Submitted by Liliane Ferreira (ljuvencia30@gmail.com) on 2018-09-06T11:19:09Z No. of bitstreams: 2 Tese - Danillo Fabrini Maciel Costa Veloso - 2018.pdf: 15996172 bytes, checksum: 30a5841de71ac68f55a18e1b917ed259 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-09-10T10:40:59Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Danillo Fabrini Maciel Costa Veloso - 2018.pdf: 15996172 bytes, checksum: 30a5841de71ac68f55a18e1b917ed259 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-10T10:40:59Z (GMT). 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By entrapping voriconazole into liposomes it is possible to circumvent its physico-chemical limitations, avoid the high toxicity of the antimicrobial, caused by sulfobutyl ether-betacyclodextrin, vehicle used to increase its solubility, present in its commercially available formulation: VFEND®. Pharmacokinetics and biodistribution of voriconazole modified by encapsulation in liposomes allowed its antifungal activity to be potentiated, leading to increased specificity and tissue penetration, protection the drug from biological degradation and reduced metabolism. Liposomes entrapping voriconazole (LVCZ) showed a particle size of 95.3 ± 1.27 nm, PdI of 0.09 ± 0.01, zeta potential near to neutrality, as well as a high efficiency of encapsulation of the antifungal and vesicles presenting spherical morphology uni and/or multilamellar. In vitro and in vivo evaluations of the performance of the liposomal formulation containing voriconazole were all performed in a comparative fashion with the commercially available formulation, VFEND®. In the in vitro assays using different species of fungal isolates of Candida and Aspergillus sp. the liposomal formulation was equivalent or superior to VFEND®. In a non-clinical pharmacokinetic assay in Balb/c mice, using a dose of 10 mg/kg, the main pharmacokinetic parameters were obtained: Cmax (μg/mL) = 1.23 ± 0.28 and 0.61 ± 0.15; AUC0-24 (μg/ml*h) = 4.86 ± 1.01 and 1.96 ± 0.30; Cl (mL/h) = 52.75 ± 8.88 and 100.91 ± 20.14; Vd (mL) = 230.18 ± 53.61 and 314.18 ± 106.24 for LVCZ and VFEND®, respectively. In all calculated/observed parameters, the liposomal formulation presented superior performance, using the same dose as the commercial formulation. Increases in antifungal concentrations found in blood, liver and kidneys and lower amounts of the inactive metabolite formed when using the liposomal formulation can be attributed to the ability of liposomes to alter the pharmacokinetics and biodistribution of voriconazole in the body mainly because of their capacity to protect the drug from accelerated metabolism. In vivo efficacy evaluation of voriconazole was also performed in a systemic candidiasis model in immunosuppressed animals, as well as parameters such as weight loss, fungal burden in the liver and kidneys and histological alterations caused by infection and treatment. As a consequence of voriconazole pharmacokinetics and biodistribution modified by the encapsulation in liposomes, the antifungal activity of drug was potentiated, leading to greater specificity and tissue penetration. In conclusion, in order to provide appropriate dose regimens for the treatment of systemic fungal infections, avoiding obstacles such as toxicity and resistance mechanisms we developed na alternative therapeutic platform, able to lead to safe and effective treatment. / O voriconazol, um triazólico de segunda geração de amplo espectro de ação, é um dos agentes antifúngicos sistêmicos mais recomendados como terapia de primeira linha contra vários patógenos fúngicos clinicamente importantes, dentre eles Candida albicans. Este antifúngico apresenta algumas desvantagens do ponto de vista tecno-farmacêutico: baixa solubilidade em água e perfil farmacocinético não-linear devido à saturação de depuração metabólica. Alem disso, sua formulação comercialmente disponível (VFEND®), utiliza um agente complexante, a sulfobutil éter-beta-ciclodextrina, para aumentar a solubilidade do voriconazol em água, porém esse agente apresenta consideráveis efeitos de