusion, nous avons démontré que la voie Hippo est exprimée différentiellement dans l'utérus bovin au cours du cycle œstral. / The uterus is a highly dynamic organ that changes morphologically under the influence of sexual hormones during the estrous cycle. These adaptations are essential for the proper function of the uterus and are due to the careful regulation of cell proliferation, differentiation, and apoptosis by numerous signaling pathways. We hypothesized that the Hippo pathway is implicated in uterine homeostasis in cattle, and we aimed to determine the variation of its canonical constituents during the bovine cycle. Endometrial biopsies and blood samples were obtained on days 0, 3, and 10 of the cycle in 14 cows. Progesterone and estrogens blood concentrations were measured and confirmed the status of the oestrus cycle in five cows. Immunohistochemistry, western blot, and RT-PCR were then performed on their endometrial biopsies to evaluate the Hippo components and targeted genes. Our results showed the presence of YAP and TAZ in the bovine endometrium at all time point. Both proteins displayed cytoplasmic expression in the glandular epithelium while exhibiting nuclear expression in the stroma on D0 and D10 and in the luminal epithelium on D3. We also noted a tendency for an increased amount of phosphorylated YAP during day 3 of the estrous cycle compared to days 0 and 10. It was correlated with a decreased expression of CTGF (Hippo target gene) on day 3 compared to the other day of the cycle. In conclusion, we can confirm that Hippo is differentially expressed in the bovine uterus during the estrous cycle.