toxicidade. Diante dessas limitações, encapsular o antifúngico em uma formulação lipossomal, que utiliza componentes biodegradáveis e biocompatíveis, os fosfolipídeos, é uma alternativa para aumentar a solubilidade do voriconazol em água, possibilitando o uso intravenoso. Além de contornar suas limitações físico-químicas, o uso de lipossomas permite eliminar o uso do veiculo tóxico presente na formulação comercial, além de possibilitar melhoras na farmacocinética e na distribuição tecidual do voriconazol. Os lipossomas contendo voriconazol (LVCZ) apresentaram tamanho de partícula de 95,3 ± 1,27 nm, índice de polidispersão de 0,09 ± 0,01, potencial zeta próximo da neutralidade, bem como uma elevada eficiência de encapsulação do antifúngico (aproximadamente 80%) e vesículas de morfologia esférica uni e/ou multilamelares. As avaliações in vitro e in vivo da performance da formulação lipossomal contendo voriconazol foram realizadas de forma comparativa com o VFEND®. Nos ensaios in vitro utilizando diferentes espécies de isolados fúngicos de Candida e Aspergillus sp. a formulação lipossomal se mostrou equivalente ou superior ao VFEND®. No estudo não-clínico de farmacocinética em camundongos Balb/c com dose de 10 mg/kg, foram obtidos os principais parâmetros farmacocinéticos: Cmax (μg/mL) = 1,23 ± 0,28 e 0,61 ± 0,15; AUC0-24 (μg/mL*h) = 4,86 ± 1,01 e 1,96 ± 0,30; Cl (mL/h) = 52,75 ± 8,88 e 100,91± 20,14; Vd (mL) = 230,18 ± 53,61 e 314,18 ± 106,24 para LVCZ e VFEND®, respectivamente. Em todos os parâmetros calculados/observados, a formulação lipossomal apresentou melhor desempenho, utilizando a mesma dose que a formulação comercial. Aumentos nas concentrações do antifúngico encontradas no sangue, fígado e nos rins e menores quantidades do metabólito inativo (voriconazol-N-óxido) formado, quando se utilizou a formulação lipossomal podem ser atribuídos à capacidade dos lipossomas de alterar a farmacocinética e biodistribuição do voriconazol no organismo, principalmente devido à sua capacidade de proteger o fármaco do metabolismo acelerado. A avaliação da eficácia in vivo do voriconazol também foi realizada em modelo de candidíase sistêmica em animais imunossuprimidos, assim como parâmetros como a perda de peso, a carga fúngica no fígado e rins e alterações histológicas provocadas pela infecção e pelo tratamento. Como consequência da farmacocinética e da biodistribuição de voriconazol modificadas devido à encapsulação do voriconazol em lipossomas, a atividade antifúngica do fármaco foi potencializada, levando a maior especificidade e penetração tecidual. Em conclusão, a fim de fornecer regimes de dose adequados para o tratamento de infecções fúngicas sistêmicas, evitando obstáculos, como mecanismos de resistência e alta toxicidade, desenvolvemos uma plataforma terapêutica alternativa, capaz de prover a um tratamento seguro e eficaz.

Objetivos: O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de um modelo farmacocinético/farmacodinâmico (PK/PD) para descrever o efeito antifúngico voriconazol (VRC) contra espécies de Candida. Método: Para alcançar este objetivo as seguintes etapas foram realizadas: i) foi adaptado e padronizado modelo de candidíase disseminada em ratos Wistar imunocompetentes e imunocomprometidos com Candida sp.; ii) foram validados métodos analíticos de LC-MS/MS e LC-UV para o doseamento do VRC em amostras de plasma e microdialisado de tecido; iii) foram estabelecidas as condições para microdiálise do VRC e as taxas de recuperação in vitro, por perda e ganho, e em tecido renal in vivo, por retrodiálise, foram determinadas; iv) foi avaliada a PK não-linear do VRC após administração i.v. bolus das doses de 2,5, 5 e 10 mg/kg e a biodisponibilidade oral foi determinada em roedores; v) a penetração renal do VRC após administração oral das doses de 40 e 60 mg/kg foi determinada em ratos Wistar sadios e infectados com C. albicans ou C. krusei; e (vi) o perfil fungistático do VRC contra C. albicans e C. krusei foi determinado utilizando modelo de infecção experimental in vitro onde foram simuladas as concentrações livres renais do VRC esperadas em humanos após administração oral e i.v. de diferentes posologias. Os dados de cinética e dinâmica obtidos foram modelados com equação de Emax modificada, com auxílio do Scientist®. Resultados e Conclusões: i) O modelo de candidíase disseminada foi adaptado com sucesso para ratos Wistar. C. albicans apresentou maior virulência com Log UFC/g de tecido renal de 5,51 ± 0,56 e 7,29 ± 0,26, após 2 e 7 dias de infecção em animais imunocompetentes, respectivamente. Em animais imunocomprometidos a contagem foi de 6,43 ± 0,59 Log UFC/g após 2 dias de infecção, com morte de todo o grupo dentro de 4 dias. As espécies não-albicans (C. krusei e C. glabrata) apresentaram um perfil de infecção semelhante em animais imunocompetentes (Log UFC/g = 2,98 ± 0,27 para C. krusei e 2,48 ± 0,46 para C. glabrata). Entretanto, nos animais imunocomprometidos, C. krusei promoveu morte de todo o grupo em até 7 dias, enquanto C. glabrata causou apenas um aumento no grau de infecção (Log UFC/g = 6,98 ± 0,48). ii) Os métodos analíticos por LC-UV e LCMS/ MS para quantificação do VRC foram validados. As curvas de calibração foram lineares na faixa de 50 a 2500 ng/mL (r > 0,98) para ambos os métodos. Os ensaios de precisão intra e inter-dia foram > 94,9 e 95,8 %, para microdialisado por HPLC-UV e > 87,5 e 92,3 % para LC-MS/MS em plasma, respectivamente. A exatidão foi > 89,1 % para HPLC-UV e > 88,4 % para LC-MS/MS. iii) A avaliação do VRC por microdiálise mostrou que a recuperação é concentração independente (0,1–2,0 μg/mL). O VRC entretanto, devido a sua moderada lipofilia, liga-se às tubulações do sistema de microdiálise, gerando diferenças entre a recuperação determinada pelo método de perda (retrodiálise) e de ganho (diálise) in vitro, as quais puderam ser corrigidas após o cálculo do coeficiente de ligação do fármaco ao sistema. A recuperação in vivo após correção da ligação ao sistema foi de 24,5 ± 2,8 % iv) A análise dos perfis de plasmáticos do VRC obtidos em ratos Wistar após administração oral mostrou comportamento não-linear, compatível com saturação de eliminação. A avaliação compartimental dos perfis i.v. de diferentes doses, utilizando modelo de três compartimentos com eliminação de Michaelis-Menten, permitiu a determinação da constante de Michaelis (KM) de 0,58 μg/mL e da velocidade máxima da eliminação (VM) de 2,63 μg/h, em média. A modelagem simultânea dos dados plasmáticos (40 mg/kg) e i.v. (10 mg/kg) permitiu a determinação da biodisponibilidade oral do VRC em ratos, que foi de 82,8%. v) A fração de penetração renal do VRC, determinada por microdiálise em ratos sadios e infectados, foi de 0,34 ± 0,01, similar a fração livre do fármaco no plasma (0,34), indicando que as concentrações livres renais de VRC são semelhantes às concentrações livres plasmáticas e que as mesmas não se modificam devido a infecções causadas por Candida sp. vi) Os parâmetros da modelagem PK/PD do efeito do VRC contra espécies de Candida em modelo de infecção experimental in vitro obtidos foram: CE50 de 2,96 μg/mL e Kmax = 0,26 h-1 para C. albicans e CE50 de 3,47 μg/mL e Kmax = 0,51 h-1 para C. krusei. Houve diferença estatística apenas no Kmax para as duas espécies (α = 0,05) indicando uma maior suscetibilidade da C. krusei ao VRC. O modelo PK/PD de Emax modificado utilizado foi capaz de descrever adequadamente os perfis de inibição do crescimento de Candida sp em função do tempo, para todos os regimes terapêuticos do VRC avaliados, podendo ser usado para otimização da terapia com esse fármaco. / Objectives: The aim of this work was the development of a pharmacokineticpharmacodynamic model (PK/PD) to describe the fungistatic effect of voriconazole (VRC) against Candida species. Method: To reach this objective, the following steps were done: i) a disseminated candidiasis model to immunocompetent and immunocompromised Wistar rats with Candida sp was adapted and standardized; ii) analytical methods of LC-MS/MS and LC-UV for measurement of VRC in plasma and microdialysate tissue samples were validated; iii) microdialysis conditions of VRC and the recoveries rate in vitro, by loss and gain, in renal tissue in vivo, by retrodialysis, were determined; iv) the non-linear PK of VRC after i.v. bolus administration of 2.5, 5 e 10 mg/kg doses were evaluated and the oral bioavailability in rodents was estimated; v) tissue penetration of VRC after oral administration of 40 and 60 mg/kg was determined in healthy and infected by C. albicans or C. krusei Wistar male rats; vi) the fungistatic profile of VRC against C. albicans and C. krusei was determined using a experimental infection model in vitro, where the free renal concentrations of VRC expected in humans after oral and iv administration of different dosing regimens were simulated. The kinetic and dynamic data obtained were modeled using an Emax modified model, with aid of Scientist®. Results and Conclusions: i) The disseminated candidiasis model was successfully adapted to Wistar rats. C. albicans showing high virulence with Log CFU/g of renal tissue of 5.51 ± 0.56 and 7.29 ± 0.26, after 2 and 7 days of infection in immunocompetent animals, respectively. In immunocompromised animals, the counting was 6.43 ± 0.59 Log CFU/g after 2 days of infection, with whole group death within 4 days. Non-albicans especies (C. krusei e C. glabrata) showed a similar infection profile in immunocompetent and immunocompromised animals (Log CFU/g = 2.98 ± 0.27 to C. krusei e 2.48 ± 0.46 to C. glabrata). However, in immunocompromised animals, C. krusei causes death in the whole group up to 7 days, instead, C. glabrata causes only a low increase in the infection degree (Log CFU/g = 6.98 ± 0.48). ii) The analytical methods of HPLC-UV and LC-MS/MS to VRC quantification were validated. Linearity was between 50 - 2500 range ng/mL (r > 0.98) for both methods. The intra and inter-day precision assays were > 94.9 e 95.8 %, for microdialysate using LC-UV and > 87.5 e 92.3 % using LCxx MS/MS for plasma, respectively. The accuracy was > 89.1 % for HPLC-UV and > 88.4 % for LC-MS/MS. iii) The evaluation of VRC by microdialysis showed that recovery is concentration independent (0.1–2 μg/mL). VRC, however, due to its moderate lipophilic characteristic, binds to the microdialysis system tubing’s, generating differences between recoveries determined by loss (retrodialysis) and gain (dialysis) in vitro methods, which could be corrected after determination of drug’s binding coefficient to the system. The in vivo recovery determined after correction of system binding was 24.5 ± 2.8 %. iv) VRC plasma profiles analysis obtained from Wistar rats after oral administration showed a nonlinear behavior, compatible with saturable elimination. The compartmental evaluation of i.v. profiles in different doses, employing the a compartment model with Michaelis-Menten elimination, allowed to determine the Michaelis-Menten constant (KM) of 0.58 μg/mL and the maximum velocity (VM) of 2.63 μg/h, in average. The simultaneous modeling of oral (40 mg/kg) and iv (10 mg/kg) plasma data allowed the determination of the oral bioavailability of VRC in rats, equal to 82.8%. v) The VRC renal penetration fraction, determined by microdialysis in healthy and infected rats, was 0.34 ± 0.01, similar to the free unbound fraction in plasma (0.34), showing that VRC free renal concentration levels are similar to the unbound plasma concentrations and that did not change due the infection associated to Candida sp. vi) The parameters of PK-PD modeling of VRC effect against Candida species in the in vitro experimental infection model obtained were: EC50 de 2.97 μg/mL and Kmax = 0.203 h−1 to C. albicans and EC50 of 3.47 μg/mL and Kmax = 0.51 h−1 to C. krusei. There is a statistical difference only in Kmax value for the two species (α = 0.05), showing a higher susceptibility of C. krusei to VRC. The PK/PD Emax modified model employed was able to describe adequately the growth inhibition profiles of Candida sp in function of time, for all VRC dosing regimens evaluated, and can be used for therapy optimization with this drug.

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